Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
Экотоксикология как научное направление 9
Основные токсиканты окружающей среды 15
Показатели токсичности химических веществ 23
Методы экотоксикологии 29
Почва как среда обитания 4 6
Основные группы почвенных организмов 53
Трофические связи почвенных организмов 60
Организмы, используемые в экотоксикологии почв 68
Энхитреиды как объект экотоксикологии 14
Факторы среды, влияющие на энхитреид 74
Питание энхитреид 8 5
Хищники энхитреид 94
Паразиты энхитреид 95
Чувствительность энхитреид к токсикантам 96
Методы культивирования энхитреид 99
Основная часть
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 104
Животные 104
Субстрат 107
Токсиканты 129
Загрязнение субстрата 130
Определение потерь от прокаливания 131
Определение максимальной водоудерживающей способности . 131
Определение рН почвы 132
Показатели токсичности t ; 133
Проведение биотестирования 133
Определение влияния концентрации карбендазима, плотности энхитреид и количества пищи на размножение 134 Использование энхитреид в контроле токсичности почв 134 Метод оценки функционального разнообразия на основе субстратиндуцированного дыхания почв с использованием
разных субстратов 134
Метод оценки пищевой активности " 135
Полевые исследования почвенных животных 135
Статистическая обработка данных 136
ГЛАВА 3. Видовые различия в воздействии модельных загрязнителей на Е. Albidus и Е. Crypticus 137
Результаты 137
Обсуждение - 14 2
ГЛАВА 4. Влияние плотности особей и ресурсов пищи на проявление токсических эффектов карбендазима У Е. Crypticus 14 8
Результаты. 148
Обсуждение 157
ГЛАВА 5. Проявление токсчности карбендазима у е. crypticus в разных почвах и донных отложениях .167
Результаты 167
Обсуждение 175
ГЛАВА 6. Оценка токсичности почв при помощи e-crypticus . 181
Лочва и донные отложения, загрязненные металлургическим производством 131
Результаты 182
A. Бефервайк (Нидерланды) 182
B. Косая Гора (Тульская обл.) 194
Почвы 194
Донные отложения 203
Обсуждение 209
Почвы 209
Донные отложения 213
Лосевы, загрязненные нефтью 215
Результаты . 216
А. Лугенецкое нефтяное месторождение 216
Б. Самотлор 222
Обсуждение - 224
Заключение 229
Выводы 239
Список литературы
- Основные токсиканты окружающей среды
- Организмы, используемые в экотоксикологии почв
- Определение максимальной водоудерживающей способности .
- Лочва и донные отложения, загрязненные металлургическим производством
Введение к работе
Актуальность.
Охрана почв от загрязнения подразумевает не только предотвращение выброса токсикантов в окружающую среду, восстановление нарушенных почв, но и контроль загрязнения на основе показателей состояния особей, популяций и сообществ почвенных организмов. С 1984 года в странах Европейского Союза (ЕС), США и Канаде существует стандартный тест оценки опасности новых синтезированных веществ для почвенных обитателей с дождевым червем Eisenia foetida. Хищные жуки, коллемболы, мокрицы, пауки рассматриваются в качестве подобных тест-объектов в Германии и США. За последние 10 лет в ЕС финансировались программы SERAS (Системы оценки риска экотоксичности почв) и SECOFASE (Тест системы оценки сублетальных эффектов веществ на фауну в почвенной экосистеме). Биотестированию почв были посвящены разделы программ «Экология России» и «Экологическая безопасность России».
Использование широкого круга модельных видов в тестирование химических веществ на искусственном субстрате позволяет оценить лишь относительную величину риска загрязнения почв. Потребности практики охраны почв сталкиваются с проблемами, главные из которых состоят в следующем:
Насколько сходна чувствительность к токсикантам у видов одной группы; . Как отражаются на чувствительности тест-объекта усло вия тестирования (ресурсы пищи, плотность особей при испыта нии) ;
Насколько данные, ^полученные при тестировании вещества на искусственном субстрате, соответствуют его эффектам в природных почвах;
Можно ли использовать тест-объеты, применяемые в тестировании новых веществ, в контроле загрязнения и восстановления почв.
Для решения этих проблем удобным объектом являются энхит-реиды, так как заселяют почвы и донные отложения, и хорошо культивируются в искусственных субстратах. Они были предложены для стандартизации в странах ЕС в качестве теста оценки опасности химических веществ в дополнению к дождевому червю.
Цели и задачи исследования.
Целью работы была оценка факторов, влияющих на использование энхитреид как тест-объекта в биотестировании и контроле загрязнения почв.
Для решения этой цели были поставлены следующие задачи-.
Рассмотреть видовые различия в действии модельных загрязнителей на Enchytraevs albidus и Е. crypticus.
Оценить влияние численности Е. crypticus и ресурсов пищи на размножение червей в искусственном субстрате загрязненном карбендазимом.
Сравнить воздействие карбендазима на выживаемость и размножение Е. crypticus в различных почвах и донных отложениях.
Оценить при помощи Е. crypticus токсичность почв, загрязненных тяжелыми металлами и сырой нефтью.
Научная новизна.
Впервые показано, что на проявление токсических эффектов модельного загрязнителя у энхитреид влияет количество пищи, а не плотность популяции. Выявле-на, что содержание органического вещества в почве и донных отложениях, а также реакция среды являются важными факторами, определяющих токсические эффекты в реальных почвах. Предложен метод использования Е. crypticus для контроля загрязнения почв, как тяжелыми металлами, так и сырой нефтью. Показано, что соединения кальция могут играть роль в проявлении токсических эффектов не только тяжелых металлов, но и органических соединений. Сопоставлено проявление кратковременных токсических эффектов у модельного вида энхитреид с состоянием популяций различных групп почвенных животных и микроорганизмов в загрязненных почвах. Защищаемые положения.
Биотестирование новых химических веществ с помощью энхитреид является важным дополнением к тестированию с помощью дождевого червя - стандартного теста в международной практике.
Особенности энхитреид позволяют оценить риск попадания в почву короткоживущих токсикантов.
Ресурсы пищи и плотность популяции являются важными факторами модифицирующими проявление токсических свойств поллю-тантов у почвенных животных.
Органическое вещество почвы и рН являются факторами, влияющими на действие токсикантов в реальных почвах.
Практическая аначимосаъ.
Предложенные методы оценки токсичности средств защиты растений с помощью энхитреид, также как и методы использования энхитреид в контроле загрязнения почв, могут применяться в практике экотоксикологической сертификации новых и импортируемых химических веществ, в частности пестицидов, детергентов, стимуляторов роста, и мониторинге загрязнений и процессов вое- становления почв после рекультивации. Результаты исследования вошли в отчет по стандартизации в странах ЕС нового теста для оценки опасности химических веществ с использованием энхитреид. Результаты работы используются в лекционных курсах и практических занятиях по прикладной экологии в Тульском государственном педагогическом университете им. Л.Н.Толстого и курсах «Биогеохимия почв» и «Почвенная биология» на Географическом факультете Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.
Благодарности.
Данное исследование выполнено в рамках проектов «Enchy-traeid Reproduction Ringtest» ( Umweltbundesamt (Германия) и и European Chemical Bureau), «Contamination-Induced Changes in a Detrital Food Chain» (NVO grant N047-002-009, Нидерланды), «Using Of Microcosms and Terrestrial Model Ecosystems In Ecotoxi-cological Studies» (NATO Linkage Grant), «Bioindication of Former Military Sites» (NATO Linkage Grant), ФЦП «Интеграция» № M0226 и РФФИ № 99-04-48577. Всем организациям финансово поддержавшим исследование, а также д-ру Йоргу Ромбке (J5rg ROmbke) (ЕСТ, F16rsheim, Germany), чл.-корр. РАН Д.А. Криволуцкому, к.б.н. Р.О.Бутовскому, к.б.н. В.В. Вознесенской, к.б.н. Ю.В. Дорофееву, А.С. Зайцеву, К.Б. Гонгальскому, О.А. Горячеву и моему руководителю д.б.н. А.Д. Покаржевскому я приношу искреннюю благодарность за предоставленные материалы и помощь в работе.
Основные токсиканты окружающей среды
Различают опасные и вредные факторы окружающей среды. Под опасным принято понимать такой фактор, воздействие которого на человека в определенных условиях может привести к травме или другому резкому ухудшению здоровья, а под вредным -воздействие которого приводит к заболеванию или снижению работоспособности. Это деление достаточно условно, так как в зависимости от уровня и продолжительности воздействия один и тот же фактор может рассматриваться и как вредный, и как опасный.
К настоящему времени сложилась определенная классификация вредных веществ по характеру воздействия: токсические - вызывающие отравление всего организма (окись углерода, циан, свинец, ртуть, мышьяк, бензол и др., а также их соединения); раздражающие - вызывающие раздражение дыхательного центра и слизистых оболочек (хлор, ам?лиак, ацетон, фтористый водород, циан, окислы азота и др.); сенсибилизирующее - вызывающие аллергические реакции (формальдегид, растворители и лаки на основе нитросоединений и т.п.) ; канцерогенные - вызывающие развитие раковых заболеваний (никель и его соединения, хром и его соединения, амины, асбест, бензоевая кислота и т.п.); мутагенные - вызывающие изменение наследственных признаков (свинец, марганец, стирол, радиоактивные вещества и т.п.); влияющие на репродуктивную функцию человека (ртуть, свинец, марганец, стирол, радиоактивные вещества и т.п.) (Нейман, 1998).
Таким образом, под ггоксиканотами окружающей среды понимают такие вредные вещества, которые распространяются в окружающей нас среде далеко за пределы своего первоначального местонахождения и в связи с этим оказывают более или менее скрытое вредное воздействие на животных или растения, а в ряде случаев на человека (Эйхлер, 1993).
Это могут быть природные ядовитые вещества, токсины. Под природными ядами понимают все ядовитые химические вещества природного происхождения независимо от их состава и строения, поражение которыми не сопровождается иммунными ответами организма. Токсинами называют химические вещества белковой природы растительного, животногб, микробного или иного происхождения, обладающие высокой токсичностью и способные при их применении оказывать поражающее действие на организм человека и животных. Существенным отличием токсинов от ядов небелковой природы является их способность при попадании в организм человека проявлять антигенные свойства и вырабатывать в нем иммунитет (Александров, Емельянова, 1990).
Однако, подлинные токсиканты - это, как правило, те ядовитые вещества, которые сам человек неосмотрительно включает в круговорот природы (Эйхлер, 1993). В связи с этим, пестициды составляют основное ядро токсикантов окружающей среды.
Пестицида (от лат. pestis - зараза и caedo - убиваю) -обобщающий термин для обозначения большой группы химических веществ. Часто для той же цели применяют понятия ядохимикаты и более узкое химические средства зашиты растений (ХСЗР) (Федоров, Яблоков, 1999).
Пестициды в отличие от всех других загрязнителей окружающей среды химической природы имеют ряд особенностей: 1. Пестициды не являются отходами производства, а вносятся в окружающую среду преднамеренно (Carson, 1962). 2. Не предотвратимость циркуляции их в биосфере. Применили вещество — и оно находится во внешней среде до полного распада. 3. Пестициды — химические вещества, предназначенные для уничтожения живого. Обладая биологической активностью, они потенциально опасны для живой природы и здоровья людей. 4. При использовании пестицидов создаются концентрации, способные уничтожить вредителей, но они могут быть опасными для живой природы и здоровья людей, однако уменьшать эти концентрации нельзя, потому что не будут уничтожены вредители. 5. Контакты больших масс населения с пестицидными препаратами в связи с циркуляцией их во внешней среде и наличием остатков в пищевых продуктах (Справочник по пестицидам, 1986).
Организмы, используемые в экотоксикологии почв
В Советском Союзе и в Современной России широко развивается направление биоиндикации почв, созданное трудами М.С.Гилярова и Д.А.Криволуцкого. Они рассматривают возможность использования тех или иных организмов для целей биоиндикации и мониторинга почв (Криволуцкий, 1994).
Так, почвенные простейшие и другие микроскопические животные — обитатели скоплений почвенной влаги, — хотя и отличаются высокой степенью космополитизма и убиквистности, по ряду причин не годятся для мониторинга на уровне вида и в первую очередь из-за очень высоких колебаний численности и нестандар-тизованности методов учета.
Среди почвенных микроартропод — обитателей почвенных полостей — также трудно найти объекты для мониторинга на уровне вида, поскольку многие виды связаны с определенными видами растений, узкими местообитаниями, и определение их видовой принадлежности под силу только специалистам по определенной группе микрофауны. С другой стороны, набор видов и соотношение численности основных групп микроартропод характерны для каждого типа почв, и резкие изменения в окружающей среде приводят к достаточно быстрой реакции комплекса микроартропод на эти изменения. При этом восстановление комплекса микроартропод может идти двумя путями: либо восстанавливается "старый" комплекс видов при восстановлении прежних условий окружающей среды, либо возникает новый в результате необратимых изменений в среде. Таким образом, микроартроподы удобны при мониторинге на уровне комплекса видов, тем более что именно микроартроподы часто являются единственными представителями животных организмов в сильно измененных антропогенных экосистемах: агроцено-зах, отвалах промышленных предприятий, свалках и местах захоронения отходов.
Гораздо предпочтительнее с точки зрения мониторинга на уровне вида крупные почвенные беспозвоночные, многие из которых живут в достаточно широком диапазоне экологических условий. Среда обитания представителей этой группы почвенной фауны — не мельчайшее скопление почвенной влаги, не полости и ходы в почве,, а вся почва как среда. Поэтому связь с изменениями почвенных условий, химизма почвенных растворов, гумуса у крупных почвенных животных гораздо теснее и отчетливее, чем у мелких. Ареалы многих видов хорошо известны, и их популяции на протяжении всего ареала имеют достаточно высокую численность. Важно и то, что среди крупных беспозвоночных много видов-полифагов, мало связанных с определенной группой растений или животных в своем питании. Среди них для целей мониторинга наиболее удобны представители следующих групп: дождевые черви, щелкуны и их личинки, крупные хищные жужелицы, некоторые виды мокриц и дип-лопод, а в аридных экосистемах — тараканы и чернотелки и их личинки.
Высокая степень оседлости этих групп, широкая пищевая база, хорошая изученность особенностей экологии, распределения, размеры ареалов, высокая численность в различных местообитаниях позволяют предложить виды из этих групп в качестве основных объектов экологического мониторинга за состоянием почвенной биоты. Как показывает опыт работы в Центрально-Черноземном заповеднике, упор должен быть сделан на наблюдения за определенной группой видов, доминирующих в естественных (эталонных; местообитаниях. Эти же виды определяют динамику численности и биомассы в экосистемах, находящихся под влиянием хозяйственной деятельности человека. Предпочтение следует отдавать почвенным, а не подстилочным формам, поскольку в ряде антропогенных местообитаний подстилка отсутствует. Почвенно-зоологические исследования проведены во всех заповедниках, имеющих статус биосферных, с разной степенью подробности. Но, используя эти данные, уже теперь можно выделить виды, за популяциями которых можно вести наблюдения. Почвенные раскопки и учет ловушками Барбера (стандартные методы учета численности и активности почвенной фауны) в рамках системы экологического мониторинга следует проводить не более трех раз в сезон. При этом должны рассматриваться возрастная и половая структуры популяции и ее биомасса, а также отбираться материал для определения концентрации загрязнителей и животных. Как показали последние исследования, беспозвоночные, в частности почвенные, отражают фактическую степень загрязнения экосистем, так как поглощают лишь подвижные формы элементов и пассивно не загрязняются. Кроме того, по некоторым группам почвенных беспозвоночных собран большой коллекционный материал, который дает возможность определить степень загрязнения экосистем (в том числе и в заповедниках) 30-40 лет назад.
Определение максимальной водоудерживающей способности .
Установка для определения состоит из следующих компонентов: пластиковый стакан - пластиковая воронка - фильтр (черная лента). В воронку на фильтр помещали навеску почвы приблизительно 20 г. На 10 проб делали один холостой опыт (без почвы).
В воронки приливали сначала 3.00 мл и затем после смачивания почвы еще 50 мл воды. После добавления последней дозы воды поверхность воронок закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и оставляли пробы на ночь. Утром фильтры с образцами и холостые фильтры перекладывали в предварительно взвешенные на электрических весах ВЛК-500 г-М чашки Петри (mi - масса пустой чашки Петри, г) . Взвесив чашки Петри с содержимым (т2 - масса пробы почвы с чашкой Петри до высушивания, г), помещали их в сушильный шкаф при температуре 105С. После высушивания до постоянного веса в течение 1 часа охлаждали чашки Петри с образцами в эксикаторе с безводным хлоридом калия, затем взвешивали (тз -масса пробы почвы с чашкой Петри после высушивания, г). Максимальную водоудерживающую способность почвы (МВС, %) рассчитывали по формуле: (m2 - mi) - (m3 - mi) МВС = . 100% (m3 - mi) Определение pH почвы.
Измерение рН почвы выполняли согласно методике Международной организации стандартов (ISO-10390:1994 (Е)). Перед определением отвешивали на электронных весах ВЛК-500 г-М с точностью до 0,01г в пластиковый стаканчик пробу почвы массой 5г (в пересчете на сухой вес). Взвешенный образец заливали 12,5мл 0,01М раствора СаС12 (1,47г СаС12 " 2Н20 растворяли в 1л дистиллированной воды при температуре 20С) или 12,5мл 1М раствора КС1 (74,5г растворяли в 1л дистиллированной воды при температуре 20С). Получившуюся суспензию взбалтывали в течение 5 минут, и оставляли на 2 часа для установления равновесия между раствором и почвой. После этого определяли рН раствора над почвой на рН-метре Consort Р 600 с точностью до 0,01 рН. Показатели токсичности (endpolnts) . NOEC - концентрация, при которой за исследуемый период не обнаруживается статистически достоверных различий с контролем; ЕСХ - концентрация, при которой за исследуемый период происходит снижение числа особей на Х% по отношению к контролю, LCso - концентрация, при которой за исследуемый период погибает 50% взрослых особей. -Проведение биотестирования.
Знхитреид из культуры пересаживали в чистую дистиллированную воду. Взрослые животные (с клителлиумом и яйцами) вносились по 10 штук в каждый экспериментальный сосуд. При помещении животных в экспериментальный субстрат следили, чтобы со взрослыми животными не попали мелкие, которые могут прикрепляться к поверхности тела взрослых особей. Для определения NOEC в контроле использовали 8 повторностей, в каждой испытываемой концентрации 4 повторности; для определения ЕСх соответственно по б и 2 повторностей. Сосуды хранились в течение 6 недель в случае E.albidus и 4 недель в случае Е-сг Ис-иэ в термошкафу при температуре 20±2С, относительной влажности воздуха 70-80% и световом режиме С:Т = 16:8. Еженедельно в сосуды добавляли воду до уровня 50-60% влагоемкости и пищу. Последнюю неделю пищу не добавляли. Взрослых животных из сосудов удаляли спустя три (E.albidus) или две недели {E.crypticus) . В конце эксперимента в каждый сосуд добавляли по 10 мл спирта и спустя 5 минут по 2-3 капли 1% р-ра Бенгалроз. Спустя сутки подсчитывали под бинокуляром молодых животных, окрашенных красителем в розовый цвет.
Определение влияния концентрации карбендазима, плотности онхитреид и количества пищи на размножение.
Был применен ортогональный план трехфакторного эксперимента с использованием трех уровней факторов: карбендазима -О, 10 и 20 мг/кг субстрата, числа взрослых E.crypticus - 10, 15 и 20 особей на сосуд и кол-ва пищи - 20, 40 и 60 мг на сосуд еженедельно. Всего было заложено 27 вариантов (по 4 по-вторности, в контроле - б) . Общее число вариантов - 108 (df=107). Процедура проведения эксперимента также как и при проведении биотестирования.
Использование знхитреид E.crypticus в контроле токсичности почв.
Тестируемая почва (10 г на сосуд) закладывалась в пластиковые 100 мл стаканчики (б повторностей). В качестве контрольной почвы использовали почву 0ECD (для получения рН почвы, близкого к 6,0 добавляли карбонат кальция) также в 6 повторах. При высокой токсичности почвы ее разбавляли почвой 0ECD в два, четыре и более раз в зависимости от токсичности исходной почвы и эксперимент повторяли. Остальные процедуры, как при тестировании.
Лочва и донные отложения, загрязненные металлургическим производством
Отношение молодые/выжившие взрослые = плодовитость Г = 2,05 - 1,93 К + 0,45 П - 0,74 Е- + 1,52 К2 - 0,47 К П 0,56 К Е + 0,35 П2 + 0,62 П Е - 0,1б Е2 {4} R2= 27,69 % R2 (применимый для данного числа степеней свободы) =21,05% Относительно невысокая величина изменчивости этого показателя по сравнению с другими возможно определяется тем, что его величина определяется влиянием факторов как на молодых, так и на взрослых особей и неопределенность при этом возрастает. Но ясно одно, что доминирующим фактором является концентрация токсиканта, который вероятно воздействует на функцию размножения.
Результаты оценки влияния плотности особей и ресурсов пищи на проявление токсических эффектов карбендазима у Е. crypticus отражены в виде графиков Парето (рис. 18), которые, как правило, используют, чтобы показать достоверность эффектов тех или иных факторов на те или иные показатели. Как ЕИДНО из рис. А достоверно на выживание взрослых особей Е. crypticus, влияют карбендазим и количество пищи, а также совместное воздействие карбендазима и пищи. Причем, влияние пищи и совместного действия карбендазима и количества пищи является положительным, в то время как влияние карбендазима - отрицательным. Плотность посадки особей как фактор не прямо, не в сочетании с другими факторами не воздействовал достоверно на выживание особей в том диапазоне этого фактора, который рассматривался в эксперименте.
Если оценивать число взрослых особей Е. crypticus после двух недель эксперимента в абсолютных величинах (рис. 18Б), то первое место по влиянию на данный показатель занимает плотность особей, что, само собой разумеется, поскольку число выживших естественно зависит от числа исходных особей в сосуде. На втором месте по ЕЛИЯНИЮ на число взрослых особей стоит карбендазим, который отрицательно воздействует на выживание животных.
Третье, четвертое и пятое места в этом ряду занимают соответственно такие факторы, как совместное действие карбендази-ма и пищи, совместное воздействие карбендазима и плотности особей, влияние пищи. При этом влияние пищи, а также пищи с кар-бендазимом - положительное, а воздействие карбендазима с плотностью особей - отрицательное. Очевидны отличия этого графика Парето от предыдущего. При оценке выживания в относительных величинах (% от исходного числа особей) лишь три фактора являются статистически достоверными, тогда как при оценке в абсолютных величинах числа особей пять факторов являются статистически достоверными. Это происходит за счет факторов, связанных с числом (плотностью посадки) особей.
На размножение Е. crypticus (число молодых особей в экспериментальном сосуде) достоверное отрицательное влияние в первую очередь оказывали карбендазим (как эффект, описываемый в линейной и квадратичной зависимостях), а также совместное воздействие карбендазима и плотности особей (рис. 18В).
Графики Парето, показывающие влияние отдельных факторов на А - выживание взрослых особей, Б - на число взрослых особей на сосуд после двух недель эксперимента, В - на число молодых на сосуд в конце эксперимента и Г - на отношение молодые/выжившие взрослые (плодовитость) в конце эксперимента. К - концентрация карбендазима, Е - исходное число энхитреид, П - количество пищи.
На плодовитость Е. crypticus, (отношения числа молодых особей к взрослым), достоверно влиял только карбендазим, и, естественно, отрицательно. Причем достоверное влияние было получено для воздействия карбендазима как линейного эффекта фактора, так и для эффекта, который описывается членом второго порядка уравнения регрессии. Влияние остальных факторов на плодовитость не было достоверным (рис. 18Г).
Рассматривая графики Парето и полученные уравнения регрессии можно отметить, что все коэффициенты уравнений, описывающие влияние карбендазима на рассмотренные показатели являются отрицательными, а описывающие влияние количества пищи и плотности энхитреид, положительными. Сложнее с совместным воздействием разных факторов. Действие карбендазима и плотности энхитреид для всех показателей отрицательное. Для взрослых особей совместное действие пищи и карбендазима положительное, а для молодых отрицательное, тогда как совместное действие количества пищи и числа энхитреид для взрослых особей отрицательное, а для молодых положительное. Все это говорит о том, что картина взаимоотношений между популяцией и ресурсами пищи даже в упрощенных условиях эксперимента достаточно запутана, не говоря уже о взаимоотношениях в природных популяциях.
