Введение к работе
Актуальность проблемы. Аспартатные протеиназы относятся к классу широко распространенных эндопептидаз, обнаруживаемых практически во всех таксономических группах животных, растений, микроорганизмов и ретровирусах. Их медико-биологическая значимость определяется участием в контроле ряда процессов жизнедеятельности человека, связанных с пищеварением (пепсин), регуляцией кровяного давления (ренин), метаболизме белков и процессинге гормонов (катепсины D,E) и некоторых других. Установление роли аспартатных протеиназ в созревании частиц ретровирусов, вызывающих такие заболевания как СПИД, некоторых видов лейкозов, сарком и опухолей молочных желез определило их значение в качестве мишеней для антивирусной терапии. В результате многих исследований стало очевидным, что целенаправленный поиск эффективных лекарственных средств невозможен без знания деталей каталитического механизма действия этих ферментов и понимания структурных основ их специфичности.
В настоящее время представление о механизме каталитического действия аспартатных протеиназ формируется преимущественно на основе данных рентгенострук-турного анализа. Однако, несмотря на чрезвычайную информативность этого метода, он имеет ряд специфических ограничений. Во-первых, получаемая с его помощью информация касается статического состояния фермента и, следовательно, прямо не отвечает на вопрос о динамических конформационных характеристиках трехмерных структур. Во-вторых, этот метод, за редким исключением, позволяет расшифровывать структуры комплексов ферментов лишь с ингибиторами но не с субстратами. Получаемые данные о многих сериях ингибиторных комплексов демонстрируют отличия этих ингибиторов по своему химическому и пространственному строению как от истинного субстрата, так и друг от друга. Не зная продуктивного расположения субстрата в активном центре, а также актуальных для катализа фермент-субстратных взаимодействий и обусловленных ими конформационных перестроек, — трудно составить достаточно полное и объективное представление о специфике каталитической реакции. Поэтому для решения задачи о каталитическом механизме действия ферментов полезно привлечение методов теоретического конформационного анализа и компьютерного моделирования, позволяющих установить продуктивное расположение расщепляемой связи специфического субстрата относительно каталитически активных групп и предсказать некоторые детали строения возникающих в процессе реакции короткоживущих промежуточных соединений.
Цель настоящей работы состоит в изучении конформационных аспектов каталитического механизма аспартатной протеиназы ризопуспепсина и, прежде всего, структурных особенностей ее невалентных комплексов со специфическим субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением на основе подходов и методов теоретического компьютерного моделирования. Главными задачами исследования
являются
Выбор структурной модели субстрат-связывающего участка молекулы фермента и апробация расчетного метода.
Предсказание энергетически предпочтительных конформационных состояний субстрата в активном центре ризопуспепсина на стадии образования невалентного комплекса и их последукяций анализ с целью оценки продуктивности расположения гидролизуемой пептидной группы относительно каталитически активных групп фермента.
Моделирование структуры тетраздрического промежуточного соединения в комплексе с ризопуспепсином и его анализ с целью установления факторов, существенных для протекания катализа.
Анализ полученных структурных данных и создание возможной модели каталитического механизма ризопуспепсина.
Научная новизна и практическая ценность работы. С использованием методов теоретического конформационного анализа и компьютерного моделирования предсказаны пространственные структуры комплексов ризопуспепсина со специфическим ингибитором, субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением. Впервые для представителей семейства аспартатных протеиназ данные о структуре фермент-субстратного комплекса были получены с использованием теоретического расчетного метода, позволяющего провести поиск энергетически предпочтительных структурных вариантов олигопептидного лиганда в активном центре фермента на основе анализа всех потенциально разрешенных локальных конформационных состояний его фрагментов. Предложена новая модель каталитического механизма действия аспартатных протеиназ, объясняющая возможность функционирования этих ферментов в щелочном диапазоне значений рН. Полученные результаты позволяют предложить модель для анализа химических стадий каталитического акта методами квантовой химии. Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на Международной конференции "Biocatalysis-95" (Суздаль. Россия, 1995), на Ш-м Международном симпозиуме по биоорганической химии, IUPAC (Сочи, Дагомыс, Россия, 1995), на VII Международной конференции по аспартатным протеиназам (Банф. Канада, 1996), на IV-м Симпозиуме «Химия протсолитических ферментов» (Москва, 1997) на IV-м Международном симпозиуме по биоорганической химии, IUPAC (Биарриц. Франция, 1997), на VTI-M Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, Россия, 1998), на Международной конференции "Biocatalysis-98" (Москва, Пущино, 1998) Публикации. По матсриапам исследования опубликовано 10 печатных работ. Структура работы. Диссертационная работа изложена на 14<*,~ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов и методов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего ІЬ-О работ.