Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 11
Современный взгляд на проблему развития РВО 11
1.1 Классификация и клиническая картина РВО 12
1.2 Этиология и патогенез РВО 15
1.3 Микроциркуляция и методы исследования 30
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1 Характеристика пациентов 34
2.2 Офтальмологические методы исследования. . 36
2.3 Лабораторные методы исследования : 37
2.4 Генетические исследования 41
2.5 Исследование сосудистых показателей периферического кровотока .... 43
2.5.1 Лазерная допплеровская флоуметрия 43
2.5.2.Объемная компрессионная осциллометрия 46
2.6 Статистические методы обработки результатов исследования. . 47
Глава 3. Изучение системы гемостаза у пациентов с ретинальными венозными окклюзиями 49
Глава 4. Изучение липидного профиля и изменений антиоксидантной системы у пациентов с ретинальными венозными окклюзиями 62
Глава 5. Анализ полиморфизма -251т>а гена интерлейкина–8 у пациентов с ретинальными венозными окклюзиями 72
Глава 6. Исследование сосудистых показателей и микроциркуляции у пациентов с ретинальными венозными окклюзиями 83
Заключение 92
Выводы 100
Список литературы 102
- Этиология и патогенез РВО
- Микроциркуляция и методы исследования
- Лабораторные методы исследования
- Исследование сосудистых показателей и микроциркуляции у пациентов с ретинальными венозными окклюзиями
Этиология и патогенез РВО
Согласно механической теории, компрессия вены происходит чаще всего в месте АВ- перекреста. Поскольку артерия и вена сетчатки в области перекреста имеют общую адвентициальную оболочку, утолщенная артерия может сдавливать вену, что приводит к вторичным изменениям, таким как утрата эндотелиальных клеток вены и образование тромба, и в результате появляется угроза ОВЦВС. Общей адвентициальной оболочкой окружены также центральная артерия и вена позади решетчатой пластинки, вследствие этого атеросклеротически уплотненная артерия может сдавливать вену и создавать условия для окклюзии ЦВС. Подтверждением этой теории является исследование, проведенное в 1989 г. J. Duker и G. Brown, обнаружившим анатомическое соотношение артерии и вены в месте окклюзии в 26 глазах [74]. В 100% случаев артерия располагалась над веной, в контрольной группе такое соотношение выявлялось лишь в 65% случаев. J. Zhao наблюдал расположение артерии над веной в области окклюзии в 99% случаев при исследовании 106 глаз [198]. Аналогичные данные приводят Z. Du ; R. Feist ; S. Hamid , D. Weinberg; N. Christoffersen [65, 73, 77, 92, 188].
A. Akman наблюдал сужение артерии при ее положении над веной при 2,3,4-й степенях гипертонической ретинопатии. При положении вены над артерий не было достоверного сужения просвета ни при одной стадии ретинопатии [54].
В своих исследованиях P. Jefferies и соавт. изучали анатомические характеристики АВ-перекрестов у пациентов без ГБ в возрасте от 35 до 82 лет [104]. Было показано, что при расположении артерии над веной в области АВ-перекреста вена резко изменяет направление под артерией, в этом месте наблюдалось локальное расслоение базальной мембраны. Местное «спадение» (уменьшение просвета вены в зоне перекреста) вены выявлялось в 3 из 11 перекрестов вен над артерией, но ни отклонения, ни локального сужения, ни расслоения базальной мембраны не наблюдалось при таком расположении.
В исследованиях, проведенных Y. Muraoka и соавт., изучались морфологические характеристики ретинальных сосудов у пациентов с РВО с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) Spectralis HRA+OCT [138, 139]. Авторами было показано, что при ОВЦВС расположение артерии над веной наблюдалось в 17 глазах, расположение вены над артерией - в 8 глазах. В глазах, где артерия находилась над веной, вена лежала глубже, но ее просвет часто оставался сохранным, в том числе в области перекреста. При расположении вены над артерией вена сдавливалась между внутренней пограничной мембраной и артериальной стенкой в области АВ-перекреста. С помощью ОКТ был выявлен тромб в вене в 21 глазе и располагался ниже АВ-перекреста во всех случаях. Обнаружение тромба было достоверно связано с ишемическим типом ОВЦВС.
В пользу механической теории говорят исследования, посвященные роли артериосклероза, и соответственно кардиоваскулярных факторов риска в развитии РВО. У пациентов с артериосклерозом уплотнение и ригидность стенки ретинальной артерии могут приводить к сужению вены, стазу крови и как результат развитию тромбоза.
С другой стороны, G. Staurenghi показал, что такое соотношение наблюдается у сосудов второго порядка и не является важным при окклюзиях вен первого порядка [172]. Ряд авторов считают, что, поскольку большинство окклюзий происходит в местах АВ-перекрестов, где артерия расположена над веной, и у них имеется общая адвентициальная оболочка, ключевую роль в развитии РВО играют атеросклероз и гипертоническая ангиопатия. Однако существуют пациенты, у которых РВО развивается без наличия системных сосудистых заболеваний. Таким образом, механическая теория имеет и ряд недостатков. Не всегда окклюзия происходит в области АВ-перекреста [57]. Механическая теория не объясняет развитие тромбоза ретинальных вен у пациентов без наличия системных сосудистых заболеваний [134]. В этом случае на первый план выходит теория коагулопатий.
В основе теории коагулопатий лежит дисбаланс между тромбогенными факторами и антитромбогенной защитой. Известны следующие тромбогенные факторы: стимуляция или повреждение сосудистой стенки, активация тромбоцитов, активация факторов свертывания крови, ингибирование фибринолиза, застой крови (стаз). К защитным механизмам, препятствующим возникновению тромбоза, относятся: ненарушенная антикоагулянтная активность эндотелия, нормальное количество и функция естественных ингибиторов сериновых протеаз, клиренс активных протеаз гепатоцитами и ретикулоэндотелиальная система (РЭС), интактная фибринолитическая система.
По мнению ряда авторов, важное значение в развитии тромбоза, неоангиогенеза, ремоделирования сосудов, внутрисосудистой активации тромбоцитов и лейкоцитов играет дисфункция эндотелия [40, 51, 80, 95, 107, 122, 157, 180, 187, 193]. Эндотелиальная дисфункция является обязательным звеном всех сердечно-сосудистых заболеваний, включая атеросклероз, ишемическую болезнь, хроническую сердечную недостаточность [5, 14]. Эндотелиальная выстилка сосудов регулирует местные процессы гемостаза, пролиферации, миграции клеток крови в сосудистую стенку и сосудистый тонус. При нарушенной функции эндотелия наблюдается дисбаланс между факторами, обеспечивающими эти процессы.
Микроциркуляция и методы исследования
Генетические исследования проводили на базе Научно исследовательского института физико-химической медицины совместно с к.б.н. Т.В. Погодой и д.б.н. Э.В. Генерозовым.
Для анализа гена ИЛ-8 использовали геномную ДНК, выделенную из 5 мл крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Определение аллелей полиморфизмов проводили в ходе реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов реакции на времяпролетном масс-спектрометре (MALDIOF масс-спектрометрия). Для этого первоначально амплифицировали участки генов, несущие анализируемые полиморфизмы, в ходе полимеразной цепной реакции.
Амплификацию осуществляли в реакционной смеси, содержащей 66 мМ ТрисHCl, рН 9,0, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgCl2, по 100 мкМ каждого дНТФ, 1 Ед Taq-полимеразы («Promega», США) и по 2 пмоля каждого праймера в объёме 10 мкл. Реакцию амплификации проводили в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 («MJ Research», США). 35 циклов амплификации проводили в следующем температурном режиме: 94оС, 15 с, 58 0С, 15 с, 72 0С, 16 с; 35 циклов. Продукты амплификации анализировали в 2% агарозном геле. Для последующего проведения реакции минисеквенирования проводили дефосфорилирование концевых фосфатных групп дНТФ в постамлификационной смеси. Для этого инкубировали образцы с 1 единицей активности фосфатазы из антарктической креветки («New England BioLabs», Великобритания) при 37 0С в течение 30 мин с последующей инактивацией фермента прогреванием при 85 0С в течение 10 мин. Реакцию минисеквенирования проводили в 20 мкл реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCl pH 9.0; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 2.5 мМ MgCl2; по 0.2 мМ необходимых ддНТФ и/или дНТФ; по 3 пмоль каждого праймера и 2 Ед TermiPol DNA Polymerase («Solis Biodyne», Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты ДНК. Наработку продуктов минисеквенирования осуществляли по универсальному профилю: 940С 5 с, 580С 20 с720С 5 с, 40 циклов. Очистку продуктов реакции минисеквенирования проводили с помощью набора SpectroCLEAN Kit («Sequenom», США) согласно инструкции фирмы-производителя. Входящий в состав набора сорбент в количестве 8 мг растворяли в 16 мкл ультрачистой воды («Merck», Германия), после чего полученную суспензию в объеме 24 мкл вносили в пробирку с продуктами реакции минисеквенирования. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 15 мин. Затем осаждали сорбент центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант использовали для масс-спектрометрического анализа.
Аликвоту образца (0,3 мкл) наносили на предварительно высушенную на планшете AnchorChip (600 мкм, «Bruker Daltonics», Германия) матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты («Fluka», Германия) в 50% ацетонитриле («Merck», Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосновного («Fluka», Германия) и высушивали на воздухе. Все использованные растворители, включая воду («Merck», Германия), были только аналитической чистоты или специальные для масс спектрометрии. Спектры получали с использованием MALDI времяпролетного масс-спектрометра Reflex («Bruker Daltonics», Германия), оснащенного азотным лазером (=337 нм) с частотой импульсов до 20 Гц. Все измерения проводили в линейной режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением – 20 кВ, при накапливающем электроде – 18.65 кВ, фокусирующей линзе – 9.2 кВ и временем задержки анализатора – 400 н. Для получения каждого масс-спектра использовали 50 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы «Bruker Daltonics» (Германия): flexControl
Название метода «Лазерная допплеровская флоуметрия» отражает содержание этого способа диагностики. Для диагностики применяется зондирование ткани лазерным излучением; обработка отраженного от ткани излучения основана на выделении из зарегистрированного сигнала допплеровского сдвига частоты отраженного сигнала, пропорционального скорости движения эритроцитов; в ходе проводимых исследований обеспечивается регистрация изменения потока крови в микроциркуляторном русле – флоуметрия [22, 27, 28] .
Лабораторные методы исследования
Величина среднего потока крови, характеризующая перфузию в микроциркуляторном русле за определенный промежуток времени исследований, в исследуемых группах достоверно не отличалась. В отличие от 2-й группы у пациентов с РВО отмечалась существенно более низкая вариабельность микроциркуляции (параметры ПМ и Kv ПМ). Функции механизмов модуляции тканевого кровотока у пациентов с РВО были снижены, что подтверждает динамика среднего квадратического отклонения ПМ. При анализе показателя , отражающего временную изменчивость перфузии, было выявлено достоверное снижение показателя у пациентов с РВО в сравнении с 2-й группой. Большее значение свидетельствует о более глубокой модуляции кровотока в микроциркуляторном русле Снижение показателя свидетельствует об угнетении активных вазомоторных механизмов модуляции тканевого кровотока у пациентов 1-й группы в сравнении с 2-й. Коэффициент вариации также был достоверно выше у пациентов 2-й группы.
Полученные данные могут свидетельствовать о большей ригидности сосудистой стенки у пациентов с РВО.
Показатель 2-я группа 1-я группа Группасравнения неишемический тип РВО ишемический тип РВО ПМ, пф.ед. 1,000 0,573 0,900 0,530 0,927 0,392 3 ПМ, пф.ед. 0,371 0,898 0,704 0,017 0,042 0,957 3 Kv ПМ, %. 0,692 0,404 0,296 0,050 0,010 0,456 3 Примечание. Здесь и в табл. 21: 1 - контроль; 2 - осложненная ГБ; 3 – неишемический тип РВО; 4 – ишемический тип РВО
При оценке показателей в зависимости от типа и локализации окклюзии показатели изменчивости были достоверно выше у пациентов 2-й группы в сравнении с ишемическим типов ОВЦВС и неишемическим типом ОЦВС (табл. 19). Наибольшая модуляция кровотока регистрировалась у пациентов с наименьшими изменениями на глазном дне, в частности при развитии ОВЦВС по неишемическому типу. Повышение значений и Kv может быть обусловлено более интенсивным функционированием механизмов активного контроля микроциркуляции у данных пациентов.
На следующем этапе для выявления вклада отдельных механизмов контроля перфузии проводился анализ амплитудно-частотного спектра колебаний. Таблица 20. Значение амплитудно-частотного спектра показателя микроциркуляции у пациентов с РВО и осложненной ГБ
Оценка функционального состояние активных звеньев модуляции кровотока показала нарушение регуляторных влияний тонуса микрососудов у пациентов с РВО. Анализ полученных значений выявил снижение вклада всех активных факторов контроля перфузии у пациентов 1-й группы в сравнении с контрольной и 2-й группой (табл. 20, 21). Активные факторы регуляции модулируют поток крови со стороны сосудистой стенки и реализуются через ее мышечную составляющую. Снижение амплитуды «активных» звеньев свидетельствует о снижении модуляции кровотока со стороны данного механизма регуляции. Уменьшение амплитуд миогенных и нейрогенных колебаний свидетельствует о повышенном тонусе сосудов в указанных группах, что приводит к ухудшению кровоснабжения тканей. Снижение амплитуд миогенных колебаний является следствием усиления жесткости сосудистой стенки из-за выраженной активации симпатических вазомоторных волокон. Снижение амплитуд эндотелиальных колебаний свидетельствует об эндотелиальной дисфункции. Для более точной оценки функции эндотелия в дальнейшем пациентам была проведена окклюзионная проба.
Основной вклад в объемные характеристики микрокровотока вносят «пассивные» звенья модуляции микрогемодинамики Оценка вклада пассивных факторов в контроль микроциркуляции выявила снижение влияния дыхательных колебаний в общий уровень тканевой перфузии. Влияние пульсовых колебаний, отражающих объем притекающей к микроциркуляторному руслу артериальной крови не изменилось.
У пациентов с ишемическим типом РВО достоверно выше был нейрогенный тонус, в сравнении с остальными группами: по отношению к контрольной группе р=0,014, к 2-й группе р=0,005, к неишемическому типу РВО р=0,024, что вероятнее всего говорит о возрастании активности симпатических нервов-вазоконстрикторов и, как следствие, повышении жесткости сосудистой стенки (см. табл. 20). Таблица 21. Достоверность различий значений амплитудно-частотного спектра показателя микроциркуляции у пациентов в исследуемых группах При сравнении полученных интегральных показателей у всех пациентов и группы контроля выявлено преобладание миогенной, нейрогенной и эндотелиальной регуляции перфузии над дыхательным и кардиальным механизмом регуляции микроциркуляции тканей.
Исследование сосудистых показателей и микроциркуляции у пациентов с ретинальными венозными окклюзиями
Несмотря на успехи современной кардиологии, во всем мире отмечается рост сердечно-сосудистых заболеваний, в основе которых лежат нарушения микроциркуляции и дисбаланс редокс-системы. Во многих случаях сердечно-сосудистые заболевания протекают с выраженным снижением зрения из-за развития окклюзионных поражений на глазном дне. Распространенность окклюзий ретинальных вен на фоне ГБ стремительно растет и составляет 1,6% среди лиц старше 49 лет. Острая социальная значимость проблемы диктуется возможностью инвалидизации пациентов после перенесенного заболевания, в том числе лиц трудоспособного возраста.
Несомненно, осложнения ГБ развиваются на фоне изменения гемостаза. В последние годы появилось большое количество исследований, показывающих влияние редокс- и иммунной систем на течение заболевания. В связи с этим целью нашего исследования было изучение вклада коагуляционного, антикоагуляционного, фибринолитического звеньев гемостаза, редокс- и иммунной систем, обмена липидов, полиморфизма гена интерлейкина-8 и функционального состояния микроциркуляции в формировании патологических изменений на глазном дне у пациентов с РВО.
В исследование было включено 180 пациентов. Согласно задачам исследования, все пациенты были разделены на 3 группы. В 1-ю группу (120 человек) были включены пациенты с РВО. 1-я группа была разделенная на 4 подгруппы: по локализации (ЦВС или ветвь) и типу окклюзии (ишемический или неишемический), во 2-ю группу были включены 20 пациентов с ГБ III стадии 3 степени очень высокого риска, перенесших ишемический инсульт головного мозга, 3-ю группу составили 40 человек соответствующей возрастной группы без клинических проявлений атеросклероза, ГБ и онкологических заболеваний. Всем пациентам выполнялось стандартное офтальмологическое обследование, ФАГД, ОКТ. Лабораторные методы исследования включали: биохимический анализ крови, гемостазиограмму, оценку состояние редокс-системы, генетическое исследование: определение полиморфизма гена ИЛ-8. Для оценки микроциркуляции использовали лазерную допплеровскую флоуметрию и объемную компрессионную осциллометрию.
При анализе гемостазиограммы у пациентов с осложненной ГБ и РВО были выявлены сходные нарушения. Так в данных группах были повышены активность факторов протробинового комплекса (% пр Квику), РФМК и фибриноген, что является доказательством активации системы свертывания. (табл.24). Известно, что в физиологических условиях тромборезистентность сосудистой стенки, синтезирующей и секретирующей атромбогенные вещества с целью предотвращения чрезмерной активации гемостатической системы, преобладает над тромбогенным потенциалом, необходимым для гемостатического ответа. Кроме того, вещества с атромбогенной активностью влияют не только на гемостаз, но и на базальный тонус сосудов, их проницаемость, чувствительность к вазоактивным препаратам. Также подтверждено, что гемостазиологические изменения являются следствием замедления кровотока, увеличения содержания коагулирующих факторов, угнетения противосвертывающей системы крови. В нашем исследовании анализ коагуляционного звена гемостаза показал значительную гиперкоагуляцию без существенной статистической разницы между группами с неишемическим типом ОЦВС и ишемическим типом ОВЦВС, у которых отсутствовал адекватный ответ антикоагулянтного звена на возникновение гиперкоагуляции, особенно проявляющийся у пациентов с ишемическим типом ОЦВС (табл. 25). . Таблица 24. Изменения лабораторных показателей в исследуемых группах по отношению к контролю (р 0,05)
Согласно свободнорадикальной теории, прогрессирование сосудистых окклюзионных заболеваний про исходит за счет повреждения свободными радикалами, гидроперекисями и окисленными липопротеинами низкой плотности биополимеров, входящих в состав клеточных мембран сосудистой стенки. С возрастом в организме нарастает интенсивность окислительного повреждения биомолекул и тканей, развивается окислительный стресс с нарушением целостности сосудистой стенки, являющимся фактором, способствующим развитию окклюзионных процессов на глазном дне. Наличие хронического аутоиммунного компонента служит благоприятным фоном для поражения капиллярного русла, развития множественных микроокклюзий и ишемизации окружающих тканей, что и регистрируется при помощи ФАГД при ишемическом типе РВО. Для изучения гипотезы о влиянии аутоиммунного воспаления на клинические проявления РВО был осуществлен генетический анализ полиморфизма гена ИЛ-8, отвечающего за синтез ИЛ-8, одного из главных провоспалительных цитокинов, являющегося мощным хемоаттрактантом для нейтрофилов и влияющего на пристеночное образование тромба. Наиболее выраженный макулярный отек достоверно регистрировался в группе с полиморфизмом -251T A промоторного участка гена ИЛ-8 в двух хромосомах по сравнению с группой, где такой полиморфизм не был выявлен (р=0,05). Ангиографическая картина глазного дна данной группы характеризовалась выраженным экстравазальным выходом флюоресцеина как из сосудов мелкого, так и крупного калибра с прокрашиванием сосудистой стенки, также выраженным отеком ДЗН.
Трудности изучения микроциркуляции обусловлены очень малыми размерами микрососудов и сильной разветвленностью внутриорганных сосудистых сетей. В настоящее время в нашей стране в клиническую практику активно входят различные методы исследования микроциркуляции крови человека с использованием лазерной допплеровской флоуметрии. Данный метод основан на определении перфузии ткани кровью путем измерения допплеровского сдвига частот, возникающего при зондировании ткани лазерным излучением, с последующей регистрацией излучения, отраженного от подвижных и неподвижных компонентов ткани. Метод позволяет определить соответствие между объемом функционирующего сосудистого русле и объемом циркулирующей по нему крови.
Микроциркуляция у пациентов 1-й группы характеризовалась меньшей вариабельностью и менее глубокой модуляцией в сравнении с 2-й группой (табл. 26). Анализ полученных значений выявил у пациентов с РВО нарушение микроциркуляции, сопровождающееся снижением всех активных факторов контроля перфузии (табл. 27).
