Введение к работе
Актуальность проблемы. Семейство Adenoviridae включает около ста видов аденовирусов, которые поражают широкий спектр хозяев: от человека до рыб, В этот список также попадают важные сельскохозяйственные'объекта: крупний рогатый скот, овцы, птици (куры и утки). Аденовирусы вызывают тяжелые заболевания глаз, дыхательных органов и пищеварительного тракта у человека и животных. Особенно опасна аденовирусная инфекция для детей и молодняка у * животных. У птиц аденовирусы резко сни;хагат продукцию яиц.
Аденовирусы способны вызывать неопластическую трансформацию культуры клеток in vitro , а некоторые из них индуцируют злокачественные новообразования у лабораторных животных. Поэтому изучение последовательности событий, приводящих к такому взаимодействию вируса и клетки, приближает нас к расшифровке проблем вирусного онкогенеза.
Аденовирусы представляют собой хороший инструмент для изучения процессов хранения и экспрессии генетической информации в эукариотической клетке, так как синтез аденовирусных компонентов осуществляется, в основном, с использованием клеточного биосинтетического аппарата. Для иллюстрации этого тезиса достаточно вспомнить, что сплайсинг РНК в эукариотической клетке был впервые открыт при изучении экспрессии генов аденовирусов. Учитывая постоянно растущую информацию о структурно-функциональной организации 'генома аденовирусов и быстрое совершенствование методов генной инженерии, можно ожидать, что представители этого семейства виру сов' будут одними из первых кандидатов на роль векторов, с помощью которых можно будет вводить чужеродную генетическую информацию не только в культуру клеток, но и в целый организм.
Рекомбинантные аденовирусы, созданные in vitro и содержащие экзогенную генетическую информацию, могут быть использованы для решения широкого спектра задач. В яастности, для клоицроваи'* и амплификации фрагментов ДНК различного происхождения в клотках человека и животных, для исследования особенностей экспрессии отдельных генов (иди их групп) как вирусного, так и клеточного происхождения, для решения ряда биотехнологических задач. В этом случае рекомбинантные аденовирусы могут быть с успехом использованы для іаработки в культуре клеток белков, функциональная активность' которых определяется правильностью посттрансляционной модификации
исходного полипептида в процессе его синтеза в эукариотической клетке. Весьма перспективны исследования по конструированию ре-комбинантных аденовирусов на основе иевирулентных и слабовиру-лентшіх штаммов для получения генно-инженерных вакцин против различных возбудителей инфекционных болезней человека и животных.
Все вышеизложенное обусловливает актуальность изучения структурно-функциональной организации аденовирусов человека и животных и разработки методов получения рекомбинантных аденовирусов и создания на их основе многоцелевых эукариотических векторов.
Цель и задачи доследования. В процессе диссертационной рабой предстояло решить следующие основные задачи:
1. Изучить структурную организацию ДіІК аденовирусов живот
ных и птиц и выявить общие закономерности топографии генома аде
новирусов человека и животных. -
Для этого необходимо было предварительно отработать универсальные и хорошо воспроизводимые методы физического картирования ранее не изучавшихся ДНК аденовирусов и клонирования концевых фрагментов аденовирусного генома.
-
Охарактеризовать комплекс ДНК-терминальный белок аденовирусов человека и животных, определить особенности взаимодействия ДНК - ЇБ с пермиссивними и непермиссивнымн клетками, а такзе изучить возмокностъ экспрессии и репликации ДНК и ДНК - ТБ в овоцитах X.Laevis и в системе in vitro , полученной из' экстрактов ядер зараженных клеток.
-
Локализовать онкогены в ДНК изучаемых аденовирусов. Определить минимальный фрагмент ДНК, способный трансформировать первичные клетки грызунов. Выявить возможные закономерности взаимодействия ДНК аденовирусов и клеточного генома в линиях клеток, трансформированных изучаемыми вирусами.
-
Разработать новый методический подход для введения линейных высокомолекулярных ДНК в эукариотические клетки с помощью протеолипосом.
-
Отработать универсальный способ получения рекомбинантных аденовирусов, содержащих экзогенную ДНК, в условиях селективного отбора рекомбинантных вирусных популяций. Селективный отбор гибридных Ад долден осуществляться за счет введения в ДНК Ад после-
цовательноста генома Ад-0О40 гибрида, кодирующего Т-антиген Ш40.
Научная новизна и практическая ценность. В результате прове-ценного исследования впервые получены данные о структурно-функцио-шльной организации ДНК и комплекса ДНК - терминальный белок аде-ювпрусов животных (s-16, S-8H, 3-5, BAV2, EDS), а также впервые )характерязован геном аденовируса человека типа 6 и I. Выявлены эбщие принципы в организации генома аденовирусов человека, животных и птиц. Сформулировано положение о генном тигшровашш изолятов іденовирусов (основанном на рестрикщюнном анализе ДНК этих виру-!ов) в качестве альтернативного метода идентификации и классификация аденовирусов.
Предложен универсальный,метод получения популяции рекоиби-гантных аденовирусов на основе ДНК аденовируса человека, содержали экспрессируемую гетерологическуго ДНК (в нашей работе геном ви->уса гепатита В) и участок ДНК вируса 0В40. Фрагмент генома 0В40, поточенный в рекомбинант, позволяет селективно отбирать популяцші ибридных аденовирусов в процессе их пассирования на клетках обе-ьяны.
Впервые изучены физико-химические свойства терминальных белов аденовирусов животных и показана высокая степень консерватив-ости в структуре ТБ аденовирусов человека и животных. Получены риоритетные данные о биологических свойствах комплекса ДНК - ТБ. оказано, что онкогены аденовирусов неспособны реализовать транс-ормирущие потенции в составе комплекса ДНК - ТБ, выделенного из чищенной вирусной суспензии.
Впервые показано, что комплекс ДНК - ТБ аденовирусов человеїи обезьяны транскрибируется (по крайней мере, ранние гены) А репли-ируется в овоцитах X.Laevia.
Получены новые данные о возможности высокоэффективного перэ-эса интактной ДНК аденовируса в клетки с использованием липосом. эторие связаны с гликопротеидом (ГА) вируса гриппа (протеолішосо'яД,
Сконструирована модель недефектного вектора для зукаряотиче-ких клеток на основе рекомбинанта между ДНК Н-І и Н-5 с делецией э "несущественной" области с координатами 75,5 - 83,4 %.
Работа носит теоретический характер. Методы и выводы работа згут быть использованы в лабораторных исследованиях, а также для азработки новых способов диагностики аденовирусной инфекции.
Способ создания рекомбинантных аденовирусов колет бчть ясполь-
_ і -
зован для накопления в культуре эукариотических клеток различных биологически активних белков, в том числе и препаратов для диагностики и профілактики вирусной инфекции.
Разработанная технология полупроизводетвенпого получения спе-цифічесішх эцдопуклеаз бияа внедрена в лабораторное производство па базе Московского ЦШШС им. И.И.Мечникова.
Апробалия работи. Материалы диссертации доклада вались на всесоюзних конференциях по генной иняенерии и биотехнологии в г.їїущино (I98Q и 1982 гг.), на всесоюзных рабочих совещаниях по молекулярной биологии ДНК-содеркащих вирусов, имеющих практическое значение дог сельского хозяйства и медицины в г. Киеве (1984 п 1987 гг.), на ІУ Всесоюзной конференции по методам получения и 'анализа биохимических препаратов в г. Риге (1982 г.), на П-м двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ по проблеме структури и функции ге- нома в г.Баку (1977 г.), на международном симпозиуме "Молекулярная биология вирусов и генная инженерия", г.і.іосква (1983 г.). Апробация диссертации проведена на заседании Совета предварительной экспертизы по молекулярной биологии Института вирусологии AMI СССР и кд семинаре отдела генной иняенерии ВНШ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.
Структура и объем диссертации, диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, в которых описываются и обсуждаются результаты собственных исследовании, общего заключеішя и выводов. Работа изложена на 394 страницах машинописного текста и документирована 74 рисунками и 23 таблицами. Список цитируемой литературы включает 456 работ отечественных и зарубежных авторов.