Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Этиология, патогенез, классификация помутнений задней капсулы хрусталика.
1.2. Хирургические методы профилактики помутнений задней капсулы хрусталика.
1.3. Фармакологические методы профилактики помутнений задней капсулы хрусталика .
1.4. Основы фотодинамической терапии. Ее применение в офтальмологии.
1.5. Характеристика отечественного фотосенсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин».
ГЛАВА 2. Отработка параметров фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором хлоринового ряда «Фотодитазин» на культуру пролиферирующих клеток хрусталика. (Экспериментальные исследования in vitro)
2.1. Материалы и методы. 39
2.2. Методика получения пролиферирующей клеточной культуры хрусталика.
2.3. Влияние различных концентраций фотосёнсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин» и доз лазерного излучения на жизнеспособность культуры клеток хрусталика .
2.4. Определение оптимальной экспозиции фотосенсибилизатора на культуру клеток хрусталика для достижения цитофотоксического эффекта .
ГЛАВА 3. Оптимизация параметров лазерного излучения для интраоперационной интракапсулярной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором хлоринового ряда «Фотодитазин».
ГЛАВА 4. Оценка эффективности интраоперационной интракапсулярной фотодинамической терапии с Фотодитазином для профилактики помутнений задней капсулы хрусталика после факоэмульсификации. (Экспериментальные исследования in vivo)
4.1. Материалы и методы. 72
4.2. Результаты биомикроскопии и офтальмоскопии. 79
4.3. Результаты электроретинографии. 83
4.4. Результаты световой микроскопии . 87
4.5. Рекомендации по применению интраоперационной интракапсулярной фото динамической терапии с фотосенсибилизатором хлоринового ряда «Фотодитазин».
Резюме 99
Заключение 100
Выводы 108
Список литературы
- Фармакологические методы профилактики помутнений задней капсулы хрусталика
- Влияние различных концентраций фотосёнсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин» и доз лазерного излучения на жизнеспособность культуры клеток хрусталика
- Определение оптимальной экспозиции фотосенсибилизатора на культуру клеток хрусталика для достижения цитофотоксического эффекта
- Результаты световой микроскопии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Профилактика помутнений задней капсулы хрусталика, получивших название фиброза или вторичной катаракты, до сих пор сохраняет свою актуальность и значимость в офтальмологии. Согласно статистическим исследованиям, особенно часто помутнение задней капсулы хрусталика (ПЗК) диагностируется у пациентов старшей возрастной группы (до 50%), детей (до 93,2%), а также у больных с системными, синдромными заболеваниями и сопутствующей глазной патологией (до 70,7%) (Егорова Э.В., 2003; Зубарева Л.Н., 1993; Nishi O., 2003).
На сегодняшний день основной причиной развития этого специфического осложнения катарактальной хирургии принято считать послеоперационную пролиферацию и распространение по поверхности задней капсулы хрусталика сохранившегося субкапсулярного эпителия, так как очевидно, что даже при самой тщательной механической очистке капсульной сумки в ходе операции никогда не удается полностью удалить хрусталиковые массы (Касимова Д.П., 2004; Disk B., 1996; Spalton D.J., 1999). Кроме того, немаловажным предрасполагающим фактором является особенность анатомического расположения герминативной зоны, делающей невозможной визуальный контроль полной эвакуации клеточных элементов во время отмывания хрусталиковых масс (Богословский А.И., 1962).
В настоящее время на решение проблемы профилактики ПЗК хрусталика направлен целый ряд мероприятий. В литературе обсуждается значение методик вскрытия передней капсулы, необходимость тщательного выполнения каждого узлового этапа операции, роль дизайна и материала интраокулярной линзы (ИОЛ), целесообразность имплантации интракапсулярных колец и т.д. (Зуев В.К., 1999; Егорова Э.В., 2002; Иошин И.Э., 2004; Brinci H., 1995; Hara T., 1996). Кроме того, анализируются различные фармакологические способы профилактики ПЗК, включающие применение лидокаина, гепарина, протеолитических ферментов, цитостатиков, ингибиторов факторов роста и др. (Двали М.Л., 1998; Behar-Cohen F.F., 1995; Mastopasqua L., 1997; Nagamoto T., 1997, Nishi O., 1998).
В этой связи следует отметить, что в последние годы наблюдается возрастающий интерес к фотодинамической терапии (ФДТ), широко применяющейся для лечения опухолевых заболеваний различных локализаций, а также ряда заболеваний неопухолевой природы (Копаева В.Г., 1993; Андреев Ю.В., 1993; Миронов А.Ф., 1996; Каплан М.А., 1998; Будзинская М.В., 2004; Jori G., 1996).
Помимо применения ФДТ в офтальмоонкологии и лечении неоваскулярных мембран различной этиологии (Аветисов С.Э., Лихванцева В.Г., 2003; Белый Ю.А., 2004; Тахчиди Х.П., 2008; Arroyo J.G., 2003), в отдельных публикациях приводятся положительные результаты экспериментальных исследований по использованию ФДТ для профилактики ПЗК. Как правило, они касаются изучения влияния различных фотосенсибилизаторов (ФС) на клеточные культуры хрусталика in vitro, и лишь единичные исследования посвящены оценке антипролиферативного эффекта водных растворов некоторых ФС на глазах экспериментальных животных (Koh H.J., 2002; Van Tenten Y., 2002; Melendez R.F., 2005).
По мнению многих исследователей, наиболее перспективными для ФДТ различной офтальмопатологии следует считать ФС хлоринового ряда (Пономарев Г.В., Решетников А.В., 1999; Лощенов В.Б., 2003; Белый Ю.А., 2007). Среди отечественных ФС хлоринового ряда следует выделить «Фотодитазин», «Радахлорин», «Фотолон». При этом в «Фотодитазине» имеется существенно меньшее (не более 3,5%) сопутствующих примесей по сравнению с аналогами, что обуславливает его большую эффективность (Каплан М.А., 2004; Решетников А.В., 2005; Белый Ю.А., 2008).
Интерес к возможности использования ФДТ в профилактике послеоперационных ПЗК хрусталика, нерешенность на сегодняшний день целого комплекса вопросов, касающихся доз ФС и лазерного излучения, влияния ФС на ткани глаза, оптимального способа доставки ФС к капсуле хрусталика и послужили основанием к проведению настоящих исследований.
Цель исследования – разработать и обосновать в эксперименте методику интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» для профилактики помутнения задней капсулы хрусталика.
В соответствии с поставленной целью задачи решались в следующей последовательности:
1. Создать экспериментальную модель пролиферирующих клеток хрусталика, участвующих в развитии помутнения его задней капсулы.
2. В экспериментах in vitro определить оптимальную концентрацию и экспозицию «Фотодитазина», а также дозу лазерного излучения для проведения фотодинамической терапии.
3. С помощью методов математического моделирования оптимизировать параметры дозы лазерного излучения для проведения интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин».
4. Разработать способ доставки рассеянного лазерного излучения к капсуле хрусталика в ходе интраоперационной фотодинамической терапии.
5. В экспериментах in vivo разработать методику проведения интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в ходе факоэмульсификации и оценить реакцию герминативной зоны хрусталика на применение разработанной методики.
Научная новизна
1. Cоздана экспериментальная модель пролиферирующих клеток хрусталика, которая состоит из эпителиальных и фибробластоподобных клеток, участвующих в развитии помутнения задней капсулы. Данная модель пригодна для выполнения последующих скрининговых исследований по профилактике помутнения задней капсулы хрусталика в условиях in vitro.
2. На созданной культуре пролиферирующих клеток хрусталика in vitro определены оптимальные параметры фотодинамической терапии с препаратом «Фотодитазин»: экспозиция фотосенсибилизатора 1 минута, концентрация 0,01 мг/мл, доза лазерного излучения 5 Дж/см.
3. На основании математического моделирования оптимизированы параметры лазерного излучения для проведения интраоперационной фотодинамической терапии.
4. Разработан способ доставки рассеянного лазерного излучения для проведения интраоперационной фотодинамической терапии посредством изогнутого световода, позволяющего равномерно распределять лазерное излучение во все направления и свободно манипулировать в передней камере глаза, не прибегая к дополнительным разрезам во время операции.
5. В экспериментах in vivo на основе клинико-функциональных и морфологических исследований доказана высокая эффективность интраоперационной фотодинамической терапии для профилактики помутнения задней капсулы хрусталика.
Практическая значимость
Проведенный комплекс экспериментальных исследований позволил разработать новый безопасный интраоперационный интракапсулярный способ профилактики послеоперационных помутнений задней капсулы хрусталика, использование которого в клинической практике катарактальной хирургии позволит значительно снизить риск развития данного осложнения, благодаря выраженному фотодинамическому эффекту воздействия, обладающего высокой антипролиферативной активностью.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработанная методика интраоперационной фотодинамической терапии в ходе ультразвуковой факоэмульсификации является высокоэффективным и безопасным для тканей глаза энергетическим воздействием, обладающим выраженным фотодинамическим эффектом с высокой антипролиферативной активностью.
Использование интраоперационной фотодинамической терапии с «Фотодитазином» в ходе ультразвуковой факоэмульсификации позволяет значительно снизить риск развития послеоперационных помутнений задней капсулы хрусталика.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции офтальмологов Причерноморья (Анапа, 2006 г.), клинической конференции ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» (Москва, 2006 г.), II Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007 г.), Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза» (Оренбург, 2007 г.), республиканской конференции «Новые технологии в офтальмологии» (Казань, 2008 г.), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения-2008» (Москва, 2008 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 4 – в центральной печати. Получены патент РФ на изобретение, патент РФ на полезную модель.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 43 рисунками, содержит 6 таблиц. Указатель литературы включает 166 источников, из них 61 отечественный и 105 зарубежных.
Работа выполнена в Калужском филиале ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии» (директор – к.м.н., заслуженный врач РФ А.В. Терещенко). Экспериментальные исследования на культуре эпителиальных клеток хрусталика in vitro проведены на базе НИИ трансплантологии и искусственных органов РАМН (г. Москва) в лаборатории биотехнологии стволовых клеток (зав. лабораторией, д.м.н., проф. Н.А. Онищенко) при участии старшего научного сотрудника, к.б.н. М.Е. Крашенинникова и врача-иммунолога, д.м.н. А.А. Темнова. Морфологические исследования выполнены в ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» на базе патогистологической лаборатории под руководством к.м.н. А.В. Шацких.
Фармакологические методы профилактики помутнений задней капсулы хрусталика
Многочисленные публикации последних лет, посвященные современной ФЭ катаракты, убедительно свидетельствуют о том, что профилактика образования послеоперационных ПЗК хрусталика охватывает целый комплекс мероприятий [19, 26, 30, 129, 130, 59, 60, 89, 126, 125, 133, 148, 158].
Среди них немаловажное значение имеет тщательность выполнения узловых этапов операции. Так, анализ результатов ФЭ позволил установить четкую зависимость частоты формирования ПЗК от способа очистки капсульного мешка от кортикальных масс. D. Apple (2000г.) отметил, что разделительная кортикальная гидродиссекция позволяет не только оптимизировать проведение последующих этапов операции (фрагментация ядра, аспирация хрусталиковых масс), но и в отделении кортикальных экваториальных масс и, тем самым, максимальном удалении экваториального эпителия [59]. В то же время, исследования, проведенные австрийскими офтальмологами, показали, что полировка передней капсулы после факоэмульсификации катаракты может стать причиной развития помутнения задней капсулы, так как удаленный с передней капсулы эпителий, необходимый для возникновения адгезии передней и задней капсулы к краю оптической части ИОЛ, способствует беспрепятственному распространению Е-клеток [64, 69].
На сегодняшний день ни у кого уже не вызывает сомнений влияние типа капсулорексиса на частоту развития ПЗК. По мнению Н. Birinci (1999г.)[69], при выполнении непрерывного кругового капсулорексиса ПЗК хрусталика встречается практически в 2 раза реже (11,5%), чем при "envelope capsulectomy" (24,5%). При этом V. Аукап и соавторы (2003) отмечают, что снижение процента ПЗК становится особенно заметным при диаметре непрерывного капсулорексиса не менее 5 мм, т. е. когда его край заходит за край оптической части ИОЛ. С точки зрения этих авторов, при уменьшении диаметра капсулорексиса происходит адгезия листка передней капсулы хрусталика с оптикой ИОЛ, что приводит не только к большей частоте ПЗК, но и к контрактуре капсульного мешка [42, 59, 147].
Одним из важных факторов, замедляющих пролиферацию и миграцию хрусталикового эпителия и, соответственно, сдерживание развития ПЗК, является имплантация ИОЛ. Наличие любого типа ИОЛ в капсульном мешке ассоциируется с меньшим количеством развития ВК, чем при афакии. Так Алексеев Б.Н. (1997г.) впервые сообщил о методе имплантации ИОЛ, который однозначно положительно влиял на сдерживание пролиферации и миграции хрусталикового эпителия. Следует уточнить, что эволюция представлений о роли материала, дизайна и способа фиксации ИОЛ в профилактике развития вторичных катаракт прослеживается в литературе с 70-х годов прошлого столетия [110,121-, 125,127, 129, 133, 135, 148].
Согласно сравнительным результатам ФЭ катаракты с имплантацией ИОЛ из различных материалов, при имплантации силиконовых ИОЛ развитие ПЗК отмечается.в 33,5%, ИОЛ из ПММА - в 43,65%, ИОЛ из гидрогеля- в 63% и лишь в 11,75%) - при имплантации ИОЛ из гидрофобного акрила. Данное обстоятельство объясняется высокой адгезивной способностью гидрофобного акрила (в 3 раза выше ПММА), за счет чего ИОЛ имеет более плотный контакт с задней капсулой хрусталика, что затрудняет миграцию клеток хрусталикового эпителия в пространство между ИОЛ и капсулой [121, 125, 127].
В настоящее время экспериментально и клинически доказано, что на частоту встречаемости ПЗК хрусталика при имплантации ИОЛ влияют не только адгезивные свойства материала ИОЛ, но и дизайн ее оптической части. Так, в ходе морфологических исследований глаз подопытных животных с ИОЛ из ПММА и гидрофобного акрила с одинаковым дизайном оптики (прямоугольные оптические края) P. Ursell и Е. Hollick (2002г.) в обоих случаях обнаружили прозрачность задней капсулы хрусталика [126, 129]. При этом миграция Е-клеток прекращалась у оптического края ИОЛ, где формировалось большое кольцо Зоммеринга. Препятствие миграции эпителиальных клеток было обусловлено изгибом в прилегающей задней капсуле, созданным обрубленным прямоугольным краем оптики ИОЛ. При проведении аналогичных исследований с ИОЛ из тех же материалов, но круглыми краями оптики, Nagata и Watanabe (2000г.) в обоих случаях были обнаружены ПЗК хрусталиков. Основываясь на результатах эксперимента, авторы пришли к заключению о важной роли дизайна оптики ИОЛ в предупреждении развития ПЗК хрусталика [133, 135].
До сих пор спорным остается вопрос об оптимальном диаметре оптики ИОЛ. По данным О. Nishi и К. Nishi (1998г.) известно, что однокомпонентная акриловая ИОЛ с диаметром оптики 5,5 мм обладает барьерными функциями, за счет формирования изгиба задней капсулы хрусталика у прямого края ИОЛ [131]. При большем и меньшем размерах оптики монолитные ИОЛ не проявляют такой способности, что повышает риск развития ПЗК в случаях их имплантации, соответственно, в 25 и 40% случаев [ПО, 148]. Что касается влияния на частоту ПЗК диаметра оптики трехкомпонентных акриловых ИОЛ, то их имплантация, наоборот, свидетельствует в пользу большего диаметра оптики, который ассоциируется с меньшими изменениями задней капсулы [30, 147].
Следует отметить высокий, по данным литературы, процент ПЗК в случаях имплантации piggy-back ИОЛ, причем выше в группе с biconvex (двояковыпуклые) ИОЛ (32,5%), в сравнении с plano-convex (плосковыпуклые) ИОЛ (5,9%), где плотный контакт оптики с задней капсулой хрусталика тормозит миграцию на нее Е-клеток [122, 123, 153].
Влияние различных концентраций фотосёнсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин» и доз лазерного излучения на жизнеспособность культуры клеток хрусталика
Согласно данным литературы, наиболее предпочтительными ФС для ФДТ в глазной патологии являются препараты хлоринового ряда, обладающие следующими преимуществами: наличием интенсивного максимума поглощения в инфракрасной области спектра; высокой фотохимической активностью при малых дозах препарата; малым временем накопления; быстрой элиминацией из организма; низкой общей фототоксичностью; возможностью- получения из доступного, природного сырья [6, 7, 28; 34, 142].
К отечественным ФС хлоринового: ряда, относятся- ч «Фотолон», «Радахлорин» и «Фотодитазин». При этом в «Фотодитазине» имеется существенно меньше (не более 3,5%) сопутствующих примесей, чем в «Радахлорине»- и «Фотолоне», что указывает на его большую эффективность в сравнении с аналогами[3; 44].
Однако, несмотря- на существующее мнение о предпочтительности использования в, ходе. ФДТ ФС хлоринового ряда при лечении различных офтальмопатологий, в литературе до сих пор отсутствуют сведения об их локальном интраокулярном применении- и влиянии на внутриглазные структуры.
Экспериментальные исследования in vitro, представленные в данной главе диссертационной работы, являясь первым этапом в изучении возможности применения отечественного ФС хлоринового ряда «Фотодитазин» в ходе ФЭ для профилактики послеоперационных ПЗК хрусталика, включают: разработку методики получения культуры пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика и обоснование ее пригодности в качестве скрининговой модели для выполнения последующих исследований в условиях in vitro; - оценку степени выраженности фотодинамического эффекта на культуру пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика; - определение оптимальных экспозиции и концентрации ФС «Фотодитазин», а также дозы ЛИ на культуру пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика для выбора адекватных параметров ФДТ в профилактике ПЗК.
В связи со сходным морфологическим строением хрусталика кролика и человека для создания органной клеточной культуры эпителиальных клеток хрусталика использованы 4 энуклеированных глаза 2-х кроликов породы шиншилла.
Выделение тканей проводилось под визуальным контролем налобных линз с 4-кратным увеличением при помощи микрохирургического инструментария (склеральные ножницы, ножницы Ваннаса, пинцет, шпатель).
Для культивирования клеток применялась ростовая среда DMEM/Ham s F-12 («Sigma», USA) и С02 инкубатор TGO 150 («Joan», Франция) (рис. 5). Рис. 5. С02 инкубатор IGO 150, «Joan» (Франция)
Оценку цитофототоксического действия ФДТ осуществляли путем измерения митохондрпального дыхания живых клеток в культуре по методу Т. Mosmann и A. Monks [119, 120] - МТТ-тест. Для этого в 96-луночный культуральный планшет вносили анализируемые клетки в ростовой среде, после чего добавляли к ним 50 мкл 1мг/мл раствора МТТ (диметилтиазолил дифенилтетразолия бромид) в забуференном физ. растворе до получения конечной концентрации 200 мкг/мл. После этого планшет с культурой планшет с выпавшими кристаллами центрифугировали в центрифуге CR Зі («Joan», Франция) (рис. 7) в течение 10 минут при 1500 об/мин. Далее надосадочную жидкость аккуратно удаляли отсасыванием и вносили 200 мкл ДМСО (диметилсульфоксид) для растворения кристаллов и образования окрашенного раствора. Значения оптической плотности снимали при помощи планшетного анализатора иммуноферментных реакций «Униплан» АИРФ-01 (ЗАО «Пикон», Россия) (рис. 8).
Цитотоксический эффект фотодинамической терапии с ФС хлоринового ряда исследовали по продукции активных форм кислорода эпителиальными клетками хрусталика методом хемилюминесценции с помощью хемилюминометра («LKB-2», Швеция) (рис. 9). Запись кривых хемилюминесцентнои реакции проводили в течение 15 минут при температуре 37С. В качестве усилителя свечения использовали люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) («Sigma», USA) в конечной концентрации а в качестве активатора образования активных форм кислорода применяли РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) («Sigma», USA) в концентрации 10"5М.
Определение оптимальной экспозиции фотосенсибилизатора на культуру клеток хрусталика для достижения цитофотоксического эффекта
На сегодняшний день в литературе имеются отдельные публикации, в которых отмечается эффективность применения фотодинамической терапии для профилактики вторичной катаракты [102, 117, 155]. В основном эти исследования касаются изучения влияния различных фотосенсибилизаторов (бенгала розового, индоцианина зеленого и трипанового синего) на клеточные культуры in vitro. Кроме того имеются сведения об использовании в эксперименте водного раствора бактериохлорина а у экспериментальных животных [155]. Однако наряду с выраженным цитотоксическим эффектом ФДТ на герминативную зону хрусталика авторы уже в первые дни после фотодинамической терапии обнаруживали повреждение окружающих тканей - роговицы, радужки и цилиарного тела.
В связи с этим мы сочли целесообразным использовать гелевую форму ФС для проведения интраоперационной интракапсулярной ФДТ. Это позволяет локализовать ФС внутри капсульного мешка хрусталика, избегая его контакта с окружающими тканями. В качестве фотосенсибилизирующего геля нами применялся гель-пенетратор лазерного излучения, содержащий 0,01 мг/мл ФС «Фотодитазин» в гелевой форме на основе вискоэластика «Визотон-ПЭГ» (регистрационное удостоверение № ФС 012а2006/4192-06 от 27.12.06). В ходе ранее проведенных исследований [37] было доказано, что среда вискоэластика является химически инертной для действующего вещества, а также не препятствует проведению лазерного излучения. Кроме того, используемая молекулярная масса вискоэластика не препятствует контакту фотосенсибилизатора с герминативной зоной хрусталика. Однако сложность доставки лазерного излучения в капсульный мешок хрусталика диктует необходимость внесения соответствующих поправок в теоретические расчеты дозы ЛИ. Во-первых, это обусловлено тем, что распространение ЛИ в объеме отличается от такового, проецируемого на поверхность. Этот факт явился основанием для расчета объемной дозы лазерного излучения, эквивалентной поверхностной. Во-вторых, известно, что внутри тканей на распространение лазерного излучения влияет поглощение, которое приводит к изменению параметров ФДТ. Кроме того, согласно результатам экспериментальных исследований in vitro, подробно изложенных в предыдущей главе настоящей диссертационной работы, известно, что раствор «Фотодитазина» снижает мощность лазерного излучения за счет ее поглощения молекулами ФС. Данное обстоятельство потребовало определения коэффициента поглощения ЛИ (а) в фотосенсибилизирующем геле, содержащего 0,01мг/мл «Фотодитазина», необходимого для продолжения экспериментальных исследований in vivo, направленных на отработку методики интраоперационной интракапсулярной ФДТ в профилактике ПЗК после ФЭ.
Исследования, представленные в данной главе диссертационной работы, являются вторым этапом в комплексе экспериментальных исследований, имеющих цель - оптимизировать параметры лазерного излучения для проведения интракапсулярной ФДТ в среде фотосенсибилизирующего геля, включают: - расчет объемной дозы лазерного излучения с учетом параметров хрусталика; - вычисление коэффициента поглощения ЛИ; - определение экспозиции лазерного излучения. Для вычисления объемной дозы, эквивалентной таковой при поверхностном фотодинамическом воздействии, сначала рассчитывали объем хрусталика по следующей формуле:
Из источников литературы известно, что хрусталик кролика представляет собой параболоид с радиусом г = 6-7 мм в поперечном сечении и толщиной - h = 5-6 мм в переднезаднем направлении с радиусами его передней поверхности R] = 10 мм и задней поверхности R2 = 6 мм [3].
Известно, что потери лазерного излучения складываются из поглощения, отражения и пропускания - a+p+T=l=const , где a -коэффициент поглощения, р - коэффициент отражения, т - коэффициент пропускания [14, 15, 18]. Однако при объемном облучении на распространение ЛИ влияет поглощение а, существенно снижая его мощность, тогда как пропускание т и отражение - р - не влияют и нами не учитывались.
Для расчета коэффициента лазерного поглощения - а нами проведены теоретические исследования, для чего была измерена мощность ЛИ, расположенного в различных средах. Опыт проводили следующим образом: первоначально измеряли мощность ЛИ на конце световода (среда - воздух) с использованием интегрального измерителя мощности «ИММ-Ш» (ООО «Полироник», Москва), отражающего мощность лазерного излучения на выходе. Затем измеряли мощность ЛИ световода, помещенного в пустую пробирку (среда - пробирка). На третьем этапе измеряли мощность ЛИ световода, помещенного в пробирку с фотосенсибилизирующим гелем (среда - ФС гель).
В качестве источника излучения использовался диодный лазер АЛОД-01 фирмы «Алком-Медика» (Санкт-Петербург) с длинной волны 662 нм. Лазерное излучение подводилось при помощи гибкого световода d=0,6 мм с диффузором на конце. Мощность лазерного излучения изменялась в диапазоне 0,03 - 0,9 Вт, что соответствовало минимальному и максимальному значениям прибора (рис.30).
Результаты световой микроскопии
К настоящему времени в литературе собраны многочисленные данные, посвященные этиологии, патогенезу, причинам развития, лечению и профилактике ПЗК хрусталика, как наиболее распространенному осложнению послеоперационного периода хирургии катаракты, в том числе и современной ультразвуковой факоэмульсификации [24, 20, 21, 35, 45, 68, 144, 152, 30, 79, 109, 121, 124, 129, 130].
При этом многофакторность причин ПЗК и отсутствие до сих пор должной состоятельности используемых методов их профилактики, с точки зрения многих авторов, требует проведения новых исследований для разработки адекватных и патогенетически обоснованных способов преодоления этого специфического осложнения катарактальной хирургии [30, 129, 130, 59, 60, 89, 126, 125, 133, 148, 158, 26, 19, 66, 61, 75, 76, 77, 80, 81,86,90,81,88,97, 107].
В этой связи следует отметить успешное применение во многих областях медицины, в том числе и офтальмологии, ФДТ для лечения опухолевых заболеваний различных локализаций, а также ряда заболеваний неопухолевой природы [141, 64, 39, 62, 65, 70, 118, 136, 149, 108, 111, 112, 58, 118, 136, 149].
Являясь трехкомпонентной методикой, в основе которой лежит светоиндуцированная фотохимическая реакция, ФДТ приводит к цитофототоксическому повреждению новообразованных тканей. Преимущественное накопление ФС в активно пролиферирующих клетках с их последующим низкоинтенсивным лазерным облучением с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения данного препарата, определяет высокую избирательность и эффективность ФДТ [39, 100, 140, 142].
Это несомненное достоинство метода позволило обратиться к нему, как способу профилактики ПЗК, о чем свидетельствуют отдельные экспериментальные работы, касающиеся в основном изучения влияния различных ФС на клеточные культуры in vitro [117, 157, 155, 102].
Однако незначительный опыт и масса накопленных к сегодняшнему дню нерешенных вопросов не позволяют в полной мере оценить роль ФДТ в данной проблеме, что и определило цель настоящего исследования.
Цель исследования — методику интраоперационнои интракапсулярной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором хлоринового ряда разработать и в эксперименте обосновать ее применение для профилактики помутнения задней капсулы хрусталика после факоэмульсификации.
Для реализации поставленной цели задачи решались в следующей последовательности:
1. Разработать методику получения культуры пролиферирующих клеток хрусталика, участвующих в развитии помутнения задней капсулы, для использования ее в качестве экспериментальной модели.
2. В экспериментах in vitro определить оптимальную концентрацию и экспозицию фотосенсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин», а также дозу лазерного излучения для проведения фотодинамической терапии.
3. С помощью методов математического моделирования вычислить параметры лазерного излучения, используемые для проведения интраоперационнои интракапсулярной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором хлоринового ряда «Фотодитазин».
4. Разработать оптимальный способ доставки рассеянного лазерного излучения к герминативной зоне хрусталика в ходе интраоперационнои интракапсулярной фотодинамической терапии.
5. В экспериментах in vivo разработать методику проведения интракапсулярной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором хлоринового ряда «Фотодитазин» в ходе факоэмульсификации и оценить реакцию герминативной зоны хрусталика на применение разработанной методики.
Работа включает комплекс теоретических и разносторонних экспериментальных исследований, проведенных поэтапно in vitro и in vivo. Экспериментальные исследования in vitro были направлены на: - разработку методики получения культуры пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика и обоснование ее пригодности в качестве модели образования ПЗК для выполнения последующих скрининговых исследований по профилактике ПЗК хрусталика в условиях in vitro; оценку степени выраженности фотодинамического эффекта сочетанного воздействия фотосенсибилизатора хлоринового ряда и лазерного излучения на культуру пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика; определение оптимальных экспозиции и концентрации «Фотодитазина», а также дозы лазерного излучения на культуру пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика для выбора адекватных параметров ФДТ в профилактике ПЗК.
Основанием для разработки методики получения культуры пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика послужило наличие ряда недостатков у существующего на сегодняшний день аналогичного способа, в котором исходным материалом для эксплантации служит тотальный капсульно-эпителиальный препарат хрусталика. Кроме того, данный метод отличается длинным периодом культивирования клеток и гибелью значительного числа клеток в центре эксплантата [41].
Нами предложено в качестве исходного материала использовать мелкие фрагменты хрусталика, подвергнутые трипсинизации и коллагенизации, что позволяет получать отдельные клеточные элементы в виде «разрозненных» клеток с отсутствием в них препятствий для деления (Способ получения пролиферирующей клеточной культуры хрусталика. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В. Заявка на изобретение № 2008146619, приоритет от 27.11.2008).
![Комплексная система профилактики и лечения помутнения задней капсулы хрусталика после факоэмульсификации с имплантацией ИОЛ [Электронный ресурс]](/i/i/4477/205806.png "Комплексная система профилактики и лечения помутнения задней капсулы хрусталика после факоэмульсификации с имплантацией ИОЛ [Электронный ресурс] Рамазанова Асият Магомедовна")
