Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Методы исследования в ранней диагностике первичной открытоугольной глаукомы 18
1.2 Возможности использования протеомного анализа в исследовании биологических жидкостей 24
1.3 Современные представления о слезной жидкости 27
1.4 Современные представления о жидкости передней камеры глаза 28
1.5 Возможности протеомного анализа слезы и жидкости передней камеры глаза в диагностике офтальмопатологии 29
1.5.1 Белки, выявленные при протеомном анализе слезы, жидкости передней камеры глаза и плазмы крови 29
1.5.2 Результаты протеомного анализа при офтальмопатологии 35
1.6 Возможности протеомного анализа слезы и жидкости передней камеры глаза в диагностике первичной открытоугольной глаукомы 38
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1 Характеристика клинического материала 41
2.2 Клинико-функциональные методы исследования 43
2.3 Методы получения биоматериалов для биохимических исследований 44
2.3.1 Забор слезной жидкости 44
2.3.2 Забор жидкости передней камеры глаза 45
2.4 Методы протеомного изучения жидкости передней камеры глаза 46
2.4.1 Методы пробоподготовки 46
2.4.2 Методы протеомного анализа 53
2.5 Методы биоинформационного анализа и статистическая обработка данных 55
2.5.1 Обработка данных в программе MaxQuant 55
2.5.2 Обработка данных в программе Perseus 55
2.5.3 Анализ аннотации белков жидкости передней камеры глаза элементами Gene Ontology 56
2.5.4 Статистический анализ 57
2.6 Методы изучения белков слезной жидкости 58
2.6.1 Иммуноблоттинг на сухой мембране 58
2.6.2 «Классический» Вестерн-блоттинг 59
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 63
3.1 Белки жидкости передней камеры глаза, полученные в результате протеомного анализа, и их функции 63
3.2 Состав протеома жидкости передней камеры глаза 64
3.3 Распределение белков жидкости передней камеры глаза в выделенных клинических подгруппах 67
3.4 Характеристика белков жидкости передней камеры глаза, выделенных только в подгруппе «катаракта + первичная открытоугольная глаукома» 83
3.5 Характеристика белков жидкости передней камеры глаза, выделенных в подгруппах «катаракта» и «катаракта + псевдоэксфолиативный синдром» 87
3.6 Аполипопротеин D – потенциальный биомаркер псевдоэксфолиативного синдрома 88
3.7 Сравнение полученного протеома жидкости передней камеры глаза с другими базами данных 90
3.8 Результаты анализа слезной жидкости 122
Заключение 124
Выводы 129
Практические рекомендации 130
Список литературы 131
- Методы исследования в ранней диагностике первичной открытоугольной глаукомы
- Возможности протеомного анализа слезы и жидкости передней камеры глаза в диагностике первичной открытоугольной глаукомы
- «Классический» Вестерн-блоттинг
- Сравнение полученного протеома жидкости передней камеры глаза с другими базами данных
Методы исследования в ранней диагностике первичной открытоугольной глаукомы
Обследование на глаукому должно быть комплексным и не растянутым во времени [12]. Стандартные диагностические методики включают в себя суточную тонометрию, биомикроскопию, гониоскопию, офтальмоскопию, периметрию. В расширенный комплекс диагностических методик входит тонография, эластотонометрия, исследование уровня ВГД по хронобиологическим схемам и/или почасовая тонометрия, динамическая контурная тонометрия, транспальпебральная тонометрия, нагрузочные и/или разгрузочные пробы, исследование морфометрических и биомеханических свойств фиброзной оболочки глаза (пахиметрия, исследование вязкоэластических свойств), фотографирование (исследование) глазного дна с помощью фундус-камеры, Гейдельбергская ретинотомография, и/или лазерная поляриметрия, и/или оптическая когерентная томография (ОКТ), компьютерная периметрия, исследование кровообращения глаза, исследование перфузионного давления, флюоресцентная ангиография, ультразвуковые методы исследования, электрофизиологические методы исследования [12]. В настоящее время с учетом современных технологий для ранней диагностики ПОУГ (мониторинга) наиболее информативными методами исследования признаны бесконтактная тонометрия ORA, динамическая контурная тонометрия Pascal, ОКТ и коротковолновая автоматизированная или сине-жёлтая периметрия.
При обследовании одним из важнейших исследуемых показателей является уровень внутриглазного давления, что особенно важно у лиц с начальной стадией глаукомы, когда еще сложно установить другие характерные морфофункциональные изменения, или у больных с глаукомой нормального давления. При однократном измерении ВГД и получении величины, превышающей среднестатистическую верхнюю границу нормы на 2-4 мм, необходимо проводить тщательное дообследование пациента для исключения глаукомы. При этом, прежде всего необходимо повторное измерение уровня ВГД, так как возможны ошибки измерений, связанные с давлением на глазное яблоко, оказываемое специалистом, субъективной оценкой результатов и неточностью калибровки тонометров [12]. На сегодняшний день для измерения уровня ВГД используют аппланационную тонометрию по методу Маклакова, аппланационную тонометрию по методу Гольдмана, пневмотонометрию, бесконтактную тонометрия ORA, динамическую контурную тонометрию Pascal [13].
В настоящее время для коррекции показателей тонометрии необходимо исследование центральной толщины роговицы (пахиметрия). Данное исследование проводится ультразвуковым А-сканированием (контактным или иммерсионным способом). В соответствии с показателями пахиметрии центральную толщину роговицы принято классифицировать на тонкие (520 мкм), нормальные (от 521 до 580 мкм) и толстые (581 мкм). В то же время принято условное дополнительное деление тонких и толстых роговиц на ультратонкие (441-480 мкм) и ультратолстые (601-644 мкм).
Анализатор биомеханических свойств глаза Ocular Response Analyzer (ORA, Reichert Inc., США) является бесконтактным тонометром, работающим по принципу динамической двунаправленной аппланации роговицы. Измерения, произведенные на ORA, позволяют оценить ВГД по Гольдману, ВГД роговично–компенсированное, корнеальный гистерезис, фактор резистентности роговицы, центральную толщину роговицы [14].
Динамическая контурная тонометрия Pascal – модификация контактной тонометрии, исключающая влияние толщины роговицы на показатели измерения ВГД. Динамический контурный тонометр Pascal устанавливается на биомикроскоп, и на его экране учитывается среднее минимальное ВГД и амплитуда глазного пульса давления. Влияние толщины роговицы и ригидность элиминируются при помощи специального микросенсора, чувствительного к давлению и имитирующего кривизну роговицы [15].
Другой важный диагностический метод при глаукоме – гониоскопия – изучение угла передней камеры, недоступного непосредственному наблюдению. Осмотр угла передней камеры необходимо проводить для постановки диагноза и для решении вопроса о дальнейшей тактике лечения (терапевтическое, лазерное или хирургическое), а также в послеоперационном периоде.
При обследовании пациента с подозрением на глаукому одним из важнейших этапов является исследование диска зрительного нерва. Наиболее оптимальным методом определения изменений структуры ДЗН является стереоскопия. При этом возможно проведение непрямой офтальмоскопии на щелевой лампе с линзами 60Д, 78Д или 90Д или прямой офтальмоскопии через центральную часть линзы Гольдмана.
При проведении офтальмоскопии прежде всего следует обращать внимание на окраску ДЗН. Для глаукомы характерны атрофические изменения в ДЗН, которые клинически проявляются в побледнении атрофических участков диска. Также следует оценивать размер экскавации ДЗН. По литературным данным, размер экскавации диска от 0,0 до 0,3 следует относить к нормальным размерам, от 0,4 до 0,6 – к группе относительного увеличения, а больше 0,6 – к группе повышенного риска развития глаукоматозной атрофии.
В начальной стадии глаукомы четких различий между физиологической и глаукоматозной экскавацией не существует. Постепенно происходит уменьшение ширины нейроретинального пояска. Истончение может быть равномерным по всей окружности, локальным, краевым или сочетанным. Обычно принимают во внимание форму и относительный размер экскавации, ее глубину, характер височного края [13, 16]. При офтальмоскопии возможна общая оценка состояния ДЗН, так как невозможно провести количественную оценку его морфометрической структуры. В настоящее время самыми точными методами исследования ДЗН является оптическая когерентная томография и ее ангио-разновидность, Гейдельбергская ретинальная томография (HRT), а также комбинация этих методик [17]. ОКТ – по сути, метод, позволяющий оценить на гистологическом уровне морфологию тканей (форму, структуру, размер, пространственную организацию в целом) и их составных частей. Приборы, которые включают в себя современные ОКТ-технологии и такие методы, как фотоакустическая томография, спектроскопическая томография, поляризационная томография, допплерография и ангиография, эластография, оптофизиология, дают возможность оценить функциональное (физиологическое) и метаболическое состояние исследуемых тканей. В зависимости от возможностей, которыми может располагать ОКТ, ее принято классифицировать на морфологическую, функциональную и мультимодальную. ОКТ-ангиография является неинвазивной трехмерной альтернативой обычной ангиографии. К преимуществам метода относятся неинвазивность исследования, отсутствие необходимости применения флуоресцентных красителей, возможность измерения глазного кровотока в сосудах в количественном выражении [18].
HRT обеспечивает измерение таких морфометрических параметров ДЗН, как размер, контур и форма, нейроретинальный поясок, экскавация, а также измерение перипапиллярной сетчатки и слоя нервных волокон сетчатки (СНВС). Также при HRT происходит математический анализ полученных результатов и их сопоставление с заложенной в компьютерную систему базой данных. Ретинотомографы позволяют проводить диагностический поиск ранних повреждений ДЗН и СНВС у пациентов с подозрением на глаукому, а также мониторинг оптической нейропатии.
При выявлении пограничных изменений ДЗН, необходимо проведение повторных исследований в динамике через 3-6 месяцев.
При обследовании пациента с подозрением на глаукому одним из важнейших этапов для верификации диагноза является исследование поля зрения. Поле зрения – это область пространства, воспринимаемая глазом при неподвижном взоре. Периметрия – метод исследования поля зрения с использованием движущихся (кинетическая периметрия) или неподвижных стимулов (статическая периметрия) [13, 16].
В дополнение к стандартной, ахроматической («белый на белом») периметрии существуют методы «нестандартной» компьютерной периметрии -коротковолновая автоматизированная или сине-жёлтая периметрия (Short-Wavelength Automated Perimetry или SWAP) и периметрия с удвоением пространственной частоты (Frequency Doubling Technology Perimetry или FDT-периметрия). По литературным данным методика SWAP позволяет выявлять патологические изменения в центральном поле зрения и проводить дифференциальную диагностику между офтальмогипертензией и начальной глаукомой. Но, с другой стороны, SWAP оказалась чувствительной к нарушениям прозрачности хрусталика, что в значительной степени снижает достоверность её результатов у пациентов с нередким сочетанием глаукомы и катаракты. По литературным данным в качестве скрининга глаукомы из всех существующих функциональных методов наиболее высоко оценивается периметрия с удвоением пространственной частоты. В основе FDT-периметрии лежит феномен зрительной иллюзии удвоения низкой пространственной частоты, возникающей у человека в норме в условиях её модуляции с высокой временной частотой [19].
Возможности протеомного анализа слезы и жидкости передней камеры глаза в диагностике первичной открытоугольной глаукомы
На сегодняшний день были проведены исследования слезы, жидкости передней камеры и сыворотки крови пациентов с глаукомой.
Среди белков жидкости передней камеры пациентов с глаукомой идентифицированы матриксные металлопротеиназы [113], которые осуществляют лизис базальных мембран и гидролиз всех существующих компонентов межклеточного матрикса и активируют связанные с ним ангиогенные факторы роста [111, 112]. Также в жидкости передней камеры выделены ангиогенный фактор VEGF А [45] и фибронектин [48].
Фибронектин является гликопротеином внеклеточного матрикса, выполняет регуляторную и стабилизирующую функции в межклеточных взаимодействиях и является общей адгезивной молекулой для соединительной ткани (тканевая форма), плазмы крови и других биологических жидкостей (плазменная форма) [44, 114]. По литературным данным фибронектин определяется в составе псевдоэксфолиативного материала [115] и во всех структурах дренажной системы глаза.
В нескольких исследованиях обнаружена более высокая концентрация фибронектина в жидкости передней камеры глаза пациентов с глаукомой [48, 116], причем при псевдоэксфолиативной глаукоме уровень этого гликопротеина значительно выше, чем при ПОУГ. Авторы связывают это с повреждением и нарушенной проницаемостью гематоофтальмического барьера. В другом исследовании был определен более высокий уровень фибронектина в жидкости передней камеры пациентов с ПЭС (без подтвержденного диагноза глаукома), чем без него [47].
Также в жидкости передней камеры пациентов с псевдоэксфолиативной глаукомой были обнаружены более высокие уровни металлопротеиназ 2 и 3 типа и эндогенного ингибитора металлопротеиназы-2 [113]. Это свидетельствует о нарушении баланса между металлопротеиназами и их эндогеными ингибиторами, и может быть одним из звеньев патогенеза ПЭС.
При ПОУГ в жидкости передней камеры глаза были обнаружены более высокие уровни растворимого CD44. CD44 - интегральный клеточный гликопротеин, играющий важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции. Это рецептор для гиалуроновой кислоты, некоторых других лигандов, а также, возможно, матриксных металлопротеиназ [47]. Авторы выдвинули рабочую гипотезу о том, что ПОУГ биохимически характеризуется снижением концентрации гиалуроновой кислоты в жидкости передней камеры и повышением экспрессии рецептора CD44 для гиалуроновой кислоты, что, в свою очередь может влиять на трабекулярный аппарат и выживаемость ганглионарных клеток сетчатки.
В нескольких исследованиях определяли уровень антител сыворотки крови пациентов с глаукомой. Были обнаружены антитела к Нsp [75], -енолазе [76], белку, стимулирующему активацию аденилатциклазы [77] и гликозаминогликанам [78]. Также были определены повышенные уровни антител к антигенам сетчатки и другим структурам глаза в сыворотке крови больных глаукомой [79-81, 117]. В жидкости передней камеры пациентов с глаукомой нормального давления тоже обнаружили повышенные уровни антител к антигенам сетчатки по сравнению с группой контроля [82].
Исследования показывают, что Нsp играют важную роль в защите ганглиозных клеток сетчатки при глаукоме. Нsp делятся на две основные группы: конститутивные и индуцируемые. Конститутивные постоянно продуцируются в организме, они являются внутриклеточным составляющими и отвечают за упорядочение метаболизма. Индуцируемые Нsp (стрессовые белки) быстро синтезируются в ответ на различные физические и химические воздействия, повышая защитные функции клетки.
В исследовании Tezel G. et al., США, выявили, что уровень Hsp 60 и Hsp 27 в сетчатке и зрительном нерве у больных глаукомой достоверно выше, чем у здоровых [118]. По данным Park K. et al., США, избыточная продукция Hsp 70 защищает митохондрии от вредного воздействия реактивных форм кислорода, а Hsp 70 замедляет апоптоз, снижая активацию каспазы-3 [119].
Анализ современных данных литературы подтверждает перспективность проведения протеомного анализа различных биологических жидкостей. В настоящее время растет число работ, посвященных изучению состава глазных жидкостей, как вероятной диагностической среды при глазных заболеваниях. В основном, это статьи зарубежных авторов. В отечественной литературе мало работ, посвященных протеомному анализу биологических жидкостей.
Традиционные методы диагностики ПОУГ основаны на выявлении уже имеющейся клинически значимой симптоматики. Данную диагностику заболевания в начальной стадии трудно назвать ранней, поэтому продолжается поиск новых методов, позволяющих обнаружить самые ранние доклинические нарушения у больных глаукомой. Проведение масс-спектрометрии слезной жидкости и жидкости передней камеры может расширить возможности ранней диагностики различных заболеваний глазного яблока, в том числе, первичной открытоугольной глаукомы.
«Классический» Вестерн-блоттинг
Данная модификация выполнялась в виде нескольких следующих этапов:
1 этап – электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)
Электрофорез образцов слезы и жидкости передней камеры глаза проводили с использованием 10% разрешающего геля согласно протоколу Лэмли [126] с модификациями, используя камеру Mini Protean 3 Dodeca cell (BioRad, USA), и напряжение 10 В/cm в концентрирующем геле, 180 В - в разрешающем.
2 этап – перенос
После электрофореза пластину ПААГ отмывали в буфере для переноса (48мМ Tris, 39 мМ глицин, 0,037% метанола) и переносили на PVDF (поливинилиденфторид) мембрану (BioRad, USA). PVDF мембрану разрезали по размеру геля (8585 мм) и вымачивали 15 сек в метаноле, 5 мин в H2O, а затем 5 мин в буфере для переноса. Незначительно большего размера (8787 мм) куски бумаги для блоттинга Extra thick blot paper (BioRad, USA) также были помещены в буфер для переноса на 10 мин. Собирали сэндвич бумага/гель/PVDF мембрана/бумага и помещали между электродами прибора Trans-blot SD Semi-Dry Transfer Cell (BioRad, USA). Перенос осуществлялся 30 минут при напряжении 18 В.
3 этап – окрашивание мембраны
После переноса мембрану отмывали в 100% метаноле 10 сек, белки окрашивали посредством инкубации в растворе 0,1 Coomassie R в 30% метаноле и 10 об.% уксусной кислоте 1 мин. Отмывали в 50 об.% метаноле 2 раза по 1 мин. Мембрану полностью высушивали в течение 10 мин при 40С в приборе Gel Air Dryer (BioRad, USA), после чего проводили иммунодетекцию сухой окрашенной мембраны согласно методике, описанной ранее [127].
Высушенную мембрану инкубировали 25 мин с первичными антителами (разведение 1:10000 согласно протоколу производителя в растворе TBS [25 мМ Tris (трис(гидроксиметил)аминометан) (pH 7,5) и 150 мМ NaCl], содержащем 3% BSA, отмывали в TBS и инкубировали со вторичными антителами (разведение 1:10000 в растворе TBS , содержащем 3 % Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk (BioRad, USA) в течение 25 мин. После двухкратной отмывки в TBS, мембрану инкубировали в растворе ECL (Santa Cruz biotechnology, USA) 1 мин и помещали между двумя ацетатными пленочными листами кассеты Hypercassette (Amersham Biosciense, UK), экспозицию проводили на плене Amersham Hyperfilm (GE heathcare, USA) 15 сек или более в соответствии с интенсивостью сигнала. Проявка осуществлялась вручную с использованием проявителя РЕНМЕД-ПЛЮС (Випс-мед, Россия) и фиксажа РЕНМЕД-ПЛЮС (Випс-мед, Россия). Полученные результаты были оценены визуально и измерительным контролем.
«Классический» способ иммунодетеции выполняли согласно протоколу Cold Spring Harbor Protocol [128]. После переноса мембрану помещали в блокирующий раствор (TBS, содержащий 3% BSA и 0,1 об.% Tween 20) на ночь. Мембрану инкубировали с первичными антителами, растворенными в блокирующем растворе в течение 1 ч при комнатной температуре, промывали 3 раза по 15 мин в отмывочном растворе (TBS, содержащий 0,1 об.% Tween 20) и инкубировали со вторичными антителами в блокирующем растворе, содержащем 5% Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk и 0,1 об.% Tween 20 в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Блот отмывали 3 раза по 15 мин. Детекцию иммунного окрашивания проводили с помощью люминесцентной ферментативной реакции, используя набор реагентов ECL (Santa Cruz biotechnology, USA): раствор В : раствор А = 1:40 5 минут при комнатной температуре. Фиксация результатов иммунного окрашивания осуществлялась на приборе Typhoon FLA 9500 (GE Health Care, USA).
Сравнение полученного протеома жидкости передней камеры глаза с другими базами данных
В работе было проведено сравнение полученного протеома жидкости передней камеры глаза с результатами аналогичных исследований. Подобное сравнение уже проводил в своем исследовании Kim et al. [174]. В исследовании Kim et al. сравнивался протеом, идентифицированный при LC-MS/MS, с белками, полученными при проведении других протеомных исследований (двухмерный электрофорез с MALDIOF MS и др.). Но поскольку технические возможности к идентификации белков постоянно совершенствуются [175], сравнение баз данных, полученных с разницей более чем в 5 лет, не может дать полной достоверности.
Таким образом, были отобраны 4 работы, в которых проводился протеомный анализ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией [158-161]. Более ранние работы, в которых применялся, к примеру, двухмерный электрофорез, не рассматривались [176, 177].
В работе были объединены белки, идентифицированные в выбранных базах данных. Всего получилось 883 белков (таблица 20). Из них 102 белка были идентифицированы во всех исследованиях, 32 белка являлись уникальными для этого исследования. Объединенный протеом жидкости передней камеры был обогащен белками, регулирующие активность эндопептидаз (GO:0061135; p value = 3,610-34).
К сожалению, даже при использовании LC-MS/MS с высокой разрешающей способностью, полученные результаты могут сильно отличаться от имеющихся баз данных из-за разных возможностей поиска в базах данных. В открытом доступе были необработанные данные хорошего качества только одного исследования жидкости передней камеры глаза [160]. Эти данные были повторно проанализированы и сравнены с полученными в данном исследовании результатами (рис. 5).
В исследовании Murthy et al. [160] было собрано 250 образцов жидкости передней камеры глаза (250 пациентов). Забор жидкости осуществлялся во время операции экстракции катаракты. Образцы были объединены для дальнейшего исследования (создан пул). Перед проведением анализа было проведено расщепление и предварительное фракционирование белков. Большое количество образцов и экстенсивное фракционирование объясняет большее количество идентифицированных пептидов и групп белков по сравнению с данным исследованием (рис. 5). Однако при объединении образцов теряется индивидуальная вариабельность идентифицированных белков.
Определение общего белка в слезной жидкости дало существенные индивидуальные колебания, поэтому протеомный анализ путем масс-спектрометрии, которым мы располагали, можно признать неэффективным инструментом в случае слезы. Предварительный анализ также выявил в этой жидкости большое количество контаминантных белков, например, кератинов кожи.
Таким образом, данная работа представляет собой комплексное клинико лабораторное исследование. Доказано, что взятие на анализ жидкости передней камеры глаза во время операции факоэмульсификации катаракты не влияет на результат операции и не увеличивает сроки послеоперационного восстановления. В работе с помощью хромато-масс-спектрометрических методов высокого разрешения исследован протеом жидкости передней камеры глаза у пациентов с такими глазными заболеваниями, как катаракта, глаукома, а также псевдоэксфолиативный синдром. Доказана высокая информативность проведения данного анализа для поиска биомаркеров первичной открытоугольной глаукомы.