Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор 17
1.1 Рак молочной железы и неоадъювантная химиотерапия 17
1.2 Фенотип множественной лекарственной устойчивости 23
1.3 Характеристика отдельных подсемейств и представителей АВС-транспортеров 30
1.4 Регуляция экспрессии АВС-транспортеров и нормальная генетическая изменчивость
1.4.1. Генный полиморфизм 36
1.4.2. Однонуклеотидные полиморфизмы АВС-транспортеров 37
1.4.3. Однонуклеотидные полиморфизмы генов и экспрессия генов АВС 46
Заключение к литературному обзору 51
Глава 2 Материалы и методы 54
2.1 Материалы 54
2.1.1 Пациенты и лечение 54
2.1.2 База данных больных РМЖ 56
2.1.3 Забор опухолевого материала 59
2.2 Методы 60
2.2.1 Выделение РНК 60
2.2.2 Выделение ДНК 63
2.2.3 Горизонтальный и капиллярный электрофорез 65
2.2.4 Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени 67
2.2.5 Микроматричный анализ .69
2.2.6 Статистические методы 70
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 73
3.1 Формирование скрипта и биоинформационный анализ данных 73
3.2 Полиморфизмы генов множественной лекарственной устойчивости 76
3.3 Доказательство существования функционального экспрессионного кластера генов лекарственной устойчивости и формирование ассоциативной сети 93
3.4 Панели однонуклеотидных полиморфизмов для прогноза направления изменения экспрессии кластера АВС-транспортеров 112
Заключение 121
Выводы .128
Список цитируемой литературы
- Характеристика отдельных подсемейств и представителей АВС-транспортеров
- База данных больных РМЖ
- Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени
- Доказательство существования функционального экспрессионного кластера генов лекарственной устойчивости и формирование ассоциативной сети
Введение к работе
Актуальность исследования. Основной причиной неэффективности неоадъювантной химиотерапии (НХТ) опухоли считают формирование под действием лекарственных средств фенотипа адаптивной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который обусловлен повышением экспрессии генов АВС-транспортеров выбрасывающих широкий спектр химиопрепаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ (Gottesman, Fojo et al., 2002; O'Driscoll and Clynes, 2006; Szakcs, Paterson et al., 2006; Gillet and Gottesman, 2011). Семейство ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), насчитывает 50 представителей и наиболее известные из них: ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2. Роль этих генов в развитии МЛУ была доказана в опытах по их трансфекции в чувствительные к цитостатикам линии клеток и в экспериментах по индукции МЛУ на клеточных линиях (Raghu, Park et al., 1996; Allen, van Loevezijn et al., 2002; Conrad, Kauffmann et al., 2002; Szakcs, Paterson et al., 2006). По результатам исследований клинической значимости экспрессии генов МЛУ в опухолевой ткани молочной железы отмечаются существенные противоречия. Есть сведения о корреляции высокого уровня экспрессии до лечения с отсутствием эффекта химиотерапии и неблагоприятным исходом. Другие работы опровергают связь уровня экспрессии генов МЛУ с эффектом химиотерапии и исходом заболевания (Burger and Nooter, 2004; Gillet and Gottesman, 2011; Wind and Holen, 2011).
Наши предыдущие исследования опухоли молочной железы также
показали, что исходный уровень экспрессии генов АВС слабо коррелирует с
эффективностью НХТ. Однако были получены данные о связи эффекта НХТ
с формированием фенотипа адаптивной МЛУ, который обусловлен
изменением экспрессии генов АВС-транспортеров в опухоли при проведении
химиотерапии. Если в опухоли больных при действии химиопрепаратов
повышается экспрессия АВС-транспортеров, то у таких больных
формируется фенотип адаптивной МЛУ и они не отвечают на НХТ. При
снижении, под действием химиопрепаратов, экспрессии генов АВС в
опухоли не происходит формирование фенотипа МЛУ и отмечается
клинический ответ на НХТ (Litviakov N.V. et al., 2013). Если научиться
прогнозировать направление изменения экспрессии генов АВС-
транспортеров (повышение или снижение) в опухоли у конкретного пациента, то можно будет прогнозировать и формирование фенотипа адаптивной МЛУ и, соответственно, эффективность химиотерапии. К сожалению, непосредственно оценить направление изменения экспрессии генов АВС предиктивно нельзя, поскольку это происходит только при воздействии химиотерапии. Важно понять, какие механизмы связаны с регуляцией экспрессии генов АВС, какие индивидуальные особенности пациентов и их опухолей определяют формирование МЛУ и ответ на химиотерапию. Таким образом, исследования механизмов регуляции актуальны и с точки зрения понимания процессов формирования МЛУ в
опухоли, и с точки зрения возможности разработки на их основе факторов прогноза развития фенотипа МЛУ при проведении химиотерапии.
Основные регулирующие механизмы экспрессии генов АВС-
транспортеров могут быть реализованы как на уровне опухолевых клеток, так и на уровне организма опухоленосителя. Различные сигнальные каскады опухолевых клеток, внутриклеточные мессенджеры и микроРНК участвуют в позитивной регуляции генов АВС (Vicky Goler-Baron et al., 2012, Pan, Morris et al., 2009; Liang, Wu et al., 2010; Zheng, Wang et al., 2010). Гены АВС в опухолях различных локализаций, как правило, имеют гипометилированные промоторы и могут активно экспрессироваться (Scotto 2003; Chekhun, Kulik et al., 2006; Sharma, Mirza et al., 2010).
Таким образом, основные генетические механизмы направлены на регуляцию повышения экспрессии АВС-транспортеров под действием химиопрепаратов. Исследования негативной регуляции экспрессии генов АВС-транспортеров крайне малочисленны. Известно, что с промоторным регионом гена ABCB1 и АВСС1 связывается продукт гена-супрессора опухолевого роста дикого типа p53 и ингибирует транскрипцию этих генов (Thottassery, Zambetti et al., 1997; Johnson, Ince et al. 2001, Chen and Sikic, 2012). По сути, известен один реальный механизм негативной регуляции экспрессии генов АВС, во всех остальных случаях негативную регуляцию можно связать только с нарушением механизмов позитивной регуляции экспрессии генов АВС, в частности с делецией локусов генов АВС в опухоли в 9 до 49% (в зависимости от гена) случаев (Литвяков Н.В. 2014). В остальных случаях механизмы негативной регуляции неизвестны.
До настоявшего времени не был проведен широкий пласт исследований позитивной и негативной регуляции экспрессии генов АВС связанный с индивидуальными особенностями организма опухоленосителя и его опухоли, обусловленными полиморфизмом генов, т.е. нормальной генетической вариабельностью. В литературе имеются отдельные разрозненные исследования связи генного полиморфизма с экспрессией АВС-транспортеров. Прежде всего, конечно, были изучены некоторые полиморфизмы самих генов АВС. За последние несколько лет идентифицировано пара десятков однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП, SNP – Single Nucleotide Polymorphism) в генах АВС, которые имеют значение для их экспрессии и работы АВС-транспортеров: ABCG2 R482T или R482G, ABCB1 rs1045642, ABCC1 rs35605, ABCG2 rs2725264, ABCC2 (rs1885301, rs717620 и rs3740066) и др. (Hoffmeyer, Burk et al., 2000; Robey, Honjo et al., 2003; Henriksen, Gether et al., 2005; Polgar, Ozvegy-Laczka et al., 2006; Tamura, Wakabayashi et al., 2007; Taheri, Mahjoubi et al., 2010; Di Francia, Siesto et al., 2012). Тем не менее, широкомасштабных (хотя бы в широкогеномном формате) исследований с включением большого количества SNP не проводилось. Что касается исследования связи экспрессии АВС-транспортеров с полиморфизмом других генов (не АВС-транспортеров), то такие работы и вовсе крайне малочисленны. В нескольких исследованиях экспрессию генов АВС связывали с отдельными полиморфизмами других
генов (Vega-Glvez, Di Scala et al., 2009; Gillet and Gottesman, 2011; Einert, Schmidt et al., 2012), но это были единичные SNP, которые не показали существенной значимости.
Одним из главных недостатков подавляющего большинства
исследований связи SNP с экспрессией генов АВС в опухоли, на наш взгляд, является то, что SNP изучались в геномной ДНК, а экспрессия в опухоли. В большинстве случаев не учитывалось явление аллельного имбаланса в опухоли, обусловленное потерей гетерозиготных локусов и образованием A/0 и 0/В при делециях или AAB и АВВ генотипов при дупликациях. В опухоли это явление может достигать до 60-70% от всех гетерозиготных локусов (Vattathil and Scheet, 2013). В этой связи нам представляется необходимым анализировать и экспрессию гена и SNP непосредственно в опухоли.
Таким образом, актуальными являются широкогеномные исследования
ассоциации SNP и экспрессии генов АВС в опухоли, которые помогут
выявить гены и их полиморфные локусы, связанные с регуляцией АВС-
транспортеров и разработать панель для прогноза формирования фенотипа
МЛУ до проведения химиотерапии. Кроме этого, еще одним современным
разрабатываемым направлением является построение ассоциативных генных
сетей. В нашем случае использование широкогеномного исследования
позволит провести скрининг и выявить новые гены-кандидаты
предположительно участвующие в регуляции АВС-транспортеров, и на которые могут быть направлены дальнейшие исследования по определению мишеней для управления фенотипом МЛУ в опухоли.
Цель работы:
Широкогеномное исследование ассоциации однонуклеотидных
полиморфизмов и экспрессии генов АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии.
Задачи исследования:
-
Оценить связь полиморфизма генов АВС-транспортеров с их экспрессией в опухоли молочной железы до и после лечения, эффектом неоадъювантной химиотерапии и метастазированием.
-
При помощи анализа коэкспрессии и построения ассоциативной сети показать наличие функционального кластера генов АВС-транспортеров, который определяет ответ опухоли молочной железы на неоадъювантную химиотерапию.
-
Выявить новые гены-кандидаты, участвующие в регуляции кластера АВС-транспортеров и формировании фенотипа МЛУ.
-
Сформировать и валидировать панель полиморфизмов для прогноза направления изменения экспрессии кластера генов АВС в опухоли молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии.
Научная новизна
Впервые на одной группе больных РМЖ проведено исследование экспрессии основных генов АВС-транспортеров в опухолевой ткани
молочной железы до лечения и после НХТ и широкогеномное микрочиповое
исследование генетических полиморфизмов в опухоли. Впервые изучена
связь экспрессии генов АВС и 136 их полиморфизмов в опухоли и
установлены ранее неизвестные SNP, которые ассоциированы с экспрессией
генов АВС. Впервые проведено ассоциативное исследование связи
экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы до лечения и
после НХТ с 749157 SNP в опухоли. Выявлено, что существуют SNP
связанные с экспрессией одновременно четырех генов АВС (АВСВ1, АВСС1,
ABCC2 и АВСG2), для которых была установлена коэкспрессия до лечения и
после НХТ и основная роль в определении ответа опухоли на НХТ. Тем
самым было впервые доказано существование функционального
экспрессионного кластера четырех генов АВС, определяющих формирование
фенотипа адаптивной МЛУ в опухоли молочной железы. Впервые построена
ассоциативная сеть для функционального кластера генов АВС и выявлены
новые кандидатные гены предположительно участвующие в регуляции
экспрессии АВС-транспортеров. Впервые идентифицированы полиморфные
локусы, которые связаны направление изменения экспрессии
функционального кластера четырех генов АВС в процессе НХТ.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные в исследовании результаты расширяют теоретические представления о механизмах формирования лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы при проведении химиотерапии. Показано важное значение генетической вариабельности опухолевых клеток в регуляции экспрессии генов АВС в опухолевой ткани при проведении химиотерапии. Выявлено влияние новых полиморфизмов генов АВС на их экспрессию. Доказано существование функционального экспрессионного кластера четырех генов АВС, определяющих формирование фенотипа адаптивной МЛУ в опухоли молочной железы. Идентифицированы SNP и новые гены, которые участвующие в регуляции функционального кластера генов АВС, которые могут рассматриваться как потенциальные мишени для создания ингибиторов и таргетных препаратов и осуществления управления фенотипом МЛУ в опухоли.
На основе результатов исследования сформирована и клинически
валидирована генетическая панель из 19 полиморфизмов для
прогнозирования направление изменения экспрессии кластера генов АВС в опухоли молочной железы при химиотерапии. Генотипирование опухоли молочной железы до лечения по данным полиморфизмам позволяет с высокой вероятностью прогнозировать формирование фенотипа адаптивной МЛУ и ответ на НХТ, что дает возможность персонализировать назначение неоадъювантной химиотерапии.
Положения, выносимые на защиту:
1. Доказано существование функционального экспрессионного
кластера генов ABC-транспортеров: ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2,
который определяет формирование фенотипа множественной лекарственной устойчивости при проведении неоадъювантной химиотерапии.
2. Панель полиморфизмов связанных с повышением или снижением кластера генов ABC может быть использована для прогноза формирования адаптивной множественной лекарственной устойчивости в процессе неоадъювантной химиотерапии
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на
V-VII конференциях молодых ученых им. Академика Н.В. Васильева (г.
Томск, 2010 - 2012); VIII съезде онкологов и радиологов СНГ и Евразии (г.
Казань, 2014); VIII Российском онкологическом конгрессе (г. Москва, 2014);
международной молодежной научной конференции, г Томск, 20-22 октября
2014 г. «Современные проблемы генетики, клеточной биологии и
биотехнологии»; XII международной конференции студентов, аспирантов и
молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук» (г. Томск,
2015); II международной конференция молодых ученых: биотехнологов,
молекулярных биологов и вирусологов (г. Новосибирск, 2015); 1-ом
Российском онкологическом научно-образовательном форуме с
международным участием «Белые Ночи – 2015» (г. Санкт-Петербург, 2015); VII Съезде российского общества медицинских генетиков, (г. Санкт-Петербург, 2015); конференции «Cellular and molecular mechanism of tumour– microenvironment crosstalk» (г. Томск, 2015), конференции «Молекулярная онкология: итоги и перспективы» (г. Москва, 2015).
Внедрение результатов исследования
Результаты исследование внедрены в учебный курс «Современные методы исследования генома и транскриптома в физиологии» для магистров 2 года обучения кафедры физиологии человека и животных биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета. Создана дополнительная учебная литература для студентов по учебной дисциплине онкология, специальности 060101 – лечебное дело и 060103 – педиатрия по теме «Механизмы множественной лекарственной устойчивости опухоли молочной железы». Зарегистрированы базы данных № 2013621213 от 24 сентября 2013 г. «База данных экспрессионных и клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак молочной железы» и №2015621620 от 30 октября 2015 г. «База данных по нормальной генетической изменчивости опухоли молочной железы и уровня экспресии в ней генов химиорезистентности».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе 7 статей в журналах списка ВАК, из них 3 статьи в зарубежных журналах.
Объем и структура диссертации
Характеристика отдельных подсемейств и представителей АВС-транспортеров
Рак молочной железы (РМЖ) (С.50 по МКБ-10) — злокачественное новообразование (ЗНО), развивающееся из клеток эпителия протоков и/или долек паренхимы железы. РМЖ занимает первое место среди всех онкологических заболеваний у женщин [Чиссов В.И., et al., 2006]. В 2011 г. в России зарегистрированы 57 534 новых больных раком молочной железы. В структуре онкологической заболеваемости женского населения России рак молочной железы занимает 1-е ранговое место (20,4% от всех злокачественных новообразований у женщин) в возрастной группе 40—85 лет и 2-е — в возрастной группе 15—39 лет (после рака шейки матки). Максимальной была доля рака молочной железы в возрастной группе 40—54 года [Аксель Е.М., et al., 2011, Чиссов В., et al., 2012].
В настоящее время системная химиотерапия показана для больных люминальным B, трижды-негативным и HER2 позитивном раке молочной железы. Системная химиотерапия у пациентов с операбельным РМЖ может быть проведена на предоперационном этапе или послеоперационном этапе комбинированного лечения. Предоперационная или неоадъювантная химиотерапия является важным компонентом комбинированного лечения женщин с местно-распространенным раком молочной железы IIIA, IIIB, или IIIC стадиями и может быть использована у женщин с IIA (T2N0 или T1N1) или IIB (T2N1 или T3N0) стадиями РМЖ [Goldhirsch A., et al., 2013, Kaufmann M., et al., 2012, Schwartz G.F., et al., 2004].
Основной целью НАХТ является уменьшение объема первичной опухоли (вплоть до полной элиминации). При больших размерах опухоли применение неоадъювантной терапии позволяет уменьшить объем первичной опухоли и уровень региональной лимфаденопатии, что делает возможным выполнение радикального оперативного вмешательства [Bonadonna G., et al., 1998]. В случае операбельного рака молочной железы использование НАХТ позволяет сократить объем оперативного вмешательства у 50-60 % пациентов и проводить органосохранные оперативные вмешательства [Schwartz G.F., et al., 2004, Senkus E., et al., 2013].
Объективный ответ на НАХТ, который включает полную морфологическую регрессию (ПМР) и частичную регрессию (ЧР), зависит от молекулярного подтипа опухоли молочной железы и схемы НАХТ. Частота ПМР значительно варьирует в зависимости от молекулярных подтипов РМЖ и колеблется от 6-9% при люминальном В типе, до 22-58% при тройном негативном РМЖ [Liedtke C., et al., 2008] [Ritzel M.W., et al., 2001, Rouzier R., et al., 2002, von Minckwitz G., et al., 2012]. Представленные в таблице 1 многочисленные исследования показывают, что при получении полной морфологической регрессии опухоли в ответ на проведенную НАХТ значительно улучшаются отдаленные результаты лечения (общая и безрецидивная выживаемости), и в настоящий момент полную морфологическую регрессию оценивают как ключевой фактор прогнозирования ответа на адъювантную химиотерапию [Bertheau P., et al., 2005, Fisher B., et al., 1998, Kaufmann M., et al., 2006, Kaufmann M., et al., 2003, Kuerer H.M., et al., 1998, Wolmark N., et al., 2001]. Кроме того, в последнее время в литературе появились данные, свидетельствующие о том, что выраженная частичная регрессия опухоли в ответ на НХТ также ассоциирована с улучшением отдаленных результатов лечения [SantamariaMartnez A., et al., 2013].
Самое значимое преимущество НАХТ – это локальное действие в объеме первичной опухоли [Kaufmann M., et al., 2006, Kaufmann M., et al., 2007]. Далее, возможность определения чувствительности опухоли к послеоперационной терапии. Так, прогрессирование роста первичной опухоли после одного-двух курсов НАХТ, может служить сигналом к тому, что данная схема химиотерапии неэффективна, и следует назначение другой группы препаратов. При высокой эффективности НАХТ такая же схема может быть назначена и на этапе АХТ. Послеоперационная химиотерапия, во многом является «слепой» процедурой, так как единственные маркеры активности опухоли (первичная опухоль, метастазы в региональные лимфоузлы и т.д.) удалены и контроль эффективности химиотерапии в значительной степени усложняется [Goldhirsch A., et al., 2013]. НАХТ также может иметь некоторые недостатки: у пациентов с опухолями, резистентными к НАХТ, ее применение бесполезно вследствие заведомой неэффективности [Fisher B., et al., 1998, van der Hage J.A., et al., 2001] было также показано, что НАХТ изменяет прогностическое значение лимфогенного метастазирования [Bonadonna G., et al., 1998, Kuerer H.M., et al., 1999, Rouzier R., et al., 2002].
НАХТ показана при люминальном В, трижды-негативном, и HER2-позитивном РМЖ. Для люминального А типа, для которого характерна экспрессия в рецепторов эстрогена и прогестерона и низкий индекс пролиферативной активности ki67, показана высокая чувствительность к гормональной терапии (тамоксифен, ингибиторы ароматазы), НАХТ не показана, хотя может быть использована в случаях лимфогенного метастазирования. Это связано с тем, что у люминального А типа относительно благоприятный прогноз в сравнении с остальными молекулярными подтипами РМЖ [Cheang M.C.U., et al., 2009, Goldhirsch A., et al., 2013, Hugh J., et al., 2009, Parker J.S., et al., 2009, Yanagawa M., et al., 2012]. Люминальный тип В встречается в 14-18% случаев, для этой группы характерно более частое лимфогенное метастазирование и рецидивирование. В опухоли пациентов также наблюдается экспрессия рецепторов прогестерона и эстрогенов и высокая пролиферативная активность клеток опухоли – высокий индекс ki67. Кроме того, у больных с этим подтипов РМЖ может отмечаться экспрессия HER2, обусловленная амплификацией локуса этого гена в 17 хромосоме. В настоящее время этот вариант РМЖ выделяют в отдельный подтип – трижды-позитивный РМЖ, для которого показано использование и герцептина и химиопрепаратов [Cheang M.C.U., et al., 2009, Hugh J., et al., 2009, Parker J.S., et al., 2009, Sotiriou C., et al., 2009].
Трижды-негативный рак молочной железы не экспрессирует рецепторы эстрогенов, прогестерона и HER2, не чувствителен к гормональной и таргетной терапии (герцептином). Считается одним из наиболее злокачественных молекулярных подтипов РМЖ и характеризуются более низкими показателями выживаемости. Трижды-негативный РМЖ является очень чувствительной к химиотерапии опухолью, в подавляющем большинстве при проведении НАХТ удается достичь полной (до 22-58% случаев) или частичной регрессии. Однако, только ПМР при трижды негативном РМЖ связана с увеличением выживаемости. При трижды негативном РМЖ часто имеются герминальные мутации гена BRCA1, в этой связи трижды-негативный рак особенно чувствителен в НАХТ к антрациклинам и препаратам платины [Carey L., et al., 2010, Imyanitov E.N., et al., 2007, Schneider B.P., et al., 2008]. HER2-позитивный рак молочной железы часто имеет низкие показатели общей выживаемости, высокочувствителен к герцептину, также чувствителен к химиотерапии [Burris H.A., et al., 2011, Theillet C., 2010, Valero V., et al., 2011].
База данных больных РМЖ
Тотальная РНК была выделена из 84 парных образцов до лечения и после НХТ. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, #74134) в соответствии с инструкцией производителя (http://www.qiagen.com/knowledge-and support/resource-center/resource-download.aspx?id=4a299ac7-4a55-4ae0-aaca-f3ae8f66d9c1&lang=en). На первом этапе выделения РНК происходит гомогенизация ткани опухоли молочной железы и денатурация при помощи RLT буфера. Предварительно в RLT буфер добавляли 6-меркаптопурин в соотношении 1:100 (1 доля 6-меркаптопурина / 100 RLT буфера). В пробирку 1,5 мл на один образец ткани добавляли 600-650 мкл RLT-буфера. Материал опухолевой ткани в пробирках с RLT измельчался ножницами. Затем следовал этап инкубации в течении 1-1,5 часов при температуре 55-56С («Термит», ДНК-технология Россия), периодически помешивая на вортексе (FV-2400, Литва). После инкубации пробирки с растворенными образцами ткани центрифугировали 3 минуты на максимальной скорости («Mini Spin Plus», Eppendorf Germany). Затем отбирали супернатант и прогоняли его через спин-колонки 1 (Column DNase) 30 секунд при 8 000 об/мин, на фильтрах которых содержится ДНК-аза, разрушающая геномную ДНК выделяемого образца. После центрифугирования спин-колонки удалялись, а к стоку добавляли равный объем 70% этилового спирта – 600 мкл и перемешивали. Этанол добавляли для того, чтобы обеспечить адекватные условия адсорбции РНК на мембране спин-колонок 2. После добавления этанола образец переносили на спин-колонки 2 (MinElute RNeasy). Эти специализированные колонки содержат кварцевую мембрану, которая специфично связывает РНК в клеточном лизате. Полученный раствор лизата и этилового спирта прогоняли через спин-колонки 2, 15 сек при 10 000 об/мин. Сток из пробирки удаляли при помощи вакуумного насоса. Далее следовали процедуры очистки и промывки адсорбированной на мембране колонок РНК от различных примесей (белков, солей, низкомолекулярных соединений и т.д.). Для этого колонки последовательно промывали промывочным буфером RW1 в объеме 700 мкл, и дважды промывочным буфером RPE, в объеме 500 мкл, которые содержат различные солевые буферные растворы. При этом предварительно буфер RPE разбавлялся 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4, соответственно. После промывки сток также удаляли при помощи вакуумного насоса. Далее для удаления остатков промывочных буферов и подсушивания мембраны фильтра, колонку перемещали в пустую тубу на 2 мл (идет с набором) и центрифугировали 1 минуту на максимальной скорости. После следовал завершающий этап выделения РНК: колонки помещали в новую пробирку с ингибитором РНК аз Ribolock (Fermentas, Lithuania). В колонку, на мембрану, аккуратно добавляли 50 мкл RNase free water и центрифугировали 1 мин при 10 000 об/мин. Потом добавляли еще 30 мкл воды и снова центрифугировали. Пробирка с 80 мкл раствора РНК подписывалась, измерялись спектрофотометрические показатели РНК и ставился капиллярный электрофорез. На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составила от 80 до 250 нг/мкл, А260/А280 = 1,95-2,05; А260/А230 = 1,90-2,31.
Целостность РНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA #5067-5367). RIN составил 5,6 – 7,8. (Рисунок 4). Рисунок 4 – Электрофореграмма и денситограмма тотальной РНК, выделенной из опухоли молочной железы при помощи набора RNeasy Mini Kit Plus (Qiagen, Germany).
Капиллярный электрофорез выполнен на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA). Видны бенды 28S и 18S рибосомальной РНК и показатель целостности РНК - RIN (RNA Integrity Number) составил 7.5. Спектрофотометрические показатели этого образца РНК – А260/280 = 1.95, А260/230 = 2.34, концентрация – 153 нг/мкл
На рисунке 5 представлено фото обычного агарозного электрофореза выделенной РНК и спектрофотометрическая кривая поглощения выделенной РНК. Выделенная РНК хранилась при -80С в низкотемпературном морозильнике (Sanyo, Japan). Использовалась для оценки экспрессии генов АВС-транспортеров при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Рисунок 5 – Электрофореграмма РНК, выделенной RNasy Plus mini Kit (Qiagen, Germany) из опухоли молочной железы и спектрофотометрические кривые поглощения нескольких образцов РНК. На электрофореграмме видны бэнды: 28S и 18S рибосомальной РНК. Дорожка слева – маркер молекулярной массы 100 bp.
ДНК из опухолевой ткани молочной железы выделяли из 84 образцов при помощи набора QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Germany # 51304) в соответствии с инструкцией производителя (http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/resource-center/resource-download.aspx?id=67893a 91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea&lang=en). В основе QIAamp DNA mini Kit лежит методика выделения ДНК образцов опухолевой ткани молочной железы благодаря спин - колонкам. В результате чего, не требуется использование хлороформа и фенола, что позволяет существенно повысить качество и целостность выделяемой ДНК. ДНК специфично связывается с силикагельной мембраной QIAamp колонок, в то время как загрязнители проходят через мембрану в сток. Ингибиторы ПЦР, такие как двухвалентные катионы и белки, полностью удаляются, благодаря двухшаговой процедуре отмывки связанной с мембраной ДНК. В результате промывания, остается чистая ДНК, которая элюируется водой.
К образцу опухолевой ткани в пробирке на 1,5 мл добавляли 100-150 мкл лизис-буфера ALT, содержащего, 0,5% SDS, 8мМ ЭДТА. Далее материал аккуратно измельчали ножницами, а затем добавляли 15-20 мкл протеиназы
К. Пробы перемешивали и ставили инкубироваться в твердотельном термостате («Термит», ДНК-технология Россия) при 56С в течение 1 часа до полного растворения ткани, интенсивно перемешивая. Затем к лизату добавляли 200 мкл буфера AL перемешивали на вортексе (FV-2400, Литва) и инкубировали при 70С 10 мин. После инкубации пробирки с раствором 5-10 секунд прокручивали на вортексе, а затем в пробирку добавляли 200 мкл 96% этанола для создания оптимальных условий для связывания ДНК с силикагельной мембраной QIAamp колонок. Полученный раствор интенсивно перемешивали на вортексе и переносили на QIAamp спин колонки, и центрифугировали на высокоскоростной центрифуге («Mini Spin Plus», Eppendorf Germany) 1 мин на 8000 об/мин. Сток удаляли, а мембрану колонки промывали отмывочными буфером AW1, предварительно разведенного 96% этиловым спиртом, согласно инструкции к набору. Добавляли 500 мкл буфера AW1 и центрифугировали при 8000 об/мин 1 мин. Сток сливали, и в колонку добавляли 500 мкл промывочного буфера AW2, также разведенного этанолом, центрифугировали 3 мин на максимальной скорости, преципитат удаляли. Далее для удаления остатков промывочных буферов и подсушивания мембраны фильтра, колонку перемещали в пустую пробирку на 2 мл (идет с набором) и центрифугировали 1 минуту на максимальной скорости. Затем, колонки переносили в новые 1,5 мл пробирки и в них добавляли 50 мкл элюирующего буфера АЕ (10 mM Tris-Cl; 0.5 mM EDTA; pH 9.0), культивировали при комнатной температуре 1 мин и затем центрифугировали при 8000 об/мин 1 мин. Потом повторно добавляли 50 мкл AE и центрифугировали. Концентрацию и чистоту выделения ДНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA). Концентрация составила от 50 до 300 нг/мкл, А260/А280 = 2.10-2.35; А260/А230 = 2.15-2.40. Целостность ДНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) с использованием набора Agilent Genomic DNA ScreenTape System Quick Guide (Agilent Technologies, USA # 5067-5365) (Рисунок 6). На рисунке 5 хорошо видно, что фрагменты ДНК, в основном, имеют массу более 48 kbp.
Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени
Имеются буквально единичные публикации, где представлены данные о коэкспрессии АВС-транспортеров. В таблице-приложении S1 статьи Kim et al (2013) представлены данные по коэкспрессии изучаемых белков АВС транспортеров. Коэкспрессия белков АВС-транспортеров в опухоли молочной железы: Pgp (продукта гена АВСВ1), Bcpr (продукта гена ABCG2) и Mrp1 (продукта гена АВСС1) до лечения и после НХТ не была выявлена [Kim B., et al., 2013]. Голландские ученые в 2003 году показали значительные положительные парные корреляции между уровнями экспрессии генов АВС, особенно для пар АВСВ1/ABCG2, ABCB1/ABCC1 и MVP/ABCC1 и предположили, что экспрессия этих генов регулируется согласованно [Burger H., et al., 2003]. В других исследованиях были также показаны парные корреляции экспрессии генов АВСВ1 и АВСС1 друг с другом [Kanzaki A., et al., 2001, Lacave R., et al., 1998, Larkin A., et al., 2004]. Большое исследование Moureau-Zabotto L. et al (2006) на 171 больных РМЖ не выявило корреляцию уровней экспрессии АВСВ1 и АВСС1 [Moureau-Zabotto L., et al., 2006]. Учитывая высокую вариабельность методики (qPCR) оценки экспрессии генов и противоречивость литературных данных по оценки корреляции экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы, простая оценка коэкспрессии (посредством корреляционного анализа) является явно не достаточной для доказательства существования функционального экспрессионного кластера генов АВС в опухоли молочной железы. Возникла потребность в других независимых методах для такого доказательства.
Мы попытались выявить полиморфизмы, связанные с экспрессией максимально возможного количества генов АВС, используя все возможные их сочетания от парных до всех семи сразу. C использованием лог-линейной регрессии (с учетом поправки Бонферрони на множественные сравнения) была проанализирована связь SNP с уровнем экспрессии генов АВС до лечения и после НХТ в рецессивной модели наследования. Если группа генов имела общие SNP, связанные с уровнем экспрессии всех генов и экспрессия генов АВС у носителей редкого генотипа была статистически значимо выше или ниже чем у носителей гетерозиготного и частого генотипов, это показывало связь этих генов и давало аргументы в пользу наличия функционального экспрессионного кластера. В результате статистической обработки данных, было показано, что максимально возможную группу образуют те же четыре гена, что и по результатам корреляционного анализа: ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2. Для них было выявлено наибольшее количество перекрывающихся SNP, при введении в группу других генов количество общих SNP равнялось нулю. Перебор всех других возможных вариантов давал максимально возможные группы только из двух генов.
Во всех случаях SNP связаны с экспрессией четырех генов АВС. Установлено, что при наличии мутантных генотипов в опухоли всех вышеописанных полиморфизмов (количество больных с мутантным генотипом колебалось в пределах от 6 до10), кроме SPAG16 (rs35945601), начальный уровень экспрессии всех четырех генов АВС был в 1,5-2 раза статистически значимо выше, по сравнению с опухолями с гетерозиготным или частым генотипом (p 0,001) (Таблица 15). Эти данные подтверждают наличие функционального экспрессионного кластера генов ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2 в опухоли молочной железы до воздействия химиопрепаратов. Рисунок 15 – Уровень статистической значимости связи SNP с экспрессией четырех генов ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2 до лечения.
Примечание: по оси ординат – значение десятичного логарифма уровня статистической значимости (p-level), по оси абсцисс – однонуклеотидные полиморфизмы (n = 258586 SNP). На рисунке красной пунктирной линией обозначено значение номинального p-level, красной сплошной линией значение p-level с учетом поправки Бонферрони.
В настоящее время трудно говорить о том, благодаря каким механизмам, идентифицированные SNP могут оказывать влияние на экспрессию данных генов АВС. Можно только предположить их влияние на экспрессию гена, к которому принадлежит SNP, а уже этот ген влияет на функциональный кластер. По сути, мы показали новый метод установления генных сетей, который дает направление исследования, показывает новые функциональные связи между генами и указывает на мишени для более тщательного исследования. Зная гены, к которым относятся SNP связанные с кластером генов АВС, можно прицельно исследовать связи этих генов с АВС-транспортерами. В результате могут быть установлены новые маркеры для прогноза формирования фенотипа МЛУ. Таблица 15 - Уровень экспрессии генов АВСВ1, АВСС1, АВСС2 и ABCG2 в опухоли молочной железы до лечения в зависимости от генотипа по выявленным полиморфизмам в рецессивной модели наследования
Доказательство существования функционального экспрессионного кластера генов лекарственной устойчивости и формирование ассоциативной сети
Наши исследования позволили установить, что при повышении экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы под действием химиопрепаратов у больных формируется фенотип адаптивной МЛУ и они не отвечают на НХТ. Объективный ответ на НХТ обусловлен негативной регуляцией экспрессии генов АВС-транспортеров, если при воздействии НХТ экспрессия генов АВС в опухоли снижается, то у таких пациентов не происходит формирование фенотипа МЛУ и отмечается клинический ответ на НХТ. Если научиться прогнозировать направление изменения экспрессии генов АВС-транспортеров (повышение или снижение) в опухоли у конкретного пациента, то можно будет прогнозировать и формирование фенотипа адаптивной МЛУ и, соответственно, эффективность химиотерапии. В этой связи необходим поиск маркеров для прогнозирования изменения экспрессии генов АВС-транспортеров в опухоли до лечения. Для их выявления важно понять, какие механизмы связаны с регуляцией экспрессии генов АВС, почему при одной и той же схеме лечения у одних больных происходит снижение экспрессии генов АВС, а у других больных повышение экспрессии, какие индивидуальные, в том числе конститутивные особенности отличают данных пациентов и их опухоли.
В настоящей работе исследовалась нормальная генетическая вариабельность опухоли (представленная однонуклеотидным полиморфизмом), как один из механизмов регуляции экспрессии генов ABC, обусловливающих формирование фенотипа множественной лекарственной устойчивости опухоли молочной железы в процессе НХТ.
В ходе исследования была проведена оценка уровня экспрессии изучаемых генов АВС-транспортеров в опухолевой ткани молочной железы до лечения и после неоадъювантной химиотерапии методом количественной ПЦР в режиме реального времени с реакцией обратной транскрипции. В качестве статистических методов анализа использовались: корреляционный анализ по Спирмену, для определения статистической значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, в отдельных случаях использовали логистическую регрессию, сравнение частот по качественным данным анализировали при помощи двухстороннего критерия Фишера. Для генотипирования опухоли молочной железы был использован микроматричный анализ, который проводили на микроматрицах (ДНК-чипах) высокой плотности. Для обработки результатов микрочипирования использовали программу «Chromosome Analysis Suite 2.0», которая разработана специально для анализа результатов чипирования.
На первом этапе исследования проведено точное форматирование полученных данных микроматрицы. Всего было изучено 749157 полиморфизмов. Далее с использованием программ «R version 3.0.2.» и Tinn-R Editor, был прописан скрип (приложение 1), исключающий из всего массива данных мономорфные полиморфизмы, далее SNP с частотами генотипов, не соответствующими ожидаемым при соблюдении равновесия Харди-Вайнберга, с частотой редкого аллеля менее 3%, а также SNP с частотой редкого генотипа менее 8%. В результате выполненного биоинформационного анализа в итоге осталось 258586 SNP. Расчёт уровня доверительной вероятности был сделан для рецессивной генотипической модели, согласно сравнению показателей информационного критерия Акаике (AIC). Для коррекции доверительной вероятности на множественные сравнения использовалась поправка Бонферрони. В первую очередь, нами было оценено влияние полиморфизмов генов АВС на их экспрессию. Из 136 изученных SNP семи генов АВС, всего лишь несколько генов показали статистически значимую связь с экспрессией собственных генов. Для гена ABCB3 было идентифицировано два SNP (rs241432 и rs241429) связанных с послеоперационным уровнем экспрессии данного гена, с экспрессией ABCC1 и ABCG2 всего по одному полиморфизму (rs3784867 и rs59409230, соответственно). Стоит отметить, что многие из изученных полиморфизмов показали наличие связи только на уровне выраженной тенденции, при уровне значимости менее 0,1 (с учетом поправки Бонферрони). Литературные данные показывают, что многие полиморфизмы в генах АВС влияют не только на их экспрессию, но и на прогноз заболевания, и в частности на общую и безрецидивную выживаемость. Анализ ассоциации частоты анализируемых SNP с эффектом неоадъювантной химиотерапии и метастазированием выявил, что с ответом на проводимое лечение ассоциировано только 1/136 (0,7%) SNP ABCG2 rs3114019 и 5 SNP на уровне выраженной тенденции. В 80% случаев мутантный генотип rs3114019 в опухоли молочной железы обусловливал отсутствие ответа опухоли на химиотерапию. Кроме этого, опухоли с диким генотипом ABCG1 rs225443 (18% случаев) метастазировали реже, чем опухоли с мутантным (60% случаев) генотипом. Несмотря на небольшое количество статистически значимых ассоциаций между полиморфизмами генов АВС и их собственной экспрессией, уже сейчас можно говорить о возможности дальнейшего изучения в плане оценки возможности использования предварительного генотипирования данных полиморфизмов в опухоли в качестве предсказательного и прогностического факторов.
В третьем параграфе главы собственных результатов исследования мы доказали существование функционального экспрессионного кластера генов АВС. В мировой литературе имеется множество исследований посвященных изучению единичных генов АВС-транспортеров. Все исследования, как правило, сводятся к поиску связи экспрессии конкретного гена с эффективностью химиотерапии конкретного химиопрепарата. Использовав корреляционный анализ мы установили группы коэкспрессии генов АВС-транспортеров до лечения и после НХТ. Из таблицы 13 хорошо видно, что наибольшая группа, в которой гены АВС коэкспрессированы, имеет место быть для четырех генов ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2. Изменение экспрессии именно этих генов АВС (+ABCG1) в опухоли при проведении НХТ показало наибольшую статистическую значимость с эффективностью НХТ (4х10-8, 0,0012, 0,0001, 2,0х10-6 соответственно + 0,0001) (Таблица 13). Следовательно, именно эта группа генов определяет формирование фенотипа алаптивной МЛУ в опухоли молочной железы при проведении НХТ. Однако при анализе коэкспрессии ген ABCG1 не показал сильные корреляционные связи с генами ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2 (Таблица 14) и был исключен из кластера.
Учитывая полученные результаты для доказательства существования кластера генов, мы применили еще один независимый метод, связав экспрессию генов ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2 друг с другом через однонуклеотидные полиморфизмы, которые должны показать связь с экспрессией одновременно всех четырех генов АВС.