Введение к работе
Актуальность работы
Заключительная стадия биосинтеза полипептидной цепи - терминация трансляции - происходит в тот момент, когда в А-участке рибосомы оказывается один из трех стоп-кодонов транслируемой мРНК - UAA, UAG или UGA. Ключевую роль в этом процессе играют белковые факторы терминации трансляции. Факторы 1-го класса принимают участие в узнавании стоп-кодона мРНК и в гидролизе пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосом. Факторы 2-го класса связываются с факторами 1-го класса в рибосоме и гидролизуют ГТФ. Известна трехмерная структура фактора терминации 1-го класса eRFl человека и методом ЯМР определена трехмерная структура его М домена в растворе. Известно, что фактор терминации eRFl состоит из трех доменов. N-концевой домен ответствен за узнавание стоп-кодонов, М-домен вовлечен в процесс гидролиза пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы, а С-концевой домен взаимодействует с фактором терминации 2-го класса, eRF3. Функции факторов обоих классов нуждаются в дальнейшем изучении, так как до сих пор не выявлены с достаточной степенью достоверности участки, вовлеченные в непосредственное узнавание стоп-сигналов мРНК, триггерная функция катализа пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы не изучена и остается невыясненной до настоящего времени, недостаточно исследовано собственно взаимодействие между факторами этих 2-х классов. В настоящее время созданы предпосылки для таких исследований. Во-первых, в качестве основного инструмента исследования стали использовать точечный мутагенез eRFl с последующим функциональным тестированием в системах in vivo и in vitro, во-вторых, созданы базы данных для множества организмов с частично или полностью секвенированным геномом, в-третьих, обнаружено уже достаточно большое число организмов с так называемым вариантным генетическим кодом, использующих в качестве значащих кодонов один или два «стоп»-кодона из трех существующих. Факторы терминации трансляции этих организмов, несмотря на высокую степень гомологии с остальным большинством омнипотентных факторов, проявляют би-/унипотентность при узнавании стоп-сигналов в мРНК, что открывает для исследователей новую возможность для создания и изучения гибридных (химерных) форм факторов терминации трансляции.
Цель и задачи исследования
Цель работы состояла в выяснении функциональной роли аминокислотных остатков, находящихся в высококонсервативных участках молекулы eRPl, в особенности, поиск участков молекулы eRFl, вовлеченных в декодирование стоп-кодонов. Сформулированы следующие конкретные задачи исследования:
-
методом направленного мутагенеза получить точечные замены аминокислот в N-концевом домене eRFl человека;
-
выделить и очистить мутантные формы eRFl человека, охарактеризовать их функциональную активность;
-
получить гибридную конструкцию, где N-концевой домен eRFl человека замещен N-концевым доменом eRFl инфузории Stylonychia mytilis; охарактеризовать функциональную активность гибридного фактора;
-
получить набор гибридных конструкций, где участки N-концевого домена eRFl человека замещены аналогичными участками N-концевого домена eRFl инфузории Stylonychia mytilis; охарактеризовать их функциональную активность;
-
получить мутантные eRFl с заменами избранных аминокислотных остатков на метионин в различных положениях N-концевого домена с целью идентификации сшивок eRFl-мРНК в рибосоме;
6) получить генноинженерные конструкции фрагментов гена erfl человека,
кодирующие индивидуальные домены eRFl; охарактеризовать их взаимодействие,
участие в образовании комплексов eRFl-eRP3, их влияние на способность
активировать ГТФазную активность eRF3 в рибосоме.
Научная новизна и практическая ценность работы
Методом сайт-направленного мутагенеза получен широкий спектр точечных мутаций N-концевого домена eRFl. Установлено, что консервативный Туг125 образует водородную связь с Glu55. Высказано предположение, что водородная связь фиксирует ориентацию Туг125 в молекуле eRFl, что важно для узнавания третьего положения в стол-кодоне. Доказано, что рекомбинирование доменов между гомологичными факторами терминации приводит к изменению специфичности узнавания стоп-кодонов, присущей каждому из этих факторов. Выявлен дипептид TS/QF в N-концевом домене eRFl человека (положения 122-123), замена которого на дипептид QF, находящийся в аналогичном положении в
N-концевом домене Stylonychia mytilis, приводит к потере омнипотентности и узнаванию только стоп-кодона UGA. Показано, что гуанин в стоп-кодоне UGA образует сшивку с участком 121-124 eRFl, а гуанин стоп-кодона UAG образует сшивку после 131-ого аминокислотного остатка eRFl. Установлено, что минидомен YxCxxxF, вовлеченный в узнавание стоп-кодонов, является более протяженным, чем считали ранее и ограничен положениями 121-132.
Результаты представленной работы открывают перспективы для создания теоретической и экспериментальной базы данных с целью изучения РНК-белковых взаимодействий в общем и работы трансляционного аппарата клетки, в частности. Результаты данной работы могут помочь при разработке супрессорных методов лечения онкозаболеваний. Кроме того, введение неканонических аминокислот в состав белков с использованием стоп-кодонов в качестве смысловых может значительно расширить функциональное разнообразие белков. Результаты работы демонстрируют возможность исследования молекулярной машинерии клетки in vitro и in vivo путем создания широкого спектра мутантных форм белков и гибридных конструкций с помощью относительно простых генно-инженерных манипуляций.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на следующих международных конференциях: Engelghardt Conference on Molecular Biology (Suzdal, 2004); Protein Synthesis and Translational Control (Heidelberg, 2005, 2007); tRNA workshop (Bangalore, 2005).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 3 работы.
Структура и объем диссертации
