Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 23
1.1. Общая характеристика системы IGF/инсулин 23
1.2. Инсулиноподобный фактор роста 1 типа (IGF-1) 28
1.3. Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1R)
1.3.1. Регуляция экспрессии гена IGF-1R 36
1.3.2. Сигнальная трансдукция, опосредуемая IGF-1R 39
1.4. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в канцерогенезе 45
1.4.1. Эпидемиологические исследования взаимосвязи между экспрессией IGF-1 и IGF-1R и злокачественной трансформацией .45
1.4.2. Молекулярно-генетические исследования взаимосвязи между экспрессией IGF-1 и IGF-1R и злокачественной трансформацией 1.5. Развитие молочной железы мыши 55
1.6. Рак молочной железы, индуцированный гиперэкспрессией Wnt1 60
1.7. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в прогрессии множественной миеломы человека 65
1.7.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в селективной локализации
клеток миеломы в костном мозге 67
1.7.2. Роль IGF-1 в регуляции пролиферации клеток множественной миеломы 71
1.7.3. Роль IGF-1 в регуляции остеолизиса 73
1.8. Возникновение МЛУ является существенным фактором в прогрессии множественной миеломы .74
1.8.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции механизмов возникновения МЛУ при ММ человека 82
1.8.2. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в выживании опухолевых клеток при множественной миеломе 85
1.9. Роль IGF-1 в регуляции апоптоза, индуцируемого IL-1 97
1.9.1. Про-апоптотические цитокины IL-1 и IL-1 98
Глава 2. Материалы и методы исследования 101
2.1. Трансгенные линии мышей 101
2.2. Генотипирование 102
2.3. Приготовление препаратов молочной железы
2.3.1. Приготовление тотального препарата молочной железы 103
2.3.2. Окрашивание гематоксилин-эозином 104
2.3.3. Исследование пролиферации клеток эпителия молочной железы с использованием бромдезоксиуридина (BrdU) .104
2.4. Получение первичной культуры клеток эпителия молочной железы мыши 105
2.4.1. Процедура покрытия чашки матригелем .107
2.4.2. Исследование экспрессии казеинов в первичной культуре клеток эпителия молочной железы in vitro 108
2.4.3. Отделение первичных клеток эпителия молочной железы от матригеля 1 2.5. Исследование экспрессия бета казеина в линии клеток эпителия молочной железы мыши НС11 109
2.6. Выделение белка из ткани молочной железы мыши .110
2.7. Вестерн - блот гибридизация 110
2.8. Иммунопреципитация 111
2.9. Проточная цитометрия 1 2.10. Клинический материал и выделение РНК из клеток костного мозга 113
2.11. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 114
2.12. Исследование активности эффекторных каспаз 3 и 7 115
2.13. Линии клеток множественной миеломы 116
2.14. Оценка выживаемости клеток ММ колориметрическим
методом (МТТ) и методом подсчета 116
2.15. Статистическая обработка результатов 117
Глава 3. Результаты исследования .119
3.1. Исследование роли IGF-1R в дифференцировке на модели молочной железы мыши .119
3.1.1. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором .121
3.1.2. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором 129
3.1.3. Исследование роли IGF-1R - зависимого сигнального пути в канцерогенезе молочной железы, опосредуемом Wnt1 .140
3.1.4. Исследование роли IGF-1 и IGF-2 в функциональной дифференцировке клеток молочной железы НC11 .148
3.2. Исследование роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при множественной миеломе человека 152
3.2.1. Исследование экспрессии мРНК IGF-1 и мРНК генов,
отвественных за возникновение МЛУ в клиническом материале 152
3.2.2. Зависимость общей выживаемости пациентов с ММ от уровня экспресссии гена IGF-1 165
3.2.3. Исследование роли IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ на моделях линий культур клеток множественной
миеломы человека 168
3.3. Исследование роли IGF-1 в регуляции выживаемости нормальных и опухолевых клеток 174
3.3.1.Исследование IGF-1- зависимой регуляции активности каспаз 3 и 7 174
3.3.2. Исследование влияния IGF-1 на выживаемость клеток множественной миеломы человека 178
3.3.2.1. Экспрессия мРНК генов системы IGF/инсулин в линиях клеток множественной миеломы человека 178
3.3.2.2. Исследование влияния фактора роста IGF-1 на выживаемость линий клеток множественной миеломы человека методом МТТ.. 180
3.3.2.3. Исследование выживаемости линий клеток множественной миеломы человека методом подсчета 182
3.3.2.4. Исследование влияния фактора роста IGF-1 на динамику выживаемости линий клеток множественной миеломы человека .185
3.3.2.5. Исследование экспрессии мРНК генов CycB1 и CycD1 и мРНК генов, принадлежащих семействам Bcl-2 и IAP 188
Глава 4. Осуждение результатов 193
4.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции дифференцировки молочной железы 193
4.1.1. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R
под WAP промотором .194
4.1.2. Экспрессии казеинов в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, и в линии клеток молочной железы HC11 198
4.1.3. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором .200
4.2. Роль IGF-1R - зависимого сигнала в канцерогенезе молочной железы, опосредуемом Wnt1 .205
4.3. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ
при множественной миеломе человека 211
4.4. Влияние IGF-1 на выживаемость клеток множественной миеломы человека 215
4.5. IGF-1- зависимая регуляция активности каспаз 3 и 7 220
Заключение .224
Выводы 229
Список сокращений и условных обозначений
- Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1R)
- Приготовление тотального препарата молочной железы
- Исследование роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при множественной миеломе человека
- Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Злокачественные новообразования (ЗН) – одна из основных причин смертности
населения России. При этом показатели заболеваемости ЗН с течением времени возрастают (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2014). Настоятельно необходимы и, несомненно, актуальны поиски новых подходов к лечению и диагностике ЗН. Для поиска таких новых подходов необходимо тщательное изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и опухолевой прогрессии. Одним из основных нарушений, определяющих возникновение и развитие ЗН, является способность клеток поддерживать устойчивые сигналы для пролиферации (Копнин Б. П., 2004; Hanahan D., Weinberg R.A., 2011). Эти сигналы клетки получают от факторов роста, которые связываются с соответствующими рецепторами на поверхности клетки и активируют сеть внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих вхождение клетки в очередной клеточный цикл. Часто эти сигналы влияют и на другие свойства опухолевых клеток такие как: рост, выживаемость, дифференцировку, возникновение лекарственной устойчивости, активацию онкогенных сигнальных путей, энергетический обмен и другие. Поэтому исследование роли факторов роста и их рецепторов в молекулярных механизмах злокачественной прогрессии является на сегодня актуальным.
В настоящее время одной из наиболее широко изучаемых в онкологии является система инсулиноподобных факторов роста (система IGF) (Hartog H. et al., 2007; Samani A.A. et al., 2007). Роль этой системы в прогрессии ряда злокачественных новообразований человека является доказанной. Повышенная экспрессия компонентов этой системы в злокачественных опухолях является плохим прогностическим показателем выживаемости больных. Для таких опухолей характерен послеоперационный рецидив, они являются инвазивными и дают отдаленные метастазы (Gicquel C. et al., 2001; Parker A.S. et al., 2002; Parker A.S. et al., 2003; Shariat S.F. et al., 2003; Sayer R.A. et al., 2005). Однако, молекулярные механизмы, определяющие влияние инсулиноподобных факторов роста на прогрессию опухолей остаются не раскрытыми и проведение фундаментальных исследований в этом направлении является актуальным.
Данная работа посвящена детальному исследованию роли инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) и его рецептора IGF-1R в регуляции молекулярных механизмов выживания нормальных и опухолевых клеток, а также дифференцировки и канцерогенеза.
Было обнаружено, что гиперэкспрессия гена Wnt1 в эпителии молочной железы вызывает раннюю и обширную гиперплазию протоков (Tsukamoto A.S. et al., 1988; Shackleford G.M. et al., 1993; Li Y. et al., 2000). Также показано, что активация сигнального пути,
опосредованного Wnt1 характерна для базальноподобного рака молочной железы (РМЖ) человека (Khramtsov A.I. et al. 2010), и что она ассоциируется с метастазированием в легкие и головной мозг (Dey N. et al., 2013). Базальноподобный РМЖ по гистологическому строению принадлежит к низкодифференцированному протоковому раку с высокой метастатической активностью, низкой степенью дифференцировки (Тюляндин C.A. и др., 2010; Rakha, E.A. et al., 2008; Reis-Filho, J.S. et al., 2008; Carey L. et al., 2010). Он, по-прежнему, остается одним из наиболее сложных для лечения подтипов РМЖ из-за агрессивного характера течения и отсутствия эффективных методов лечения (Тюляндин C.A. и др., 2010; O'Toole S.A. et al., 2013; Lehmann B.D. et al., 2014; Rota, L.M. et al., 2014). Для этого типа РМЖ характерна экспрессия преимущественно маркеров базальных клеток, обогащенных стволовыми клетками (Herschkowitz J.I. et al., 2008; Rakha, E.A. et al., 2008; Lim, E. et al., 2009; Rota L.M. et al., 2014). Одной из причин агрессивного течения базальноподобного РМЖ является его происхождение из наименее дифференцированных (возможно даже, стволовых) клеток (Тюляндин C.A. и др., 2010). Поэтому на сегодня актуальным является сосредоточение усилий на выявлении сигнальных путей, активированных при этом типе РМЖ (Lehmann, B.D. et al., 2014). Недавно было показано, что для базальноподобного РМЖ характерна активация IGF-1R – зависимого сигнального пути (Davison Z. et al., 2011; Litzenburger, B.C. et al., 2011). Однако детального исследования молекулярных механизмов, свидетельствующих об участии этого сигнального пути в канцерогенезе молочной железы, не проводилось и исследования в этом направлении являются актуальными. Эти исследования вошли в нашу работу (раздел 1).
В литературе имеются данные о том, что в низкодифференцированной карциноме
молочной железы протокового и долькового происхождения уровень экспрессии IGF-1R резко
снижается и это корреллирует с усилением пролиферации опухолевых клеток и потерей
экспрессии рецептора эстрогена (ER) (Schnarr, B. et al., 2000). Вместе с тем молекулярные
механизмы, свидетельствующие о взаимосвязи между экспрессией IGF-1R и
дифференцировкой молочной железы, не изучены. Очевидно, что понимание роли IGF-1R в
дифференцировке молочной железы является важным для оценки его значимости в
злокачественной прогрессии. Поэтому исследования в этом направлении, предпринятые нами, являются актуальными (выполнены в разделе 1).
Одним из свойств злокачественных клеток, позволяющих им выживать и размножаться в условиях противоопухолевой терапии, является приобретение ими, в ходе длительного лечения, устойчивости к разным химиопрепаратам, различающимся и по химической структуре, и по механизму действия. Иными словами, возникает множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) (Stavrovskaya A.A., 2000; Ставровская А.А., 2003). МЛУ относится к ключевым
факторам прогрессии опухоли. Одним из хорошо охарактеризованных молекулярных
механизмов МЛУ является активность белка Р-гликопротеина (Pgp), кодируемого в клетках
человека геном MDR1/ABCB1. Белок Pgp является трансмембранным белком, который,
используя энергию АТФ, выбрасывает из клетки лекарственные препараты. Увеличение
количества мРНК MDR1/ABCB1 и продукта этого гена Pgp (Р-гликопротеина) часто служит
фактором устойчивости многих типов опухолей к лечению. Наряду с Pgp, в МЛУ вовлечены
также и другие белки: АТФ-зависимые транспортеры MRP1/ABCC1, BCRP/ABCG2, а также
белок LRP/MVP (Stavrovskaya A.A., 2000; Cole S.P. et al., 1992; Loe D.W. et al., 1996).
Возникновение МЛУ является одним из главных препятствий на пути к успешному лечению
онкобольных. Несмотря на то, что созданы различные классы ингибиторов, которые являются
конкурентами субстратов перечисленных выше белков-транспортеров, их действие в
преодолении МЛУ пока не эффективно. Поэтому, наряду с дальнейшим поиском новых
ингибиторов МЛУ, актуальным является исследование регуляции экспрессии генов,
ответственных за МЛУ. В последнее время стали появляться данные о влиянии
инсулиноподобных факторов роста на возникновение МЛУ (Shen, K. et al., 2012; Benabbou N. et
al., 2013), однако детального исследования молекулярных механизмов участия
инсулиноподобных факторов роста и их рецепторов в возникновении МЛУ проведено не было, поэтому исследования в этом направлении являются актуальными (выполнены в разделе 2).
Известно, что во многих типах злокачественных клеток нарушен механизм, регулирующий запрограммированную клеточную гибель – апоптоз (Naniche N, et al., 2011; de Almagro M.C. et al., 2012). В результате опухолевые клетки становятся менее чувствительными, по сравнению с окружающими их нормальными клетками, к различным стрессовым воздействиям, таким как недостаточность факторов роста, поломки ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, тепловой шок, действие противоопухолевых препаратов, направленных на активацию апоптоза в опухолевых клетках. Иными словами, менее чувствительные к апоптозу опухолевые клетки получают преимущество в борьбе за выживание, что является важным шагом на пути к злокачественной прогрессии. Имеются данные о том, что инсулиноподобные факторы роста в некоторых типах опухолей могут иметь анти-апоптотические функции (De Bruyne E. et al., 2010; Tagoug I. Et al., 2011). Однако молекулярные механизмы, посредством которых инсулиноподобные факторы роста участвуют в регуляции апоптоза, изучены недостаточно. Поэтому исследования в этом направлении являются актуальными (выполнены в разделе 3).
Таким образом, тема исследования, которой посвящена диссертационная работа, является актуальной и вносит вклад в развитие представлений о роли инсулиноподобных факторов роста и их рецепторов в регуляции процессов, связанных со злокачественной
прогрессией, таких как множественная лекарственная устойчивость, апоптоз, дифференцировка и канцерогенез.
Степень разработанности темы исследования
В литературе имеются работы, посвященные исследованию роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R при РМЖ, но данные, полученные в ходе этих работ, являются противоречивыми и спорными. В одних исследованиях доказывается, что гиперэкспрессия IGF-1R не коррелирует ни с прогнозом течения заболевания, ни с клинико-патологическими параметрами РМЖ, а в других - экспрессия IGF-1R идентифицируется как убедительный прогностический фактор при РМЖ (Peyrat J.P. et al., 1988; Bonneterre J. et al., 1990; Jammes H. et al., 1992; Railo M.J. et al., 1994; Shimizu C. et al., 2004; Ueda S. et al., 2006; Kim J.H. et al., 2010; Yerushalmi R. Et al., 2012). Особо следует отметить работы, в которых обнаружена ассоциация между экспрессией IGF-1R, дифференцировкой и опухолевой прогрессией (Schnarr B. et al., 2000). Вместе с тем ни в одной из перечисленных работ не были проведены детальные исследования молекулярных механизмов, свидетельствующих об участии IGF-1 и его рецептора IGF-1R в канцерогенезе молочной железы. Более того к началу диссертационной работы абсолютно неизученным оставался вопрос, касающийся роли IGF-1R в нормальном развитии и в функционировании молочной железы. Также неизвестна была роль IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли. В диссертационной работе это направление разработано впервые на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Для исcледования роли IGF-1R – зависимого сигнала в Wnt1 – индуцируемом канцерогенезе путем скрещивания линии мышей MMTV-dnIGF-1R, у которой IGF-1R – опосредуемый сигнал подавлен, с линией мышей MMTV-Wnt1, у которой гиперэксспрессирован ген Wnt1, была получена линия Wnt1/dnIGF-1R, у которой под MMTV промотором в молочной железе одновременно экспрессируются два трансгена. В этой линии мы исследовали роль IGF-1 – зависимого сигнала в канцерогенезе молочной железы, индуцированном гиперэкспрессией гена Wnt1. В других трансгенных линиях мышей, у которых мутантный рецептор IGF-1R экспрессировался в клетках эпителия протоков молочной железы под MMTV промотором и под промотором кислого сывороточного белка WAP (acidic whey protein) нами была исследована роль гена IGF-1R в третичном разветвлении и росте протоков молочной железы в период постнатального развития, а также в дифференцировке альвеол и регуляции экспрессии казеинов – белков молока, в период беременности и лактации.
В литературе начали появляться работы, посвященные исследованию роли IGF-1R сигнального пути в регуляции механизмов возникновения МЛУ при некоторых типах ЗН (Shen, K. et al., 2012; Benabbou N. et al., 2013). Литературные данные, касающиеся участия IGF-1 в возникновении МЛУ при множественной миеломе (ММ), в настоящее время отсутствуют.
Вместе с тем, имеются основания предполагать, что IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнал может иметь отношение к возникновению МЛУ при ММ человека. Например показано, что взаимодействие клеток ММ с клетками стромы костного мозга активирует в последних транскрипцию и секрецию цитокинов и ростовых факторов, в том числе и инсулиноподобного фактора роста 1-го типа (IGF-1) (Hideshima T. et al., 2004). Также было показано, что клетки ММ, взаимодействуя с эндотелием кровеносных сосудов, окружающих костный мозг, экспрессируют на своей поверхности рецептор IGF-1R (Hideshima T. et al., 2004). В диссертационной работе впервые исследована роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ, при ММ человека с использованием клинического материала (аспиратов костного мозга больных ММ) и линий культур клеток ММ.
В литературе также имеются данные о том, что IGF-1/IGF-1R - зависимый сигнальный путь может регулировать апоптоз, придавая злокачественным клеткам преимущество в борьбе за выживание (De Bruyne E. et al., 2010; Tagoug I. Et al., 2011). Однако эти данные являются противоречивыми и исследования в этом направлении в настоящем остаются актуальными. Мы исследовали роль IGF-1/IGF-1R – опосредуемого сигнального пути в регуляции экспрессии генов семейства Bcl-2 и IAP и в регуляции активности эффекторных каспаз 3 и 7.
Цель исследования:
Установить роль инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) и его рецептора IGF-1R в регуляции молекулярных механизмов основных компонентов прогрессии злокачественных новообразований: множественной лекарственной устойчивости, дифференцировки и апоптоза.
Задачи исследования:
1. Исследовать роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции дифференцировки и канцерогенеза на модели трансгенных линий мышей и линии клеток
молочной железы мыши HC11
-
Исследовать роль доминантно-негативного IGF-1R (dnIGF-1R), экспрессирующегося в клетках эпителия молочной железы мыши под промотором кислого сывороточного белка WAP, в регуляции экспрессии казеинов – белков молока и регуляции роста альвеол.
-
Исследовать роль dnIGF-1R, экспрессирующегося в клетках эпителия молочной железы мыши под MMTV промотором, в регуляции третичного разветвления и роста протоков молочной железы.
1.3. Исследовать роль IGF-1 в регуляции экспрессии казеинов в линии клеток молочной железы
мыши HC11 и в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей,
экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором.
8 1.4. Исследовать роль IGF-1R в ^/-опосредованном канцерогенезе молочной железы.
2. Исследовать роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции множественной лекарственной устойчивости при множественной миеломе человека
-
На моделях линий культур клеток множественной миеломы (ММ) человека: RPMI1640, RPMI8226 и ГМ9 исследовать IGF-1 - зависимую регуляцию экспрессии мРНК генов, ответственных за множественную лекарственную устойчивость (МЛУ): MDR1, MRP J, LRP, BCRP.
-
В аспиратах костного мозга, полученных от больных ММ, исследовать экспрессию мРНК гена IGF-1 и мРНК генов, ответственных за МЛУ: MDR1, MRP1, LRP, BCRP.
-
Провести корреляционный анализ между экспрессией гена IGF-1 и общей выживаемостью пациентов с ММ.
3. Исследовать роль IGF-1 в выживаемости клеток и в регуляции апоптоза на моделях линий клеток множественной миеломы человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9 и
нейронных клеток сетчатки глаза RGC-5
-
На модели линий клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и ГМ9 исследовать роль IGF-1 в выживаемости злокачественных клеток и в регуляции экспрессии генов семейства Bcl-2 и MP.
-
На модели нейронных клеток сетчатки глаза крысы RGC-5 исследовать IGF-1- зависимую регуляцию активности эффекторных каспаз 3 и 7, индуцированных удалением сыворотки из культивируемой среды или воздействием IL-1.
Научная новизна
В ходе диссертационной работы получены оригинальные результаты, опубликованные в зарубежной и отечественной научной литературе.
Впервые показано, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в канцерогенезе молочной железы, опосредованном Wntl: ослабление IGF-1R - зависимого сигнала в контексте с гиперэкспрессией гена Wntl сокращает время возникновения опухолей молочной железы и увеличивает количество возникающих опухолевых узлов.
Впервые показано, что IGF-1R - зависимый сигнал участвует в дифференцировке молочной железы: регулирует размеры альвеол и экспрессию казеинов (а, |3, у, 8) и белка WAP в период беременности и лактации, и регулирует третичное разветвлении и рост протоков молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши.
Впервые показано, что IGF-1R – опосредуемый сигнальный путь регулирует соотношение стволовых/базальных клеток и предшественников люминальных клеток. Регуляция популяции предшественников люминальных клеток происходит через активацию Notch сигнального пути.
Впервые показно, что IGF-1R – зависимый сигнал в молочной железе участвует в регуляции пролиферации клеток эпителия протоков.
Впервые установлено, что фактор роста IGF-1 и его рецептор IGF-1R могут участвовать в регуляции механизмов возникновения МЛУ при множественной миеломе человека: в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных множественной миеломой экспрессия гена IGF-1 ассоциируется с экспрессией генов множественной лекарственной устойчивости: MDR1/ABCB1, LRP/MVP, MRP1/ABCC1, BCRP/ ABCG2. В линии клеток множественной миеломы человека RPMI8226 IGF-1 регулирует экспрессию генов множественной лекарственной устойчивости: MRP1/ABCC1 и LRP/MVP.
Впервые показано, что гиперэкспрессия гена IGF-1 при множественной миеломе может являться плохим прогностическим фактором: высокий уровень экспрессии гена IGF-1 у пациентов с множественной миеломой ассоциируется с уменьшением общей выживаемости больных.
Впервые показано, что IGF-1/IGF-1R – опосредуемый сигнал усиливает выживаемость линий клеток множественной миеломы человека и участвует в регуляции апоптоза: регулирует экспрессию антиапоптотичеких генов: Bcl-2 и HIAP-1 и подавляет активацию эффекторных каспаз 3 и 7.
Теоретическая и практическая значимость работы
В диссертационной работе впервые показано, что ослабление IGF-1R-зависимого сигнала одновременно приводит к ухудшению дифференцировки клеток и к усилению канцерогенеза молочной железы, опосредованного Wnt1, что, в более широком смысле, может служить примером взаимосвязи между ухудшением дифференцировки и развитием злокачественной опухоли. Выявленная впервые кооперация между геном IGF-1R и онкогеном Wnt1 может служить прогностическим маркером прогрессии РМЖ. В более широком понимании эта кооперация может иметь место и в случае с другими известными онкогенами. Поэтому в клинической практике, наряду с исследованием экспрессии в опухолях известных онкогенов, мы рекомендуем дополнительно исследовать активность IGF-1R – зависимого сигнала, что позволит выбрать правильную стратегию лечения онкобольных.
В диссертационной работе впервые показано, что IGF-1R – опосредуемый сигнальный путь может участвовать в регуляции механизмов возникновения МЛУ и этот сигнальный путь может усиливать выживаемость клеток множественной миеломы. Эти данные служат
основанием для разработки новых подходов к лечению множественной миеломы, в которых, наряду с применением традиционной противоопухолевой химиотерапии одновременно могли бы использоваться блокаторы сигнального пути IGF-1/IGF-1R с применением специфических ингибиторов IGF-1R и моноклональных антител. Представляется, что такая комбинированная терапия будет более эффективной, чем, если бы применялась только одна химиотерапия. Также наше исследование свидетельствует о том, что повышенная экспрессия гена IGF-1 может являться плохим прогностическим фактором общей выживаемости пациентов, у которых диагностирована множественная миелома.
Материалы и методы исследования
В диссертационной работе были использованы трансгенные линии мышей, клинический материал, полученный от больных множественной миеломой и линии культур клеток.
Методы исследования включали: получение первичной культуры клеток эпителия молочной железы мыши, генотипирование, приготовление тотального препарата молочной железы, окраска срезов гематоксилин-эозином, исследование пролиферации клеток эпителия молочной железы с использованием бромдезоксиуридина (BrdU), проточная цитометрия, индукция экспрессии казеинов в первичной культуре молочной железы, выделение белка из ткани молочной железы мыши, вестерн-блоттинг, иммунопреципитация, выделение РНК из клеток костного мозга, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), исследование активности каспаз 3 и 7 в клетках, оценка выживаемости клеток колориметрическим методом (МТТ) и другие.
Положения, выносимые на защиту
1. IGF-1R играет важную роль в регуляции дифференцировки молочной железы: регулирует
рост и разветвление протоков молочной железы, и регулирует размеры альвеол и экспрессию
казеинов - белков молока.
2. IGF-1R – опосредуемый сигнал в молочной железе регулирует соотношение
стволовых/базальных клеток и предшественников люминальных клеток, а также регулирует
пролиферацию клеток эпителия протоков.
3. IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь регулирует канцерогенез молочной железы,
опосредуемый Wnt1: ослабление IGF-1R сигнализации в контексте с гиперэкспрессией Wnt1
сокращает время возникновения опухолей молочной железы и увеличивает количество
возникающих опухолевых узлов.
4. IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь участвует в регуляции механизмов МЛУ при
множественной миеломе (ММ) путем регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ:
MDR1/ABCB1, LRP/MVP, MRP1/ABCC1, BCRP/ ABCG2.
5. IGF-1 является фактором, усиливающим выживаемость линий клеток ММ человека.
Повышение уровня экспрессии гена IGF-1 у пациентов с множественной миеломой
ассоциируется с уменьшением общей выживаемости больных.
6. IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнал участвует в механизмах апоптоза: регулирует экспрессию
антиапоптотичеких генов Bcl-2 и HIAP-1; ингибирует активацию эффекторных каспаз 3 и 7.
Степень достоверности и апробация результатов
В работе использованы уникальные модели in vivo, позволяющие исследовать дифференцировку в разные периоды органогенеза. Для исследований получен доминантно-негативный мутант IGF-1R, экспрессия которого регулируется в организме мыши транскрипционными факторами, функционирующими в зависимости от гормонального статуса. Такой подход обеспечивает адекватность модели задачам исследования. Про-онкогенная роль IGF-1R – опосредуемого сигнального пути была показана на культурах опухолевых клеток и биоптатах нативных опухолей. Диссертационная работа выполнена с применением современных методов, на разнообразных объектах. По результатам исследований опубликованы статьи в отечественных и международных журналах, таких как: Cancer Res (2014 г.); Endocrinology (2011 г.); Investigative Ophthalmology and Visual Science (2008 г.); Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (2010 - 2014 г.г.); Клиническая Онкогематология (2010 - 2014 г.г.); Российский Биотерапевтический Журнал (2010 - 2014 г.г.). Всего по итогам исследования опубликованы 25 печатных научных работ, из них 15 статей в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Также были сделаны доклады на научных конференциях НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России и в ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского».
Диссертация апробирована 21 апреля 2015 г. на совместной научной конференции лабораторий: генетики опухолевых клеток, механизмов химического канцерогенеза, механизмов гибели опухолевых клеток, цитогенетики, молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Структура и объем работы
Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1R)
На сегодня в литературе мало работ, посвященных исследованию роли IGF 1R – зависимого сигнального пути в регуляции механизмов возникновения множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Показано, что в клетках рака толстой кишки мыши линии MCLM и в линии Т-лимфобластов человека CCRF CEM IGF-I индуцирует экспрессию гена MDR1 и значительно ингибирует гибель клеток от цитотоксических препаратов [208, 480]. В работе J. Ge и соавт. методом иммуногистохимии проведено исследование экспрессии IGF-1R и MRP1 в 102 образцах больных раком желудка и обнаружено, что IGF-1R экспрессируется в 75,2 % случаев, а MRP1 – в 69 % случаев. Такая высокая степень корреляции в экспрессии этих генов, несмотря на химиотерапию, ассоциируется с плохим прогнозом у больных раком желудка [183]. Также показано, что ингибирование IGF-1R в клетках колоректального рака человека ассоциируется с повышением чувствительности этих клеток к противоопухолевым препаратам и с супрессией экспрессии MRP-2 [494]. Таким образом, в литературе накапливаются данные, свидетельствующие в пользу того, что IGF-1R – опосредуемый сигнал может участвовать в возникновении МЛУ. Также эти данные свидетельствуют в пользу того, что исследования в этом направлении являются актуальными и своевременными. Что касается участия IGF-1 в возникновении МЛУ при множественной миеломе (ММ) в литературе данных нет. Вместе с тем, имеются основания предполагать, что IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь может иметь отношение к возникновению МЛУ при ММ человека. Например, показано, что взаимодействие клеток ММ с клетками стромы костного мозга активирует в последних транскрипцию и секрецию цитокинов и ростовых факторов, в том числе и инсулиноподобного фактора роста 1-го типа (IGF-1) [229]. Также было показано, что клетки ММ, взаимодействуя с эндотелием кровеносных сосудов, окружающих костный мозг, экспрессируют на своей поверхности рецептор IGF-1R [229]. Увеличение количества IGF-1R на поверхности клеток ММ приводит к большему количеству IGF-1/IGF-1R взаимодействий и последующей активации нижележащих сигнальных путей в клетке, которые могут оказаться важными для злокачественной прогрессии ММ, в том числе и для возникновения МЛУ. Известно, что для пациентов с ММ характерна приобретенная МЛУ, которая возникает при повторном и/или длительном лечении противоопухолевыми цитостатиками. Становление приобретенной МЛУ происходит через отбор и последующее размножение тех опухолевых клеток, в которых гены, ответственные за возникновение МЛУ гиперэкспрессируются и такие клетки приобретают МЛУ [196]. Приобретенная МЛУ является одной из самых существенных проблем при лечении больных ММ и длительность жизни больных ММ в основном зависит от чувствительности к лечению противоопухолевыми препаратами. В литературе имеются работы, посвященные исследованию роли белков – транспортеров в возникновении МЛУ при ММ человека. Так, например, показано, что у нелеченных больных ММ экспрессия Pgp обнаруживается только в 1-2% образцов биопсий, тогда как у леченных больных, у которых возник рецидив и они стали нечувствительными к химиопрепаратам, экспрессия Pgp обнаруживается в 40-80% случаев [509]. В другой работе показано, что у 6 % пациентов с ММ до лечения обнаруживается экспрессия Pgp, тогда как после лечения до 85% резистентных к лечению пациентов становятся Pgp позитивными [342]. Еще в одной работе было установлено, что высокий уровень экспрессии мРНК MDR1 в плазматических клетках костного мозга больных ММ может прогнозировать плохую чувствительность к химиотерапии [321]. По литературным данным ген LRP экспрессирован приблизительно у 50% больных ММ и его экспрессия ассоциирована с плохим ответом на лечение больных мелфаланом и, в целом, с более короткой продолжительностью жизни больных ММ [441]. Считается, что LRP может быть использован в качестве важного генетического маркёра для предсказания слабого терапевтического ответа при множественной миеломе. Было показано, что LRP экспрессируется чаще у больных с делецией гена р53 и при повышенной экспрессии Pgp [441]. В отношении гена BCRP известно, что его экспрессия обнаружена в клеточных линиях множественной миеломы, где он является функциональным, а также в образцах костного мозга, полученных от больных множественной миеломой. Предполагается, что BCRP может содействовать возникновению лекарственной устойчивости при множественной миеломе [383, 482]. В литературе также представлены работы, в которых исследовалась экспрессия мРНК MRP1 в образцах костного мозга больных ММ [383, 482]. Данные, полученные в этих работах являются противоречивыми и исследования роли гена MRP1 в возникновении МЛУ при ММ продолжаются. В наших исследованиях мы использовали образцы, полученные от леченных больных ММ, и, действительно, экспрессия мРНК генов, ответственных за возникновение МЛУ, обнаруживается в подавляющем большинстве случаев. Поэтому ММ является тем типом опухоли, которая наиболее подходит для исследования роли IGF-1 в регуляции механизмов возникновения МЛУ при лечении.
В диссертационной работе впервые исследована роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ, при ММ человека с использованием клинического материала (аспиратов костного мозга больных ММ) и линий культур клеток ММ. Впервые установлено, что экспрессия мРНК генов МЛУ - MDR1, MRP1, LRP, BCRP в подавляющем большинстве случаев является высокой в образцах аспиратов, в которых обнаруживается умеренная или высокая экспрессия мРНК IGF-1, и наоборот, экспрессия генов МЛУ слабая в образцах, в которых экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что ген IGF-1 и гены МЛУ при ММ по меньшей мере коэкспрессируются [14]. Также мы впервые исследовали роль IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ в трех линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. Мы впервые показали, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1 ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A и это приводит к ингибированию экспрессии мРНК MRP1 и LRP [17].
Приготовление тотального препарата молочной железы
факторов роста: IL-6, IGF-1, HGF (фактор роста гепатоцитов), HB-EGF (эпидермальный фактор роста, Одним из свойств клеток ММ является их способность мигрировать и локализоваться в костном мозге [1, 12]. В микроокружении костного мозга клетки ММ взаимодействуют с клетками стромы костного мозга и активируют в них транскрипцию и секрецию различных цитокинов и факторов роста: IL-6 (интерлейкин-6), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), TNF- (фактор некроза опухоли - альфа), TGF (трансформирующий фактор роста бета), SDF-1 (фактор стромальных клеток - 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1 типа) и другие цитокины и факторы роста [229, 514]. Воздействие этих факторов на миеломные клетки может придать им более агрессивные свойства – усилить выживаемость, активировать механизмы возникновения лекарственной устойчивости и другие. Поэтому исследование роли цитокинов и факторов роста в злокачественной прогрессии ММ является на сегодня одним из актуальных направлений в экспериментальной онкологии и этому посвящено немало работ. Среди публикаций имеется работа, в которой исследовалось влияние на выживаемость СD45+ и CD45- миеломных клеток комбинации нескольких связывающий гепарин), APRIL (лиганд, индуцирующий пролиферацию). В этой работе было показано, что IGF-1 может являться фактором, повышающим жизнеспособность клеток ММ [514].
Исследование механизмов регуляции жизнеспособности опухолевой клетки является одним из актуальных направлений в экспериментальной онкологии. Известно, что во многих типах злокачественных клеток нарушен механизм, регулирующий запрограммированную клеточную гибель – апоптоз [125]. В результате опухолевые клетки становятся менее чувствительными по сравнению с окружающими их нормальными клетками к различным стрессовым воздействиям, таким как недостаточность факторов роста, поломки ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, тепловой шок, действию противоопухолевых препаратов, направленных на активацию апоптоза в опухолевых клетках [262]. Иными словами, менее чувствительные к апоптозу опухолевые клетки получают преимущество в борьбе за выживание, что является важным шагом на пути к злокачественной прогрессии [364]. На сегодня известны различные цитокины и факторы роста, участвующие в регуляции апоптоза, и одними из них могут быть IGF-1 и его рецептор IGF-1R [469]. В литературе имеются работы, в которых показано, что при ММ IGF-1 и его рецептор IGF-1R, могут проявлять анти-апоптотические функции. Например, в линиях клеток ММ человека IGF-1/IGF-1R – опосредуемый сигнальный путь ингибирует апоптоз, индуцированный культивированием клеток в среде без сыворотки [185] или добавлением в культуральную среду дексаметазона [381, 389, 587]. Некоторые линии клеток ММ, как, например, Karpas 707, сами экспрессируют IGF-1, который аутокринным образом активирует IGF-1R на поверхности клеток [185]. Если в клетках Karpas 707 инактивировать IGF-1R антителами IR3, то аутокринная стимуляция IGF-1R прекратится, и тогда активируется каспаза 3, последняя в цепи цистеиновых протеиназ, которая индуцирует апоптоз. Таким образом, аутокринная стимуляция IGF-1R в клетках Karpas 707 является непрерывной и вполне достаточной для ингибирования апоптоза, зависимого от каспазы 3. В обычной культуральной среде, содержащей сыворотку, непрерывная аутокринная стимуляция IGF-1R приводит к невысокому, однако достаточно хорошо заметному, так называемому базальному уровню фосфорилирования Аkt по сериновому остатку в положении 473. Вместе с тем, если к клеткам Karpas 707 добавить экзогенный IGF-1, то уровень фосфорилирования Аkt заметно возрастет [185]. Учитывая тот факт, что IGF-1 в большом количестве присутствует в сыворотке, а также в микроокружении костного мозга, где он продуцируется различными типами клеток, в том числе фибробластами и остеобластами, можно предположить, что in vivo, клетки ММ получают от IGF-1 дополнительную паракринную стимуляцию. Подтверждением этого сценария был недавно выявленный факт, что для выживания клеток ММ, полученных от больных, необходима экзогенная активация IGF-1/IGF-1R сигнального пути [1].
Известно, что в регуляции апоптоза участвуют различные сигнальные пути.
Например, имеются сведения о роли PI3-K/Akt зависимой киназы GSK-3 в регуляции апоптоза [234, 399, 508]. Cубстратами GSK-3 являются: гликоген синтаза, циклин D1, эукариотический фактор иниациации eIF2B, tau (белок ассоциированный с микротрубочками), а также транскрипционные факторы: с jun, c-myc, -catenin NF-kB [166, 202]. В отличие от большинства киназ, GSK-3 является конститутивно активированной киназой и его активность ингибируется различными факторами роста, в том числе инсулином и IGF-1 в рультате Akt зависимого фосфорилирования по остатку серина в положении 21 и/или 9 [112]. В миеломных клетках Karpas 707 IGF-1R/PI3-K/Akt сигнальный путь конститутивно активирован и, в соответствии с этим, отмечается невысокий, однако достаточно хорошо заметный, так называемый базальный уровень фосфорилирования GSK 3 по сериновому остатку в положении 9. Добавление к клеткам Karpas 707 экзогенного IGF-1 увеличивает степень фосфорилирования GSK-3 по этому сайту. Вместе с тем, использование ингибиторов GSK-3, например LiCl или SB415286, только частично уменьшает апоптотический эффект, вызванный дексаметазоном, в присутствии или без IR3, или ингибиторов PI3-K, что свидетельствует о частичном участии GSK-3 в анти-апоптотическом сигнальном пути, активируемом IGF-1R/PI3-K/Akt. Также показано, что в линии клеток миеломы человека U266 апоптотический эффект наблюдался в результате конститутивной активации JAK/STAT сигнального пути, при котором Stat-3 ингибировал экспрессию bcl-xL, и как, следствие, индуцировался апоптоз [81]. Кроме того было показано, что Stat-3 конститутивно активирован в мононуклеарных клетках костного мозга, полученных от больных ММ, а также в линиях клеток ММ, устойчивых к апоптозу, индуцированному Fas [512]. Таким образом, JAK/STAT сигнальный путь также вовлекается в выживаемость клеток ММ. Среди известных сигнальных путей, регулирующих апопотоз клеток ММ, выделяют три типа сигнальных путей (Рисунок 21). Это PI3-K/Akt сигнальный путь, который, как предполагается является наиболее важным в регуляции выживаемости клеток ММ [230, 239]. Потенциальными активаторами этого пути являются: EGF, bFGF, M-CSF [120], HGF [585], IL-6 [230, 542], а также IGF-1 [185]. Вторым сигнальным путем, вовлеченным в регуляцию выживания клеток МM является сигнальный путь с участием Ras/MAPK (Рисунок 21).
Исследование роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при множественной миеломе человека
В нашей работе мы попытались найти взаимосвязь между ослаблением IGF-1R - опосредуемого сигнала и канцерогенезом молочной железы. Для этого было установлено наблюдение за Tg+ мышами, у которых IGF-1R – зависимый сигнал в клетках эпителия молочной железы был подавлен. Наши наблюдения (в течение одного года) не выявили образование опухолей у Tg+ мышей, что говорит об отсутствии прямой связи между подавлением активности IGF-1R и канцерогенезом молочной железы. К началу нашей работы оставался абсолютно неизученным вопрос, касающийся роли IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли. В диссертационной работе это направление впервые разработано на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Основанием для исследования этих генов послужили данные, которые свидетельствуют о возможном пересечении сигнальных путей с их участием. Недавно было показано, что для рака молочной железы, который классифицируется, как негативный по экспрессии рецептора эстрогена, рецептора прогестерона и амплификации HER-2/neu (triple negative breast cancers,TNBCs), характерна гиперэкспрессия Wnt1 [141, 388] и, что для таких типов опухолей молочной железы также характерна активация IGF-1R -зависимого сигнального пути, который промотирует пролиферацию и выживаемость клеток TNBCs [124, 322].
Для иследования роли IGF-1R - зависимого сигнального пути в Wnt1 опосредуемом канцерогенезе путем скрещивания линий мышей MMTV-dnIGF-1R и MMTV-Wnt1 были получены мыши MMTV-Wnt1/dnIGF-1R, у которых под MMTV промотором в молочной железе одновременно экспрессировались два трансгена. Сравнение времени возникновения опухолей в молочной железе у MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей показало, что у мышей, экспрессирующих одновременно два трансгена, опухоли молочной железы возникают гораздо раньше и у большего количества, чем у мышей экспрессирующих только MMTV-Wnt1 (Рисунок 43).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в Wnt1 - опосредуемом канцерогенезе. Учитывая, что экспрессия dnIGF-1R подавляет активацию IGF-1R, можно утверждать, что ослабление IGF-1R сигнализации в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 ускоряет канцерогенез и увеличивает количество возникших опухолей. Естественно, возникает вопрос: каким образом ингибирование IGF-1R сигналинга усиливает канцерогенез в молочной железе, опосредованный гиперэкспрессией Wnt1? Возможно, что блокирование IGF-1R -опосредуемого сигнала изменяет нормальное развитие клеток эпителия молочной железы таким образом, что они становятся более восприимчивыми к Wnt1 -опосредованной инициации роста опухоли.
В предыдущей главе мы показали, что в результате ингибирования IGF-1R -опосредуемого сигнального пути в клетках эпителия молочной железы мыши происходит нарушение нормальной дифференцировки молочной железы. Возможно ли, что в ходе нарушения дифференцировки происходит изменение в соотношении различных типов клеток, составляющих эпителий протоков молочной железы: стволовых, миоэпителиальных, люминальных и их предшественников? Обратившись к литературе, мы обнаружили, что мишенями Wnt1 - зависимого канцерогенеза являются предшественники люминальных клеток [271, 314, 323]. Эта информация сподвигла нас проанализировать как изменяется популяция предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ мышей по сравнению с Tg- контрольными мышами. Для этого из суспензии свежеизолированных первичных клеток молочной железы, с помощью метода сортировки клеток с активированной флуоресценцией, (fluorescence-activated cell sorting, FACS) и с использованием антител к поверхностным антигенам клеток мы исключили клетки эндотелия сосудов, гематопоэтические и стромальные клетки, то есть получили популяцию клеток Lin-. Далее в полученной популяции Lin- с помощью проточной цитометрии с использованием антител к антигенам: CD24 (heat-stable antigen), CD29 (1-integrin) и CD61 (3 integrin) мы проанализировали как изменяется популяция предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ мышей по сравнению с Tg-контрольными мышами (Рисунок 44).
Рисунок 44 – Проточная цитометрия. Анализ популяции предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ и Tg- мышей. Показано, что у Tg+ мышей количество клеток с фенотипом CD24+CD29loCD61+Lin- составляет 20%, а у контрольных мышей -10%. , р 0,001 (n = 4 независимых анализа).
Наш анализ показал, что у Tg+ мышей количество клеток с фенотипом CD24+CD29loCD61+Lin- составляет 20%, а у контрольных мышей -10% (Рисунок 144 44). То есть ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала в молочной железе мыши приводит к 2-х кратному увеличению популяции предшественников люминальных клеток, которые являются мишенью для Wnt1. Эти данные получены нами впервые и они раскрывают механизм, объясняющий, как блокирование IGF-1R усиливает канцерогенез, опосредованный гиперэкспрессией Wnt1. Более подробно об этом будет говориться в главе “Обсуждение”. Полученные данные являются оригинальными и отражены в нашей статье, опубликованой в журнале Cancer Research в 2014 году [451]. Таким образом, мы впервые показали, что блокирование IGF-1R – зависимой сигнализации приводит к увеличению популяции предшественников люминальных клеток и это может являться основной причиной усиления восприимчивости к Wnt1 опосредуемой трансформации и инициации роста опухоли молочной железы. Чтобы подтвердить, что наше заключение является верным, мы исследовали влияние блокирования IGF-1R – зависимого сигнала на активацию сигнальных путей, регулирующих популяцию предшественников люминальных клеток.
Одним из кандидатов на это исследование являлся Notch сигнальный путь. Известно, что конститутивная активация Notch сигнализации промотирует увеличение популяции недифференцированных предшественников люминальных клеток [66]. Мы исследовали как изменится Notch – завимый сигнал у Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R, по сравнению с Tg- контрольными мышами (дикий тип). Для этого мы получили первичную культуру клеток эпителия, от Tg+ мышей и от Tg- контрольных мышей и с помощью ПЦР в реальном времени исследовали экспрессию гена Hey1 (Рисунок 45), который является мишенью Notch, а также экспрессию другого гена Dll4 (Рисунок 46), который является лигандом Notch. Наше исследование показало, что оба этих гена гиперэкспрессируются в первичных клетках эпителия молочной железы, полученных от Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R.
Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором
Одним из совершенно не изученных к началу нашей работы, оставался вопрос, касающийся роли IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли. В диссертационной работе это направление впервые разработано на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Нами впервые показано, что блокирование IGF 1R - зависимого сигнала может значитительно ускорить канцерогенез молочной железы, опосредуемый Wnt1. Активация Wnt1 сигнала характерна для базальноподобного РМЖ человека [267], который относится к тройному негативному раку молочной железы (triple negative breast cancers, TNBCs). Этот подтип РМЖ, по-прежнему остается одним из наиболее сложных для лечения из за агрессивного характера течения и отсутствия эффективных методов лечения [9, 306, 388, 451]. И поэтому в нашей работе мы провели исследования, направленные на поиск и выявление новых сигнальных путей, активированных при TNBC. Базальноподобный РМЖ по гистологическому строению в большинстве случаев принадлежит к низкодифференцированному протоковому раку [9, 77, 431, 435]. И одной из причин агрессивного течения базальноподобного РМЖ является его происхождение из наименее дифференцированных (возможно даже, стволовых) клеток [9]. Обнаруженное нами ухудшение дифференцировки молочной железы, вызванное блокированием IGF-1R - зависимого сигнала с одной стороны, и активацией Wnt1 -опосредуемого сигнала в низкодифференцируемом РМЖ с другой, явилось для нас первой предпосылкой исследовать роль IGF-1R - зависимого сигнального пути в канцерогенезе, опосредуемом Wnt1. Также важной предпосылкой для наших исследований была информация о том, что для базальноподобного РМЖ характерна активация IGF-1R - зависимого сигнала, который промотирует пролиферацию и выживаемость клеток TNBC [124, 322]. И к началу наших исследований в литературе не было работ, посвященных изучению взаимодействия этих двух сигнальных путей при базальноподобном РМЖ. В нашей работе мы впервые исследовали роль IGF-1R - зависимого сигнального пути в канцерогенезе молочной железы, индуцируемом Wnt1. Для этого исследования путем скрещивания линии мышей MMTV-dnIGF-1R, у которой IGF 1R - опосредуемый сигнал подавлен, с линией мышей MMTV-Wnt1, у которой гиперэксспрессирован ген Wnt1, была получена линия Wnt1/dnIGF-1R, у которой под MMTV промотором в молочной железе одновременно экспрессируются два трансгена. Сравнение времени возникновения опухолей в молочной железе у MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей показало, что у мышей, несущих одновременно два трансгена, опухоли молочной железы возникают гораздо раньше, чем у мышей экспрессирующих только MMTV-Wnt1. Более того, у MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей в молочной железе одновременно возникало большее количество опухолей, чем у MMTV-Wnt1 мышей. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в канцерогенезе, индуцированном Wnt1. Таким образом, в диссертационной работе мы впервые показали, что ослабление IGF-1R – зависимого сигнала в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 ускоряет канцерогенез и увеличивает количество возникших опухолей. Эти данные являются оригинальными и отражены в нашей статье [451]. Учитывая, что экспрессия dnIGF-1R подавляет активацию IGF-1R, можно считать, что ослабление сигнала, опосредованного IGF-1R, в контексте гиперэкспрессии Wnt1 ускоряет канцерогенез и увеличивает опухолевую множественность – т.е. число возникающих опухолевых узлов. Однако, на первый взгляд, это не совсем привычно для восприятия, ибо считается, что гиперэкспрессия IGF-1R ассоциируется с возникновением опухолей во многих типах тканей, включая эпителий молочной железы (cм. главу «Обзор литературы»). Тем не менее, наши результаты показали, что именно понижение уровня экспрессии IGF-1R и ослабление его фосфорилирования имеют противоположный эффект в контексте гиперэкспрессии Wnt1. Проведенные нами исследования на трансгенных мышах показали, что ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала приводит к ухудшению дифференцировки молочной железы (ингибируется третичное разветвление и рост протоков молочной железы, уменьшается количество альвеолярных почек). И было установлено, что основной причиной является сокращение числа стволовых/базальных клеток эпителия. Перед нами встал вопрос: может ли у таких мышей произойти, в ходе нарушения дифференцировки, изменение в соотношении других типов клеток, составляющих эпителий протоков молочной железы, например: миоэпитнелиальных, люминальных и их предшественников? И если да, то количественное изменение, каких именно типов клеток, может привести к усилению восприимчивости к Wnt1 - опосредованной инициации роста опухоли? Обратившись к литературе, мы обнаружили, что мишенями Wnt1 зависимого канцерогенеза являются предшественники клеток эпителия молочной железы [271, 314, 323], включая популяцию предшественников люминальных клеток [271, 314, 323]. Также в 2010 году в работе Molyneux и сотр. было показано, что BRCA1 - опосредованный базальнободобный РМЖ происходит из предшественников люминальных клеток, а не из базальных стволовых клеток [367]. Эта информация сподвигла нас проанализировать как изменяется популяция предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ мышей по сравнению с Tg- контрольными мышами. Наш анализ показал, что, действительно, у Tg+ мышей ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала в молочной железе мыши приводит к 2-х кратному увеличению популяции предшественников люминальных клеток, с фенотипом CD24+CD29loCD61+Lin-. Таким образом, мы впервые показали, что ингибирование IGF-1R – зависимой сигнализации приводит к увеличению популяции предшественников люминальных клеток и это может являться главной причиной усиления восприимчивости к трансформации, опосредуемой Wnt1, и инициации роста опухоли молочной железы. Чтобы подтвердить, что наше заключение является верным, мы исследовали влияние блокирования IGF-1R – зависимого сигнала на активацию сигнальных путей, регулирующих популяцию предшественников люминальных клеток. Одним из кандидатов на это исследование являлся Notch сигнальный путь. Известно, что конститутивная активация Notch – зависимого сигнального пути промотирует увеличение популяции недиффернцированных предшественников люминальных клеток [66]. Более того, Notch – зависимый сигнальный путь участвует в Wnt1 - опосоредуемом канцерогенезе в клетках эпителия молочной железы человека [39]. Мы исследовали как изменится Notch – зависимый сигнал у Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R, по сравнению с Tg- контрольными мышами (дикий тип). Для этого мы получили первичную культуру клеток эпителия, от Tg+ мышей и от Tg- контрольных мышей и с помощью ПЦР в реальном времени исследовали экспрессию гена Hey1, который является мишенью Notch. А также другого гена Dll4, который является лигандом Notch. Наше исследование показало, что оба этих гена гиперэкспрессируются первичных клетках эпителия молочной полученных от Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R. Эти данные говорят о том, что действительно, в клетках эпителия молочной железы блокирование IGF-1R приводит к активации Notch сигнального пути, который промотирует увеличение популяции недиффернцированных предшественников люминальных клеток. Наши данные получены впервые, и они раскрывают механизм, объясняющий, как блокирование IGF-1R усиливает канцерогенез, опосредованный гиперэкспрессией гена Wnt1.