Введение к работе
Актуальность проблемы. Репарация ДНК является важнейшей генетической функцией, направленной на сохранение интактной структуры клеточного генома. Различные физические и химические факторы вызывают различные повреждения в ДНК, что определяет многообразие механизмов репарации этих повреждений. Проблема коррекции структурных аномалий, возникающих в ДНК, особенно актуальна на ранних этапах эмбрионального развития, так как дефект в репаративной системе клеток эмбриона в условиях интенсивной пролиферации приводит к многократному повторению ошибки. Репаративный синтез ДНК в ходе первых делений клеток эмбриона обеспечивается запасенными в зрелом ооците репаративными ДНК-полимеразами. Низкое содержание ДНК-полимеразы р в зрелых яйцеклетках вьюна в сравнении с ее содержанием в яйцеклетках других видов (Mikhailov and Gulyamov, 1983; Carre et al., 1980, Matsumoto et al., 1994) ставит вопрос о возможном участии других ДНК-полимераз в репарации повреждений ДНК на ранних этапах эмбриогенеза.
Согласно современной классификации, существуют пять типов ДНК-полимераз эукариот: а, р, у, 5 и е (Burgers et al., 1990), которые участвуют в репликации и репарации ДНК. Недавно опубликованы данные о новой ДНК-полимеразе, названной ДНК-полимеразой С,, выделенной из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993), зрелых яйцеклеток вьюна (Шарова и др., 1994) и клеток дрожжей (Nelson et al., 1996). ДНК-полимераза С, участвует, по-видимому, в репарации ДНК. Если о структуре, физико-химических и энзиматических свойствах ДНК-полимераз а, р, у, 8 и є существуют многочисленные данные, то о новом ферменте известно крайне мало. Решение вопроса о роли обнаруженной ДНК-полимеразы требует детального анализа строения фермента, идентификации каталитической субъединицы и исследования механизма взаимодействия с модельными ДНК-субстратами. Физико-химический и энзимологический анализ ДНК-полимеразы С, может выявить новые механизмы репарации клеточной ДНК и их специфику в раннем развитии животных.
Пели настоящей работы сформулированы следующим образом. Получить высокоочищенный препарат недавно обнаруженной ДНК-полимеразы С, из зрелых яйцеклеток вьюна; определить ее полипептидный состав,
каталитическую субъединицу и исследовать ее физико-химические и ферментативные свойства; изучить динамику активности ДНК-полимеразы в эмбриогенезе вьюна; исследовать действие активных форм кислорода, вызывающих повреждения в структуре ДНК, на активность анализируемого фермента.
Научная новизна и практическая ценность работы. Из зрелых яйцеклеток и эмбрионов вьюна выделена новая ДНК-полимераза, сходная по своим свойствам с недавно описанной ДНК-полимеразой из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993). Показано, что каталитической субъединицей фермента является полипептид 68 кДа. Выявлена способность; фермента к дистрибутивному (низкопроцессивному) синтезу ДНК, дистрибутивному 3'-»5'-гидролизу одноцепочечной ДНК и неспаренных З'-концевых нуклеотидов в составе дуплекса ДНК.
Исследована динамика активности ДНК-полимеразы , в ходе эмбрионального развития вьюна. Показано, что в зрелых яйцеклетках и развивающихся эмбрионах удельная активность ДНК-полимеразы ^ в 50 - 60 раз выше удельной активности ДНК-полимеразы (J. Впервые показано в экспериментах in vivo, что активные формы кислорода, генерирующие разного типа повреждения в ДНК, вызывают повышение активности ДНК-полимеразы , что является указанием на репаративную функцию фермента.
Результаты работы подтверждают существование нового, принципиально отличающегося от известных ДНК-полимераз фермента с выраженной репаративной функцией. Они имеют научно-теоретическое значение для. развития представлений о репаративной системе ДНК эукариот и ее функционировании на ранних стадиях эмбрионального развития. Полученные данные могут быть использованы при исследовании регуляции репарации ДНК в эмбриогенезе позвоночных животных и для изучения механизмов коррекции разного типа повреждений в структуре ДНК.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции "Окислительный стресс и регуляция окислительно-восстановительных процессов: клеточные сигналы, СПИД, рак и другие болезни" (Париж, Франция, 1996) и международном совещании "Репликация ДНК у эукариот" (Колд Спринг Харбор, США, 1997)
Публикации, По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения и выводов. Работа изложена на /У/ стР-> экспериментальные данные представлены на 13 рисунках и в 6 таблицах. Список цитируемой литературы включает 131 работ.