Введение к работе
Актуальность темы. Рибофлавин (витамин В2) функционирует в клетках в коферментных формах, представляющих собой его фосфорные эфиры: флавинмононуклеотвд (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Эти вещества являются обязательными участниками многих окислительно-восстановительных реакций. В отличие от растений и большинства микроорганизмов, рибофлавин, в животных клетках не синтезируется: Этим и объясняется широкое применение флавинов в пищевой промышленности и в медицине. Учитывая важность перечисленных выше соединений, были разработаны промышленные технологии получения рибофлавина с использованием микроорганизмов. Основными микроорганизмами, используемыми для биосинтеза рибофлавина, являются: актиномицеты Ashbya gossypii и E.aslibyii, некоторые дрожжи Saccharomyces cerevkiae и Pichia guilliermondii, и Bacillus sublilis.
В генетическом и биохимическом отношении биосинтез рибофлавина лучше всего изучен у B.subiilis (Миронов В. и соавт. 1990, Perkins, J. 1993). Рибофлавиновый оперон B.subtilis представляет собой группу из пяти неперекрывающихся структурных генов, расположенных на 209 генетической карты, транскрибируемых и регулируемых совместно. Экспрессия оперона негативно регулируется продуктом гена ribC, расположенным на 147 генетической карты, кодирующим' предположительно апорепрессор. Эффекторами регуляции являются рибофлавин, ФМН и ФАД. В регуляции транскрипции участвует операторная область, которая находится между промотором и первым структурным геном оперона. Однако, механизм регуляции транскрипции оперона пока не известен.
B.amyloliquefaciens считается близким родственником B.subiilis. Известно, что штаммы B.amyloliquefaciens являются хорошими продуцентами пуринов. Следовательно, использование данной бактерии может быть перспективно в целях создания штаммов продуцентов рибофлавина. К началу работы практически ничего не было известно о биосинтезе рибофлавина у B.amyloliquefaciens, кроме того что гены биосинтеза также тесно сцеплены на хромосоме, как и у B.subtilis, что позволяет предположить существование оперона (Jdmantas,-J.-1991).
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение биосинтеза рибофлавина у бацилл. Для осуществления поставленной цели были решены следующие задачи:
-
Клонирование генов биосинтеза рибофлавина B.amyloliquefaciens и определение их нуклеотидной последовательности; ,
-
Изучение экспрессии данных генов в клетках B.sublilis.
3. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности
гена ribC B.subtilis.
4. Определение ферментативной активности продукта гена ribC.
Научная новизна и практическая значимость. Клонированы гены
биосинтеза рибофлавина Bximylolique/aciens, а также ген ribC B.subtilis. Определена нуклеотидная последовательность данных генов. Обнаружено, что структура и организация генов биосинтеза рибофлавина у B.amyloliquefaciens и B.sublilis практически полностью совпадает. Установлено, что рибофлавиновый оперон- В.amyloliquefaciens узнается регуляторнои системой B.subtilis. Обнаружены две операторные мутации В.amyloliquefaciens, приводящие к конститутивному синтезу рибофлавина, расположенные в той же консервативной области, что и рггуляторные мутации B.subtilis. В результате изучения экспрессии генов рибофлавинового оперона В.amyloliquefaciens в различных штаммах B.subtilis, установлено, что продукт гена ribC способен регулировать экспрессию биосинтетических генов обоих оперонов. После определения нуклеотидной последовательности гена ribC, оказалось, что белок кодируемый данным геном имеет значительную гомологию с рибофлавин-киназной/ФАД-синтазной Corynebacterium ammoniagenes и E.coli. Показано, что продукт rem'ribC действительно обладает рибофлавин-киназной/ФАД-синтазной активностью.
Структура работы. Диссертация изложена на J 03 стр машинописного текста, включая 15 рисунков и 7 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей условия проведения экспериментов, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы (106 наименований).