Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Опиоидная система и ее роль в формировании толерантности и зависимости от морфина у экспериментальных животных 9
1.2. Взаимодействие холецистокининовой и опиоидной систем в условиях действия морфина 22
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 47
3.1. Выраженность анальгетического эффекта морфина при различных режимах введения аналога ССК-4 и морфина 47
3.2. Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность ц- и 8-ОР in vitro и при однократном введении морфина in vivo 53
3.3. Развитие толерантности к анальгетическому действию морфина и зависимости от наркотика при введении аналога ССК-4
на фоне хронической морфинизации 62
3.4. Связывающая активность |i- и 5-ОР при хроническом сочетанном введении морфина и аналога ССК-4 66
3.5. Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность jj,- и 5-ОР при отмене морфина 71
3.6. Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность ССК-рецепторов мозга при длительном введении морфина 74
3.7. Базальный и форсколинстимулированный уровень цАМФ при введении аналога ССК-4 на фоне однократного и хронического введения морфина 78
3.8. Влияние аналога ССК-4 на потребление морфина у животных с опийной зависимостью 85
Заключение 99
Выводы 110
Список литературы 112
- Взаимодействие холецистокининовой и опиоидной систем в условиях действия морфина
- Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность ц- и 8-ОР in vitro и при однократном введении морфина in vivo
- Связывающая активность |i- и 5-ОР при хроническом сочетанном введении морфина и аналога ССК-4
- Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность ССК-рецепторов мозга при длительном введении морфина
Введение к работе
Актуальность исследования. В России наиболее часто употребляемыми наркотическими средствами являются опий кустарного производства, героин и его самодельные аналоги (Иванец Н.Н. и др., 2005; Кошкина Е.А. и др., 2005; Кошкина Е.А. и др., 2006), поэтому лечение и профилактика опийной наркомании являются чрезвычайно актуальной проблемой.
Согласно современным представлениям, в формировании зависимости от опиатов существенную роль играет изменение опиоидной рецепции, прежде всего, на уровне таких регуляторных процессов, как десенситизация и интернализация рецепторов (Williams J.T. et al., 2001). В связи с этим в научной литературе обсуждается возможность поиска эффективных средств лечения опийной наркомании среди соединений, модулирующих опиоидную рецепцию (Blake A.D. et al., 1997), а в клинической наркологии в настоящее время широко используются препараты, являющиеся антагонистами опиоидных рецепторов (Сиволап Ю.П., Савченков В.А., 2005).
Физиологические эффекты опиоидных пептидов реализуются посредством их взаимодействия со специфическими рецепторами ц-, б- и к-типа, широко представленными в ЦНС и на периферии (Mansour A. et al., 1995), и регулируются большим числом нейромодуляторов, в том числе и биологически активными фрагментами холецистокинина (cholecystokinin, ССК) - окта- и тетрапептидами ССК, ССК-8 и ССК-4 (Wiesenfeld-Hallin Z. et al., 1999). Если ССК-8 взаимодействует в ЦНС с двумя типами ССК-рецепторов (ССК1 и ССК2), то ССК-4 обладает выраженной селективностью к ССК2-рецепторам (Rehfeld J.F. et al., 1985; Wank S.A., 1995). Авторадиографические исследования показали, что биологически активные фрагменты ССК и опиоидные пептиды обнаруживаются в одних и тех же морфологических структурах мозга, а их специфические рецепторы локализованы на мембране одних и тех же нейронов (Noble F. et al., 1993;' Zhang X.etal., 2000).
В большинстве работ, посвященных изучению взаимодействия между ССК- и опиоидной системами, исследуется влияние лигандов ССК-рецепторов на анальгетический эффект эндогенных опиоидов и морфина (Itoh S. et al., 1982; Ding XX. et al., 1986; Friedrich A.E., Gebhart G.F., 2000; Falicio J.F. et al., 2001). И лишь незначительное число исследований пытается ответить на вопрос, каким образом лиганды ССК-рецепторов модифицируют подкрепляющий и анксиолитический эффекты опиоидов, а также поведенческие и вегетативные реакции, индуцируемые отменой морфина у животных с опийной зависимостью (Valverde О. et al., 1996; Hernando F. et al., 1996; KayserV.etal., 1998).
В настоящее время доминирует мнение, что стимуляция ССК2-рецепторов снижает анальгетическое действие морфина и эндогенных опиоидных пептидов (Backus R.C. et al., 1997), тогда как антагонисты ССК2-рецепторов усиливают индуцируемые опиоидами анальгезию (Smadja С. et al., 1995) и антидепрессантно-подобный эффект (Backus R.C. et al., 1997). В то же время, сообщается и о способности агонистов ССК-рецепторов (ССК-8S и церулеина) предотвращать развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина при его длительном употреблении и снижать выраженность синдрома отмены наркотика (Zarrindast M.R. et al., 1995; Zarrindast M.R. et al., 1997). При этом практически открытым остается вопрос о влиянии лигандов ССК-рецепторов на связывающую и функциональную активность опиодных рецепторов.
Представленные данные послужили основанием для проведения настоящего исследования, в котором в качестве лиганда ССК-рецепторов планировалось использовать пептидное соединение, созданное путем модификации эндогенного тетрапептида ССК (аналог ССК-4) с выраженной избирательностью к ССК 1-рецепторам (Анохина И.П. и соавт., 1999; Проскурякова Т.В., 2000).
Цель работы состояла в изучении влияния аналога ССК-4 на опиоидергические механизмы формирования толерантности и зависимости от морфина у животных.
Задачи исследования:
Исследовать влияние аналога ССК-4 на выраженность эффектов однократного и хронического введения морфина: анальгетического действия морфина, толерантности и зависимости от наркотика.
Изучить характер влияния аналога ССК-4 на связывающую активность агонистов опиоидных рецепторов в экспериментах in vitro.
Изучить влияние аналога ССК-4 на связывающую и функциональную активность опиоидных и холецистокининовых рецепторов в различных структурах мозга крыс при однократном и хроническом введении морфина.
Оценить влияние аналога ССК-4 на потребление морфина в условиях свободного выбора у животных с опийной зависимостью.
Научная новизна. Структура аналога ССК-4, созданного путем модификации эндогенного тетрапептида холецистокинина является приоритетной. Впервые установлено, что аналог ССК-4 подавляет развитие основных симптомов опийной зависимости, а именно, предотвращает развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина, снижает тяжесть физической зависимости от наркотика, а также снижает потребление морфина у животных с опийной зависимостью. Механизм действия аналога ССК-4 при однократном и хроническом введении морфина связан с его модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов в структурах мозга.
Практическое значение. Проведенные исследования выявили у аналога ССК-4 фармакологическую активность, которая позволяет рассматривать это соединение в качестве потенциального средства для лечения опийной наркомании. Это пополнит имеющийся на настоящий момент арсенал фармакологических препаратов для лечения опийной
8 наркомании принципиально новым средством, механизм действия которого связан с модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов.
Способность аналога ССК-4 потенцировать анальгетический эффект морфина позволяет снижать дозу наркотика, что имеет практическое значение при использовании морфина в качестве обезболивающего средства.
Положения, выносимые на защиту.
Взаимодействие холецистокининовой и опиоидной систем играет существенную роль в реализации эффектов острого и хронического введения морфина.
В качестве эффективных средств лечения опийной зависимости могут быть использованы препараты, модулирующие связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании межлабораторной конференции ННЦ наркологии Росздрава (Москва, июнь 2003); Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, ноябрь 2003); на научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты», март 2005); на VIII-ой региональной конференции Европейского колледжа по нейропсихофармакологии (Москва, апрель 2005); на И-ом Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, май 2005); на заседании Проблемной комиссии ННЦ наркологии (Москва, апрель 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 130 страницах, содержит 16 таблиц и 8 рисунков. Список цитированной литературы включает 169 источников, из которых -15 работ отечественных авторов.
Взаимодействие холецистокининовой и опиоидной систем в условиях действия морфина
ССК-система организована подобно другим нейромедиаторным системам, а именно: состоит из двух типов ССК-рецепторов, множества ССК-подобных пептидов и ферментативных систем их деградации.
ССК синтезируется не только в ткани поджелудочной железы, но и в нервной ткани как про-ССК, который затем расщепляется протеолитическими ферментами на ряд биологически активных фрагментов, из которых наиболее изученными являются октапептидный и тетрапептидный фрагменты, ССК-8 и ССК-4, соответственно (Blanke S.E. et al., 1993). Установлено, что 90% ССК-подобных пептидов в центральной нервной системе представлено ССК-8, сульфатированным по тирозину в положении 7-CCK-8(S) (Beinfeld М.С., Palkovits М., 1981).
Действие биологически активных фрагментов ССК опосредуется двумя типами рецепторов: ССК1- и ССК2-рецепторами, локализованными как в периферических тканях, так и в центральной нервной системе (Могап Т.Н. et al., 1986). Необходимо заметить, что до недавнего времени ССК1- и ССК2-рецепторы обозначались как ССКА- и ССКв-рецепторы, соответственно. CCK-8(S) обладает практически одинаковым сродством к ССК1- и ССК2- рецепторам, тогда как ССК-4 является селективным агонистом ССК2-рецептора (Innis R.B., Snyder., 1986).
ССК-рецепторы также относятся к метаботропному типу рецепторов, который, как отмечалось выше, имеет сложную систему организации. Изучение постсинаптических процессов, развивающихся после связывания ССК-пептидов со своими рецепторами, находится в стадии интенсивного исследования. С определенностью можно говорить лишь о том, что ССК-рецепторы сопряжены с несколькими G-белками, а в качестве вторичных мессенджеров могут выступать цАМФ, цГМФ, диацилглицерол, инозитолфосфаты и ионы кальция (De la Fuente М. et al., 1998; Roerig S.C. et al., 1998; Smeets R.L. et al., 1998). Помимо этого, доказано различие в механизмах реализации внутриклеточных процессов при стимуляции ССК1- и ССК2-рецепторов, что проявляется в особенностях физиологических эффектов, опосредуемых этими типами ССК-рецепторов (Detjen К. et al., 1997; Rozengurt Е., 1998).
Первым сообщением о взаимодействии ССК- и опиоидной систем является работа, в которой было обнаружено, что интрацеребровентрикулярное введение ССК-8 снижает анальгезию, индуцируемую введением Р-эндорфина (Itoh S. et al., 1982). В дальнейшем было показано, что интраперитонеальное введение ССК-8, предшествующее введению морфина, снижает анальгетическое действие последнего (Fans P.L. et al., 1983), и этот эффект ССК-8 полностью обращается антагонистами ССК-рецепторов (Watkins L.R. et al., 1985; Suberg S.N. et al., 1985). Причем проглюмид, неселективный антагонист ССК1/ССК2-рецепторов, блокирует ингибирующий эффект ССК-8 при концентрации 5 мг, тогда как девазепид, антагонист ССК 1-рецепторов -при значительно более высоких концентрациях (50-200 мг), что позволяет связать антиопиоидное действие ССК-8 с активацией ССК2-рецепторов (Li Y., Han J.S, 1989).
Доказательства способности эндогенного ССК модифицировать анальгетическое действие морфина были получены при введении животным антисыворотки против ССК-8: у этих животных морфин индуцировал более выраженный анальгетический эффект, чем у контрольных животных (Ding X.L. et al., 1986). Таким образом, блокада действия эндогенного ССК приводит к повышению чувствительности к морфину, возможно, за счет сенситизации мест связывания морфина.
Потенцирование анальгетического эффекта морфина было обнаружено при одновременном интратекальном введении морфина и проглюмида или морфина и L-365,260, селективного антагониста ССК2-рецепторов (Friedrich А.Е., Gebhart G.F., 2000), а также у животных, которым до введения морфина в течение 5-ти дней интраперитонеально вводили либо антагонист ССК2-рецепторов (РД-135,158), либо антагонист ССК1-рецепторов (Falicio J.F. et al., 2001).
В то же время в литературе имеются сообщения о потенцировании анальгетического действия морфина церулеином, неселективным агонистом ССК1/ССК2-рецепторов и CCK-8S (Rezayat М. et al., 1997; Zarrindast M.R. et al., 1997; Williams C.L. et al., 1997). При этом было обнаружено, что потенцирующий эффект CCK-8S блокируется налоксоном, а не антагонистами ССК-рецепторов.
Антагонисты ССК-рецепторов сами не обладают анальгетическим действием (Stanfa L., et al., 1994), но при совместном введении с морфином потенцируют анальгетический эффект наркотика. Это свойство антагонистов ССК-рецепторов имеет прямое клиническое применение, так как позволяет уменьшать дозу морфина и частоту его введения при использовании морфина в качестве обезболивающего средства.
Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность ц- и 8-ОР in vitro и при однократном введении морфина in vivo
На начальном этапе исследования была предпринята попытка выяснить, свойственно ли аналогу ССК-4 сродство к ц-и 5-ОР. Для этого в экспериментах in vitro было проведено изучение действия аналога ССК-4 на связывание высокоселективных лигандов ц- и 5-ОР (3Н-ДАГО и 3Н-ДАДЛ, соответственно). При этом использовали метод вытеснения аналогом ССК-4 выбранных меченых соединений из участков их специфического связывания. В качестве мембранного препарата в данном эксперименте были использованы ткани стриатума, что связано с высокой плотностью, как ц-, так и 8-ОР в этом отделе мозга (Hoffman P.L. et al.,1984).
Предварительно для каждого меченого соединения с помощью насыщающего радиорецепторного анализа определили зависимость величины специфического связывания от концентрации лиганда в реакционной смеси. Значения Kd и Втах были получены с помощью программы LIGAND на основании результатов трех независимых экспериментов и составили: для3Н-ДАГО: Kd = 4,07±0,6нМ; Bmax = 492±238 фмоль/мг белка; для 3Н-ДАДЛ: Kd = 4,16±0,7 нМ; Втах = 292± 57 фмоль/мг белка.
Эти результаты свидетельствуют о том, что используемые нами меченые лиганды имеют один центр связывания. В дальнейшем, опираясь на данные литературы, мы будем считать, что эти результаты подтвердили избирательность 3Н-ДАГО к ц-ОР, 3Н-ДАДЛ - к 8-ОР.
При проведении вытесняющего анализа было установлено, что аналог ССК-4 при добавлении в реакционную среду вызывал дозозависимое ингибирование специфического связывания Н-ДАГО: максимальная степень ингибирования составила 74% при концентрации аналога ССК-4 100 мкМ (рис. 3.2.1, кривая 1), при этом за 100% принималось специфическое связывание меченого лиганда в отсутствии аналога ССК-4.
В тканях стриатума, которые использовались в экспериментах in vitro в качестве мембранных препаратов, помимо д- и 8-ОР, представлены и ССК1-рецепторы (Hill D.R. et al, 1987), сродством к которым обладает аналог ССК-4 (Проскурякова Т.В. и соавт., 2000). Если бы д- ОР и ССК- рецепторы были локализованы в разных отделах мозга, то полученные нами данные об ингибировании аналогом ССК-4 специфического связывания Н-ДАГО позволяли бы говорить о конкурентном взаимодействии аналога ССК-4 и меченого лиганда за активный центр д-ОР. К тому же д-ОР и ССК-рецепторы, как известно, локализованы на одних и тех же нейронах, причем в непосредственной близости друг от друга (Gall С. et al. ,1987; Noble F. et al., 1993; Zhang X. et al., 2000), поэтому полученные результаты, на наш взгляд, не могут рассматриваться в качестве доказательства наличия у аналога ССК-4 сродства к д-ОР.
При добавлении аналога ССК-4 в реакционную среду, содержащую селективный агонист 5-ОР 3Н-ДАДЛ, наблюдалось увеличение его специфического связывания практически во всем диапазоне используемых концентраций аналога ССК-4. Максимальное специфическое связывание Н-ДАДЛ составило 165% при концентрации аналога ССК-4 в реакционной среде 10 нМ (рис. 3.2.1, кривая 2), при этом за 100% принималось специфическое связывание меченого лиганда в отсутствии аналога ССК-4. Когда в присутствии аналога ССК-4 в концентрации 10 нМ было проведено определение параметров связывания 3Н-ДАДЛ, то обнаружили, что количество мест специфического связывания 3Н-ДАДЛ значительно возросло: от 251 ±27 фмоль/мг белка в контроле до 763±103 фмоль/мг белка в присутствии аналога ССК-4. При этом сродство 3Н-ДАДЛ к местам специфического связывания достоверно не изменилось, составив 7,2 нМ в контроле и 12,0 нМ в присутствии аналога ССК-4. Объяснить обнаруженное в экспериментах in vitro увеличение мест связывания Н-ДАДЛ при добавлении в реакционную среду аналога ССК-4, вероятно, возможно только привлечением гипотезы о «неактивных» (фосфорилированных) рецепторах, которые при определенных условиях становятся активными и способными связывать собственные лиганды (Williams J.T. et al., 2001).
Таким образом, в экспериментах in vitro было установлено, что аналог ССК-4 при добавлении в реакционную среду вызывает дозозависимое ингибирование специфического связывания селективного лиганда ц-ОР 3Н-ДАГО и увеличение специфического связывания селективного лиганда 8-ОР 3Н-ДАДЛ.
В экспериментах in vivo при однократном внутрибрюшинном введении аналога ССК-4 было обнаружено, что параметры связывания 3Н-ДАГО ни в стриатуме, ни во фронтальной коре животных достоверно не изменялись ни при одной из используемых доз аналога ССК-4 (табл. 3.2.1). В то же время отмечалось достоверное увеличение мест специфического связывания 3Н-ДАДЛ на фоне падения его сродства к местам связывания в стриатуме и фронтальной коре. Причем, в отличие от экспериментов in vitro, с увеличением дозы аналога ССК-4 регистрировалось и большее число мест связывания 3Н-ДАДЛ.
Для дальнейших экспериментов in vivo нами была выбрана минимальная доза аналога ССК-4 - 2 мкг/кг веса животного, потому что при этой дозе падение сродства Н-ДАДЛ к местам специфического связывания в исследуемых структурах мозга было таким же, как и при 10- и 100-кратном увеличении дозы аналога ССК-4. Более того, нам удалось показать, что аналог ССК-4 в дозе 2 мкг/кг потенцировал анальгетический эффект морфина.
Связывающая активность |i- и 5-ОР при хроническом сочетанном введении морфина и аналога ССК-4
Согласно представленным в таблице 3.4.1 данным, при длительном введении одного морфина наблюдалось уменьшение мест связывания Н-ДАГО в стриатуме и фронтальной коре при увеличении мест связывания 3Н-ДАДЛ во фронтальной коре. Сродство этих лигандов к специфическим местам связывания не изменялось, за исключением падения сродства 3Н-ДАДЛ к 5-ОР в стриатуме.
Введение аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации восстанавливало до контрольных значений только число мест связывания 3Н-ДАГО в стриатуме.
Увеличение мест связывания Н-ДАДЛ во фронтальной коре, наблюдаемое на фоне хронической морфинизации, не изменялось после предварительной инъекции аналога ССК-4, а в стриатуме отмечалось увеличение мест связывания Н-ДАДЛ, причем его сродство к 8-ОР в этом отделе мозга оставалось пониженным, как и при введении одного морфина.
При сопоставлении этих данных с результатами, представленными в табл. 3.2.2, можно видеть, что при хроническом и однократном введении морфина обнаруживаются различия в изменении параметров связывания используемого в работе агониста jx-ОР, а также в характере влияния аналога ССК-4 на связывающую активность д- и 8-ОР.
Если при хроническом введении морфина в стриатуме и фронтальной коре наблюдалось только снижение мест специфического связывания Н-ДАГО, то при однократном введении морфина отмечалось лишь падение сродства 3Н-ДАГО к ц-ОР во фронтальной коре. Введение аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации приводило к нормализации мест связывания 3Н-ДАГО в стриатуме, тогда как инъекция аналога ССК-4, предшествующая однократному введению морфина, усиливала падение сродства 3Н-ДАГО к ц-ОР во фронтальной коре.
Продолжительность введения морфина не оказывала влияния на связывающую активность 8-ОР: и при однократном, и при хроническом введении морфина наблюдалось увеличение мест связывания Н-ДАДЛ во фронтальной коре и падение сродства Н-ДАДЛ к 8-ОР в стриатуме. Различия обнаруживались в том случае, когда введению морфина предшествовало введение аналога ССК-4. Если при однократном введении аналога ССК-4 и морфина наблюдалась нормализация мест связывания Н-ДАДЛ во фронтальной коре, то при введении аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации отмечалось увеличение мест связывания 3Н-ДАДЛ в стриатуме.
Обращают внимание и различия в действии самого аналога ССК-4 на связывающую активность ОР при однократном и хроническом введении пептида. При однократном введении аналога ССК-4 изменялась только связывающая активность 8-ОР, и эти изменения выражались в увеличении мест связывания Н-ДАДЛ во фронтальной коре при падении сродства 3Н-ДАДЛ к S-OP во фронтальной коре и стриатуме. При длительном введении одного аналога ССК-4 наблюдалось увеличение мест связывания 3Н-ДАГО во фронтальной коре и увеличение мест связывания 3Н-ДАДЛ во фронтальной коре и стриатуме при падении сродства этих лигандов к д- и 5-ОР в обеих структурах мозга по сравнению с контрольными животными. Эти данные могут быть привлечены для обсуждения механизма, лежащего в основе предотвращения под действием аналога ССК-4 развития толерантности и снижения тяжести опийной зависимости, потому что эти эффекты, как отмечалось выше, наблюдались в условиях, когда введение аналога ССК-4 предшествовало введению морфина.
Механизм формирования толерантности к морфину, в том числе и его анальгетическому действию, и зависимости от морфина при длительном употреблении наркотика до сих пор окончательно неясен, несмотря на длительность исследования этих феноменов. Наряду с данными об отсутствии изменений связывающей активности ц-рецепторов при длительном введении морфина (Wong C.S. et al., 1996), имеются сообщения, подтверждающие полученные нами результаты о снижении их плотности и/или аффинности в структурах головного мозга экспериментальных животных (Jordan В., Devi L.A., 1998). Необходимо подчеркнуть трудность сопоставления результатов различных авторов, так как регуляция экспрессии JJ.-OP в условиях действия морфина очень нестабильна. К тому же амплитуда и направление изменений аффинности и-ОР зависят от нескольких факторов, таких, как локализация рецепторов в ЦНС, доза морфина и длительность его введения. Колебания же плотности любых рецепторов связывают с изменениями концентраций мРНК для этих рецепторов. Для ц-ОР такие исследования стали возможными после того, как был клонирован \i\-опиатный рецептор у крыс (Chen L. et al., 1993). Однако, как показали экспериментальные исследования, снижение плотности щ-рецепторов при длительном введении морфина не коррелирует с концентрацией мРНК цг рецепторов (Brodsky М. et al., 1995).
Ряд авторов высказывают предположение, что развитие толерантности к эффектам морфина, а, возможно, и зависимости от наркотика при его длительном введении может быть связана с постепенным появлением так называемых конститутивных форм ц-ОР (ц -ОР), т.е. форм, которым для активации систем вторичных посредников не требуется связывания агониста.
Переход ц-ОР в ц -форму осуществляется путем фосфорилирования Ц-ОР и регулируется специфической рецепторной протеинкиназой, так как накопление ц -рецепторов тормозится при введении Н-7, ингибитора протеинкиназ. Увеличение количества ц -ОР было обнаружено при введении морфина, а их блокада достигалась введением налоксона (Donaldson L.F. et al., 1997).
При обсуждении полученных результатов обращает внимание, что при развитии толерантности к анальгетическому эффекту морфина и зависимости от морфина, помимо снижения числа ц-ОР во фронтальной коре, наблюдается увеличение числа б-ОР в стриатуме. В то же время, E.E.Abdelhamid et al. (1991) показали, что при блокаде 5-ОР соответствующими антагонистами у мышей не развивается не только толерантность к морфину, но и зависимость от наркотика. Позже Y.Zhu et al. (1999) обнаружили, что «нокаут» гена, кодирующего синтез 5рОР, предотвращает развитие у мышей толерантности к анальгетическому эффекту морфина при его длительном введении. Аналогичные результаты были получены и у мышей, «нокаутных» по гену, кодирующему синтез препроэнкефалина, обладающего селективностью к бі-OP (Nitsche J.F. et al., 2002). К сожалению, эти данные не могут быть привлечены для обсуждения полученных нами результатов, т.к. в настоящем исследовании определялась общая популяция 5-ОР.
Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность ССК-рецепторов мозга при длительном введении морфина
Аналог ССК-4, как сообщалось ранее, обладает сродством к ССК-рецепторам с выраженной селективностью к ССК1 -рецепторам (Проскурякова Т.В. и соавт., 2000). В связи с этим было проведено исследование связывающей активности ССК-рецепторов мозга при хроническом введении морфина, при хроническом введении морфина и аналога ССК-4 и при последующей отмене морфина. В качестве лиганда ССК-рецепторов при выполнении этого исследования был использован I-CCK8S. Согласно полученным данным, длительное введение морфина приводило к снижению мест связывания 125I-CCK8S в гипоталамусе и фронтальной коре (табл. 3.6.1). При этом сродство I-CCK8S к ССК-рецепторам в гипоталамусе увеличивалось, а во фронтальной коре не изменялось. Введение аналога ССК-4 на фоне морфинизации не оказывало влияния на параметры связывания ,25I-CCK8S ни во фронтальной коре, ни в гипоталамусе: число мест связывания I-CCK8S оставалось сниженным, а сродство I-CCK8S к ССК-рецепторов - повышенным по сравнению с контрольными животными. Иными словами, различий в связывающей активности ССК-рецепторов между животными, получавшими морфин, и животными, получавшими морфин в сочетании с аналогом ССК-4, не выявлено. При отмене морфина у животных, получавших один морфин, во фронтальной коре наблюдалась нормализация мест связывания I-CCK8S при падении его сродства к ССК-рецепторам. В гипоталамусе падение сродства I-CCK8S к ССК-рецепторам происходило на фоне увеличения мест связывания I-CCK8S. Обращает внимание, что число мест связывания 125I-CCK8S в период отмены значительно превышало аналогичный показатель у контрольных животных и у крыс на фоне хронического введения морфина. Отмена морфина после хронического сочетанного введения морфина и аналога ССК-4 сопровождалась восстановлением до контрольных значений сродства I-CCK8S к ССК-рецепторам в гипоталамусе и фронтальной коре. При этом во фронтальной коре наблюдалась нормализация мест связывания I-CCK8S, а в гипоталамусе - их снижение, правда, не до контрольных значений. Таким образом, действие аналога ССК-4, вводимого на фоне хронической морфинизации, проявляется только при отмене морфина и выражается в нормализации сродства ССК-рецепторов во фронтальной коре и гипоталамусе и снижении числа ССК-рецепторов в гипоталамусе.
Что касается типа ССК-рецепторов, то в качестве лиганда мы использовали меченный йодом CCK-8S, который, согласно данным литературы, связывается как с ССК1-, так и с ССК2- рецепторами (Wank S.A., 1995). При этом его избирательность к ССК1- рецепторам выше, чем к ССК2- рецепторам, но не настолько, чтобы при использовании I-CCK8S в качестве лиганда в радиорецепторном анализе можно было бы с уверенностью говорить, какой тип ССК-рецепторов доминирует в исследуемых нами отделах мозга.
При сопоставлении полученных результатов с данными литературы приходится сталкиваться с рядом трудностей, т.к. в доступной нам литературе встретилась лишь одна работа, посвященная изучению ССК-рецепторов при хроническом введении морфина (Munro G. et al., 1998). Используя авторадиографический метод, эти авторы обнаружили увеличение мест связывания CCK-8S в супраоптическом ядре гипоталамуса животных со сформированной толерантностью и зависимостью от морфина.
Большинство же исследований посвящено изучению содержания эндогенного ССК при однократном и хроническом введении морфина в различных отделах ЦНС (Lucas G.A. et al., 1998; Hamilton M.E. et al., 2000; Gustafsson H. et al., 2001;), в том числе, гипоталамусе (Ding X.Z., Bayer B.M., 1993) и фронтальной коре (Becker С. et al ,2000). Практически во всех этих исследованиях обнаружено увеличение экспрессии ССК-мРНК и внеклеточного содержания ССК, наиболее значимое при субхроническом и хроническом введении морфина, чем при однократном введении наркотика.
Опираясь на эти данные литературы, можно предположить, что обнаруженное нами снижение числа ССК-рецепторов во фронтальной коре и гипоталамусе животных при хроническом введении морфина, по-видимому, обусловлено увеличением уровня эндогенного ССК. С позиций действия "принципа саморегуляции нейромедиаторных систем" эти изменения следует рассматривать как адаптационные.
Увеличение числа ССК-рецепторов во фронтальной коре и, особенно в гипоталамусе, в условиях отмены морфина, вероятно, также можно рассматривать как адаптационные, но только при одном условии: если при отмене морфина снижается уровень эндогенного ССК. В литературе данные о снижении уровня ССК при отмене морфина отсутствуют, а у нас не было возможности выполнить подобного рода исследования.
Обращает внимание, что у хронически морфинизированных животных увеличение числа ССК-рецепторов в гипоталамусе при отмене морфина происходило на фоне значительного падения сродства используемого лиганда ( I-CCK8S) к ССК-рецепторам, что, скорее всего, свидетельствует о напряженности функционирования ССК-системы в гипоталамусе, возможно, путем вовлечения в адаптационные процессы не только резервных рецепторных пулов ССК-системы, но и других рецепторов и, прежде всего, опиоидных (Roerig L.H. et al., 1996). В то же время у животных, которым на фоне хронической морфинизации вводился аналог ССК-4, в период отмены морфина сродство I-CCK8S к ССК-рецепторам в гипоталамусе и фронтальной коре нормализовалось, и при этом в гипоталамусе снижалось число мест связывания 125I-CCK8S.
