Введение к работе
Актуальность проблемы. Основная функция систем рестрикции-модификации (Р-М) ДНК II типа, компонентами которых являются эндонуклеазы рестрикции (ЭР) и модифицирующие ДНК-метилтрансферазы (МТЛ), сводится, как принято считать, к защите бактериальной клетки-хозяина от проникновения чужеродной ДНК. Кроме того, имеются данные о том, что эндонуклеазы рестрикции принимают участие в рекомбинационном процессе in vivo. Показано, что ферменты рестрикции и метилирования могут оказывать влияние на такие важнейшие клеточные процессы, как репликация, транскрипция, транспозиция, ускорять мутационный процесс.
Эндонуклеазы рестрикции, а в некоторых случаях и ДНК-метилтрансферазы, широко применяют для получения рекомбинантных ДНК, проведения генетических и молекулярно-биологических исследований, в том числе исследований в области биомедицинской химии и сельскохозяйственной биотехнологии. Это определяет актуальность прикладного аспекта изучения систем рестрикции-модификации, заключающегося в широкомасштабном поиске новых природных продуцентов эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз, получении высокоэффективных продуцентов ферментов генно-инженерного комплекса на основе клонирования генов эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз и разработке схем выделения высокоочищенных и стабильных ферментных препаратов.
Высокая специфичность ДНК-белкового связывания, определяемого ЭР и МТЛ. и огромное разнообразие последовательностей, узнаваемых ими в ДНК, делает актуальным исследование на основе этих ферментов специфического ДНК-белкового взаимодействия с использованием разнообразных биохимических, молекулярно-биологических и физико-химических подходов, а также рентгеноструктурного анализа ДНК-бедковых комплексов.
Необходимо также отметить медико-экологический аспект изучения систем рестрикции-модификации ДНК. Эти системы широко распространены в штаммах бактерий, естественной средой обитания которых является организм человека и животных. Многие из этих штаммов патогенны. Лечение заболеваний с помощью антибиотиков затрудняется тем, что среди бактерий легко происходит перенос плазмид, определяющих множественную лекарственную резистентность. Присутствие систем рестрикции-модификации, с одной стороны, предоставляет преимущество несущим их клеткам бактерий, придавая им повышенную устойчивость к инфекции бактериофагами. С другой стороны, системы рестрикции-модификации способны
ограничивать перенос факторов множественной лекарственной резистентности. Поэтому локализация генетических детерминант систем рестрикции-модификации и изучение способов их распространения в природных сообществах микроорганизмов имеют самостоятельное значение.
Присутствие в системе рестрикции-модификации рестрицирующего компонента делает систему рестрикции-модификации потенциально опасной для содержащей ее клетки из-за возможности фрагментирования клеточной ДНК в условиях дефицита метилтрансферазной активности. Это определяет актуальность проведения комплексных исследований систем рестрикции-модификации ДНК, включающих в себя, наряду с характеристикой отдельных компонентов системы, выявление специфических механизмов регуляции, обеспечивающих возможность существования и функционирования системы рестрикции-модификации ДНК в клетке бактерии.
В настоящей диссертационной работе на примере изучения структурно-функциональных особенностей систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnet 47 осуществлено комплексное исследование систем Р-М, включающее в себя характеристику природного штамма-продуцента, получение непатогенных и высокоэффективных продуцентов рекомбинантных ферментов, изучение генетической организации систем рестрикции-модификации и особенностей регуляции экспрессии генов, а также фундаментальные исследования специфического взаимодействия эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз с ДНК.
Объекты исследования, цель ы задачи работы. Системы рестрикции-модификации Ssol и SsoU штамма Shigella sonnei 47 были выбраны в качестве объектов исследования по нескольким причинам. Система Р-М Ssol представляла особый интерес для проведения сравнительных биохимических и молекулярно-биологических исследований с родственной ей, одной из наиболее хорошо охарактеризованных систем Р-М, системой ЕсоШ. Проведение такого рода сравнительных исследований казалось особенно важным в свете данных, полученных при сравнении систем ЕсоЮ. и Rsrl, позволивших пересмотреть интерпретацию рентгеноструктурного анализа комплекса эндонуклеазы рестрикции ЕсоШ (R.coRI) с ДНК и существенно дополнить имеющиеся представления об организации, функционировании и возможных путях эволюции систем рестрикции-модификации. Система Р-М SsoU представляла собой наиболее интересный объект для проведения фундаментальных исследований. ЭР и МТЛ SsoR имеют участок узнавания (5'-CCNGG-3'), полностью вырожденный по центральной нуклеотидной паре. Это делает его похожим на участки узнавания многих
других ферментов и открывает широкие возможности для характеристики механизмов специфического ДНК-белкового взаимодействия на основе сравнительного анализа с близкими системами Р-М. При исследовании генетической организации системы Р-М XsoII были выявлены особенности, позволившие предположить наличие у этой системы специфического механизма регуляции активности генов, что в последующем было подтверждено экспериментально и исследовано. За последний год появились сведения о генетической организации еще двух систем Р-М, ферменты которых узнают последовательность 5'-CC\'GG-3" (Miyahara et al., 1997; Ibanez et al., 1997). Генетическая организация этих двух систем практически идентична организации системы SsoII, за исключением того, что в случае одной из них ген эндонуклеазы рестрикции содержит делецию и продукт этого гена неактивен (Ibanez et al., 1997). Высокий интерес исследователей к системам такого рода подтверждает актуальность выбора системы Р-М SsoII в качестве объекта исследований.
Цель работы заключалась в осуществлении комплексного исследования систем Р-М ДНК у бактерий на примере систем рестрикции-модификации штамма S. sonnei 47.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1. Фенотнпически охарактеризовать штамм S. sonnei 47, природный продуцент ферментов Ssol и Ssoll, ті плазмидную систему штамма. Идентифицировать генетические детерминанты систем Р-М Ssol и Ssoll.
-
Клонировать гены ферментов Ssol и Ssoll и определить нуклеотидные последовательности генов. Охарактеризовать генетическую организацию систем рестрикции-модификации Ssol и Ssoll.
-
Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей всех известных к настоящему времени систем Р-М и аминокислотных последовательностей ЭР и МТЛ с целью выявления родственных систем Р-М и разработки последующей стратегии исследования систем Р-М Ssol и SsoII.
-
Сконструировать непатогенные и суперпродуцирующие штаммы ферментов па основе рекомбпнаитных плазмид, трансформированных в Е. coli, и разработать схемы выделения высокоактивных гомогенных препаратов ферментов, необходимых для проведения фундаментальных исследований специфического взаимодействия ЭР и МТЛ с ДНК.
-
Исследовать особенности взаимодействия ЭР и МТЛ с синтетическими ДНК-дуплексами, несущими узнаваемую последовательность 5'-CCNGG-3', в которых
модифицированы или удалены отдельные структурные элементы центральной иуклеотидной пары.
6. Изучить особенности регуляции экспрессии генов в системе Р-М SsoU.
7. Исследовать особенности ДНК-белковых взаимодействий, обусловленных
регуляторным N-концевым доменом метилтрансферазы SsoU (М.&ОІІ).
Идентифицировать остатки ДНК, которые могут образовывать контакты с этим
доменом белка в ДНК-белковом комплексе метилтрансферазы SsoU.
8. На основе экспериментальных данных и компьютерного анализа разработать
и теоретически обосновать модель ДНК-белковых контактов в комплексе MSsoU с
ДНК.
9. Обобщить собственные экспериментальные данные и результаты
исследования других систем Р-М для выявления общих закономерностей
функционирования систем рестрикции-модификации ДНК и регуляции активности
генов в этих системах.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Генетические детерминанты систем рестрикции-модификации Ssol и SsoU имеют плазмидную локализацию, что определяет широкую распространенность Ssol- и SjoII-подобных систем среди представителей сем. Enterobacteriaceae.
1. Метилтрансфераза SsoU представляет собой бифункциональный белок, помимо метилирования последовательности 5'-CCNGG-3', осуществляющий регуляцию экспрессии генов в системе рестрикции-модификации SsoU. Выявлен ряд других 5-метилцитозиновых ДНК-метилтрансфераз, имеющих структурную гомологию с M.Ssoll, с высокой вероятностью также способных выполнять регуляторную функцию.
3. Контакты между остатками ДНК и белка в комплексе метилтрансферазы SsoU
с регуляторным участком ДНК, расположенным в межгенной области системы
рестрикции-модификации SsoU, осуществляются в соответствии с предложенной схемой.
Охарактеризована роль отдельных структурных элементов центральной иуклеотидной
пары участка узнавания 5'-CCNGG-3' во взаимодействии метилтрансферазы и
эндонуклеазы рестрикции SsoU с ДНК.
4. Регуляция, основанная на специфическом взаимодействии ДНК-
метилтрансфераз с собственной промоторной областью, представляет собой новый
способ регуляции экспрессии генов, характерный для многих систем рестрикции-
модификации ДНК.
Научная новизна работы. В настоящей работе осуществлено комплексное исследование двух систем рестрикции-модификации ДНК. В процессе выполнения исследования получен ряд научных результатов, сформулировано несколько предположений, выводов и обобщений, имеющих приоритетное значение:
-
Впервые осуществлена характеристика уникального плазмидного комплекса штамма S. sonnei 47, состоящего из 10 плазмид различного молекулярного веса. Локализованы плазмиды, определяющие системы Р-М Ssol и Ssoll, устойчивость к стрептомицину, колициногенность и иммунность к колицину Е1, а также копыогативпость (Каряппга и др., 1989; Karyagina et al., 1990).
-
Впервые охарактеризованы генетические детерминанты систем рестрикции-модификации Ssol и Ssoll (Karyagina et al., 1993). Установлена практически полная идентичность генетической организации систем Р-М Ssol и ЕсоШ. Осуществлен сравнительный анализ генов ЭР и МТЛ Ssoll с генами других ЭР и МТЛ.
-
В процессе исследования взаимодействия ферментов Ssoll с синтетическими аналогами субстратов, модифицированными по центральной нуклеотидной паре, впервые обнаружено появление нового места гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции при введении ряда модификаций в участок узнавания (Кубарева и др., 1992; Kubareva et al., 1992).
-
Исследована регуляция экспрессии генов в системе Р-М Ssoll, опосредованная M.SsoII (Karyagina et al., 1997). В M.SsoII и ряде других МТЛ с высокой вероятностью предсказано существование типичного для регуляторных белков модуля "спираль-поворот-спираль", по-видимому, вовлеченного во взаимодействие с ДНК в процессе связывания M.S'soII с собственной промоторной областью. На основании экспериментальных данных и теоретических расчетов предложена модель взаимодействия MJSsoU с ДНК.
-
Высказано и обосновано предположение о том, что регуляция экспрессии генов, основанная на взаимодействии метилтрансферазы с собственной промоторной областью, представляет собой новый способ регуляции экспрессии гепов в системах Р-М (Karyagina et al., 1997). Предложена модель "маятниковой" регуляции, основанная на колебании уровня синтеза метилтрансферазы в клетке.
-
Показано, что для MSsoll характерно одновременное присутствие двух ДНК-связывающих доменов - одного, типичного для всего класса этих белков, расположенпого в вариабельном участке и ответственного за взаимодействие со специфической последовательностью 5'-CCNGG-3', и второго, локализующегося в N-
концевой части M.&oII и обеспечивающего взаимодействие с межгенной регуляторной областью системы Р-М SsoR (Karyagina et al., 1997).
При вьшолнении исследования были разработаны оригинальные подходы, применимые для исследования других систем Р-М и ДНК-связывающих белков:
разработан новый метод количественной оценки ферментативной активности метилтрансфераз in vivo, заключающийся в выделении препаратов плазмидной ДНК из клеток штаммов до и после индукции в стандартных условиях, проведении гидролиза эндонуклеазой рестрикции и анализе продуктов гидролиза в агарозном геле с последующей денситометрией (Karyagina et al., 1995).
разработан новый подход для расчета констант диссоциации ДНК-белковых комплексов, основанный на графической интерпретации результатов неспецифического вытеснения ДНК из ДНК-белкового комплекса с известной константой диссоциации.
Научно-практическое значение работы. В результате раздельной трансформации плазмид S. sonnei 47 в клетки Е. coli и клонирования генов ферментов i&oU получены непатогенные продуценты R.SroI и MSsol, R.&0II и М.і&оП и только М.&оН. Штаммы несут лишь одну систему Р-М, что автоматически снимает вопрос о необходимости разделения интерферирующих ферментных активностей в процессе выделения ферментов. Уровень продукции ферментов в штаммах Е. coli B834/d24 и /d33 в 10 раз превышает уровень продукции, обеспечиваемый S. sonnei 47. На штаммы Е. coli B834/d24 и Е. coli B834/d33, а также рекомбинантные плазмиды d24 и d33 получены авторские свидетельства на изобретение (Дебов и др., 1989 а и б).
Разработан новый метод выделения гомогенного препарата R.SjoII с использованием колоночной хроматографии на основе современных сорбентов, исключающий стадии промежуточного диализа (Карягина и др., 1993). Метод может быть адаптирован для выделения аналогичных ферментов.
Сконструированы суперпродуцирующие штаммы R.SsoII, М.&ОІІ и MJVfaX, основанные на рекомбинантных плазмидах с индуцибсльными промоторами, трансформированных в Е. coli. Продукция M.&oII составляет 1,5%, R.&oII - 20% и ММаХ. - 67% от суммарного белка клетки (Karyagina et al., 1995). Продукция R.S$oII и М.&ОІІ, обеспечиваемая этими штаммами в тысячи и десятки тысяч раз превышает уровень продукции исходного штамма S. sonnei 47. Разработаны и оптимизированы схемы индукции и препаративного выделения ферментов (Karyagina et al., 1995). Степепь очистки препаратов ферментов составляет 90-98%, концентрация белка - более
1 мг/мл, активность - более 50 ед./мкл, что позволяет проводить на их основе биохимические и физико-химические исследования.
Личный вклад автора. В цикле исследований, включенных в диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения молекулярно-биологических, биохимических и физико-химических экспериментов до обсуждения и литературпого оформления полученных результатов.
Апробация диссертации и публикации.
По материалам диссертации опубликовано 30 работ.
Результаты работы были доложены на Всесоюзном совещании "Гибридные плазмиды и экспрессия плазмидных генов" (Пушино-на-Оке, 1984), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино-на-Оке, 1986), на международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: прогресс и границы практического использования" (Москва, 1991), на конференции FASEB "Эндоиуклеазы рестрикции и модифицирующие мстилтрансферазы: структура и механизм" (Сакстонс-Ривер, Вермонт, США, 1993). на XVI международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индїи, 1994), на 3-ей конференции IUBMB "Молекулярное узнавание" (Сингапур, 1995), на XI международной конференции по применению компьютеров в химических исследованиях и обучении (Париж, Франция, 1995), на международной конференции по молекулярной структурной биологии (Вена, Австрия, 1995), на конференции FASEB "Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты" (Сакстонс-Ривер, Вермонт, США, 1996), на 3-е.м н 4-ом рабочем совещании New England Biolabs по биологической модификации ДНК (Вильнюс, Литва, 1994; Инсбрук-Игле, Австрия, 1997).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа, общим объемом 331 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, вьшодов и библиографического указателя (337 источников), содержит 19 таблиц и 44 рисунка.