Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот Макарова Алена Владимировна

Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот
<
Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Макарова Алена Владимировна. Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 / Макарова Алена Владимировна; [Место защиты: Гос. науч.-исслед. ин-т генетики и селекции промышленных микроорганизмов].- Москва, 2009.- 139 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/1351

Введение к работе

Актуальность проблемы. ДНК живых организмов повреждается под действием разнообразных эндогенных и экзогенных факторов. Эти модификации ДНК вызывают мутации, остановку репликации, гибель клеток, играя важную роль в онкогенезе, старении и других патологических процессах. В конце XX в. были открыты специализированные ДНК-полимеразы, основной функцией которых является участие в репликации и репарации поврежденной ДНК. Однако из-за открытого каталитического центра, приспособленного к синтезу на матрице с поврежденными основаниями, специализированные ДНК-полимеразы часто ошибаются па неповрежденной матрице. Такие полимеразы, подавляющее большинство которых относится к Y-семейству ДНК-полимераз, были названы склонными к ошибкам. Их участие в репликации строго регулируется.

Изучение биохимических свойств и особенностей регуляции активности специализированных ДНК-полимераз относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. Нормальное функционирование этих ферментов в клетках препятствует процессам мутагенеза и канцерогенеза. Большинство из склонных к ошибкам ДНК-полимераз эукариот остаются не достаточно изучены. К их числу относится ДНК-полимераза йота (Рої і), открытая в 2000 г [Tissier A. et. al., 2000; Zhang Y. et. al., 2000].

Pol і человека является самой неточной ДНК-полимеразой из всех известных и характеризуется необычными свойствами in vitro благодаря особому строению активного центра фермента [Johnson R.E. et. al., 2006]. В тоже время, фермент дрозофилы по свойствам почти ничем не отличается от своего паралога ДНК-полимеразы эта (Pol г|) и не демонстрирует такой высокой склонности к ошибкам [Ishikawa I. et. al., 2001].

Имеются многочисленные литературные данные о связи нарушения регуляции активности Рої і с развитием злокачественных новообразований у человека и мыши. Однако, функции Рої і остаются не известны. Данные об экспрессии этого фермента в организме животных малочисленны. Не изучен филогенез Рої і и свойства фермента у позвоночных животных разных таксономических групп. Ограничен круг модельных объектов для изучения Рої і.

Биохимической активности специализированных ДНК-полимераз посвящено большое количество работ, однако предметом изучения большинства из них являлись очищенные рекомбинантные ферменты in vitro. Решающая роль в регуляции активности склонных к ошибкам ДНК-полимераз в организме принадлежит посттрансляционному уровню регуляции. В связи с чем актуальной задачей является поиск методов, позволяющих

изучать специализированные ДНК-полимеразы в условиях, приближенных к реальному биохимическому окружению в клетках. Одним из таких подходов может являться тестирование биохимической активности ДИК-полимераз в экстрактах клеток, содержащих суммарный набор ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Уникальная способность Рої і встраивать преимущественно дГТФ напротив тимина матрицы («дГТФ-Т» активность) может давать возможность специфичного определения продуктов реакции этой ДНК-полимеразы [Генинг Л.В. с соавт., 2004].

Изучение активности и биохимических свойств Рої і в экстрактах клеток эукариот является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе поддержания стабильности генома, механизмов канцерогенеза и старения.

Цель настоящей работы заключалась в изучении активности склонной к ошибкам Pol \ в экстрактах клеток эукариот. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

провести оценку биохимической активности рекомбинантной Рої і человека в экстрактах клеток Saccharomyces cerevisiae;

охарактеризовать «дГТФ-Т» активность Рої і в органах и тканях инбредных линий домовой мыши (Mus musculus) с аллелью Рої і дикого типа и дефектами гена Рої і;

провести сравнительный филогенетический анализ Рої і и исследовать «дГТФ-Т» активность в организме позвоночных животных разных таксонов;

определить влияние ряда эволюционно полиморфных и консервативных замен аминокислот, а также делеций на биохимическую активность Рої і человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведено исследование склонной к ошибкам Рої і с применением методики тестирования активности ДНК-полимеразы непосредственно в экстрактах клеток эукариот. Впервые охарактеризована активность Pol \ в организме М. musculus. В работе показано отсутствие активности Рої і у мышей линии 129/J, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена POLL Установлено, что в организме мышей линии 129Я мРНК Рої і претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако образующийся в ходе трансляции укороченный фермент не обладает ДНК-полимеразной активностью. Работа представляет собой первое филогенетическое исследование Pol \ позвоночных животных. Обнаружено, что активность Pol \ по встраиванию dGTP напротив Т матрицы обнаруживается в организме млекопитающих, но отсутствует у других классов

позвоночных животных. Установлена связь между появлением «дГТФ-Т» активности Pol і у млекопитающих с заменой Leu62Ile активного центра фермента. В работе впервые получены и описаны свойства ряда мутантных форм Рої і человека, несущих замены эволюционно полиморфных и консервативных аминокислот, а также делецию второго экзона ДНК-полимеразы.

Данные об активности Рої і в организме домовой мыши и изменении биохимических свойств фермента в филогенезе важны для поиска биологической функции Рої і. Информация о биохимических свойствах мутантных форм Pol v человека расширяет представление о структуре активного центра фермента и механизме катализа ДНК-полимеразной реакции.

Предложенная система экспресс-тестирования активности Рої і в экстрактах клеток S. cerevisiae может быть использована для изучения свойств полиморфных форм Рої і и других высокоошибочньгх ДНК-полимераз. Методика тестирования активности Рої г в экстрактах клеток животных представляет практический интерес для изучения активности Рої і в организме человека в норме и при различных патологиях, в частности при изучении и комплексной диагностике злокачественных новообразований. Тестирование «дГТФ-Т» активности Рої і в опухолях глаза апробируется у пациентов Офтальмологической клинической больницы Департамента здравоохранения г. Москвы.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 - материалы симпозиумов и конференций.

Основные положения работы были представлены автором на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), Российско-Европейском симпозиуме по репарации ДНК и эпигенетической регуляции стабильности генома (Санкт-Петербург, Россия, 2008), конференции Американского общества микробиологии «Мутагенез и репарация ДНК: от молекулярной структуры к болезни человека» (Вистлер, Канада, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009).

Диссертационная работа была апробирована на совместных семинарах Сектора развития методов молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН и Лаборатории биохимии Института биологии развития РАН (Москва, 03.08.2008), семинарах Медицинского центра Университета Небраски (Омаха, США, 07.01.2009 и 24.03.2009) и семинарах Института молекулярной генетики РАН.

4 Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор

литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы.

Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста, содержат 15

рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 244 источника.

Похожие диссертации на Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот