Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 — Обзор литературы 10
1.1 Фармакологические методы 10
1.2 Хирургические методы
1.2.1 Микропереломы (cтимуляция костного мозга) 13
1.2.2 Хирургические методы с использованием трансплантатов 16
1.2.3 Искусственные материалы
1.2.4. Использование клеточных технологий 21
1.2.5. Применение протезов 27
Глава 2 — Материалы и методы 33
2.1. Использованные средства 33
2.1.1. Использованное оборудование 33
2.1.2. Использованные реактивы и химические вещества 33
2.1.3. Клеточные культуры 34
2.1.4. Экспериментальные животные 34
2.1.5 Программное обеспечение 34
2.2 Методы 34
2.2.1 Методы in vitro 34
Генерация ММСК собаки 34
Выделение спленоцитов мышей 34
Получение клеток опухолевых линий 35
Фиксация и окраска исследуемых образцов 35
Исследование цитотоксичности изучаемых образцов 35
Исследование адгезии клеток к образцам 35
Исследование гемолиза под действием исследуемых образцов 36
Исследование влияния образцов на пролиферацию опухолевых клеток 36
2.2.2 Методы in vivo 37
Изучение влияния исследуемых образцов на динамику роста опухоли, метастазирование меланомы В16 и продолжительность жизни мышей 37
Изучение биосовместимости в опытах in vivo 39
Гетеротопная имплантация 39
Ортотопическая имплантация 39
Гистологические исследования 42
Статистическая обработка 43
2.3 Исследуемые образцы 43
Пористые образцы 43
Непористые образцы 44
Глава 3 – Результаты исследования 45
3.1. Результаты скрининга образцов in vitro 45
3.1.1 Исследования адгезионных свойств образцов 45
3.1.2 Результаты исследования цитотоксичности образцов 53
3.1.3 Исследование индуцированного гемолиза 54
3.2 Изучение влияния образцов на пролиферацию опухолевых клеток, рост и метастазирование опухолей 60
3.2.1 Оценка пролиферативной активности опухолевых клеток при инкубации с образцами 60
3.2.2 Исследования влияния образцов на динамику роста опухоли 66
3.2.3 Исследования влияния образцов на метастазирование опухоли и продолжительность жизни мышей 68
3.3 Результаты исследования биосовместимости образцов in vivo з
3.3.1 Результаты гетеротопной трансплантации образцов 70
Пористый образец 10/90 70
Непористый образец 74
3.3.2 Результаты ортотопической трансплантации 78
Пористый образец 78
Непористый образец 87
Заключение 98
Выводы 108
Список сокращений 110
Список литературы 111
- Хирургические методы с использованием трансплантатов
- Использованные реактивы и химические вещества
- Исследование влияния образцов на пролиферацию опухолевых клеток
- Изучение влияния образцов на пролиферацию опухолевых клеток, рост и метастазирование опухолей
Хирургические методы с использованием трансплантатов
Известно, что при неполнослойном повреждении кости хрящ не восстанавливается из-за отсутствия притока клеток для регенерации [20], поэтому при подобных повреждениях используется абразивная артропластика [58,133,125]. Данный метод представляет собой формирование отверстий очень тонким (1-2 мм) инструментом до лежащей под хрящом кости, чтобы вызвать повреждение сосудов и таким образом обеспечить приток малодифференцированных клеток из костного мозга. В этом случае происходит восстановление с помощью волокнистого хряща. Дефект заполняется тканью, состоящей на 22% из коллагена I типа, на 30% из дегенерирующего гиалинового хряща и на 28% из волокнистого хряща. Этот метод используется в настоящее время при очень небольших повреждениях [133,125]. Существует аналогичный метод микропереломов, при котором повреждение формируется с помощью более толстого (3-5 мм) инструмента [117,34,59], дефект также заполняется волокнистым хрящом по механизму, аналогичному дриллингу. Данный метод показывает хорошие результаты при кратковременном наблюдении, но результаты выглядят хуже при долговременном наблюдении [133]. Микропереломы применяются для восстановления небольших повреждений до 2,5 см [135,160,69]. Наблюдение более 3000 пациентов, подвергнутых микропереломам, показало, что через 5 лет лишь у 67-85% пациентов наблюдалось улучшение [118]. Кроме того, применение данного метода приводит к таким осложенениям как ограниченный объем восстановления и непредсказуемое восстановление гиалинового хряща, следствием чего являются неблагоприятные результаты использования клеточных технологий, проведённых после неудачной попытки применения микропереломов [118].
Описанные методики обладают как преимуществами, так и недостатками. Достоинством их является то, что проводится всего одно хирургическое вмешательство и привлекаются клетки-предшественники из красного костного мозга, в результате формируется хрящ до 4 см толщиной. Недостатком служит восстановление хрящевой ткани путём замещения дефектов волокнистым хрящом. Данная регенерация аналогична естественной неполноценной, при этом не происходит полного восстановления функциональной активности из-за того, что волокнистый хрящ обладает отличной от гиалинового структурой и соответственно механическими характеристиками [133]. Применение дополнительных методик позволяет повысить эффективность описанных выше методов. Усовершенствование их различными дополнениями (например, облегчение доступа клеток костного мозга к месту дефекта, введение аспирата костного мозга в микроперелом, добавка факторов роста, использование различных материалов в качестве скаффолдов) позволяет значительно увеличить эффективность данных хирургических подходов [51,52]. Была опробована комбинация из стержня из биорезорбируемого материала – полилактида, пропитанного дегидроэпиандростероном, предотвращающим разрушение суставного хряща, и данная конструкция была использована для модификации метода микропереломов. В результате были не только улучшены результаты, но и разработан новый метод доставки лекарств [156].
В настоящее время методы сверления и микропереломов используются как первоочередная помощь при восстановлении небольших дефектов хряща – до 2,5 см [120]. Они не обеспечивают полного восстановления повреждения, но являются перспективными, так как применение их модифицированных вариантов помогает улучшить результат и обеспечить недорогое и эффективное лечение небольших повреждений хряща.
Хирургические методы лечения поражений костных тканей включают как отличные от методик лечения хрящевых дефектов (аппарат Илизарова), так и схожие с ними (методика графтов).
Стандартными методами, широко используемыми в клинической практике, являются методики с применением аппарата Илизарова, [15,64]. При их использовании регенерация костной ткани происходит между раздвинутыми поверхностями костей. Данный метод подходит также для исправления деформированных или удлинения укороченных конечностей. При этом используются внешние фиксаторы: аппарат Илизарова [5,64], комбинирование интрамедуллярных стержней и внешних рельсовых раздвижных аппаратов [166], интрамедуллярные удлиняющие аппараты [36]. Однако данные методы имеют недостатки, например: особые требования к удлинению (1 мм в день), длительный период консолидации (в 2 раза дольше времени элонгации) др. [41].
Использованные реактивы и химические вещества
Кровь здоровых доноров разбавляли раствором Хэнкса в 10 раз и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в 5 мл раствора Хэнкса. Отмывку повторяли 2 раза. Полученную эритроцитарную взвесь разбавляли раствором Хэнкса в 10 раз. Затем в каждую пробирку помещали по 6 мл взвеси эритроцитов и образец тестируемого материала [0,60,60,2] см. После этого пробирки встряхивали на шейкере Biosan (Латвия) при 150 об/мин. Пробы взвеси (800 мкл) отбирали через 1,2,3,4 часа и центрифугировали, а надосадочную жидкость пассировали по триплетам в 96-луночный планшет (Nunc, Дания ) по 100 мкл в лунку. Затем пробы помещали в СО2–инкубатор при 37 С на 24 часа, после чего центрифугировали, отбирали супернатант и распределяли его по лункам 96-луночного планшета. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре MSMultiscan (Финляндия) при длине волны 540 нм. Для измерения уровня гемолиза использовались 2 контроля: интактный – с взвесью эритроцитов и контроль с 100% гемолизом, который был получен с помощью введения тритона Х-100 в количестве 10% от объема взвеси эритроцитов. Гемолиз проконтролировали в камере Горяева. Уровень гемолиза оценивали с помощью построения калибровочного графика гемолиза, на котором откладывались значения оптической плотности.
Исследование влияния образцов на пролиферацию опухолевых клеток Перед началом эксперимента опухолевые клетки культивировали в СО2-инкубаторе при 37 С с концентрацией СО2 5% в течение 72 часов. В качестве культуральной среды использовали RPMI1640 с добавкой глутамина, антибиотика и 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Непосредственно перед экспериментом адгезированные клетки MCF-7 и MDA-MB-231 снимали с дна культурального флакона с помощью скребка, затем вместе с культуральной средой помещали в 15 мл пробирки (Costar, США) и центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин. После этого осадок ресуспендировали, доводили концентрацией клеток до 2х104/мл и помещали в лунки 24-луночного планшета по 2 мл в лунку. Все манипуляции с клетками проводили в стерильных условиях. За 48 часов до начала эксперимента образцы помещали на 24 часа в 96% этиловый спирт для стерилизации. После стерилизации образцы отмывали от спирта в стерильном физиологическом растворе в течение 24 часов. Подготовленные образцы и клетки помещали в лунки планшета и инкубировали при при температуре 37о С и 5% концентрации СО2 в течение 48 часов. После этого проводили цитотоксический МТТ-тест.
Манипуляции с лабораторными животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» ЕЭС (Страсбург,1985), руководствуясь требованиями Хельсинской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000), а также рекомендациями, содержащимися в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министра здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977, Приказом Минсельхоза РФ №490 от 05.11.2008 «Об утверждении правил проведения лабораторных исследований в области ветеринарии» и Национальным Стандартом Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р 53434-2009).
Изучение влияния исследуемых образцов на динамику роста опухоли, метастазирование меланомы В16 и продолжительность жизни мышей Данное исследование выполнено в соответствии с рекомендациями из руководства по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ под редакцией Р.У. Хабриева[7] и руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств А.Н. Миронова[4]. Для исследования влияния образцов материала на рост опухолей in vivо были взяты самцы мыши линии С57bl, животных разделили на 6 групп: 1) Контрольная группа, мыши с привитой меланомой В16, не подвергнувшиеся имплантации образца материала, и у которых было проведено удаление первичного опухолевого узла. (n=20) 2) Опытная группа, в которых было проведено удаление первичного опухолевого узла с целью исследования метастазирования, которым были подкожно имплантированы исследуемые образцы 10/90(n=20). 3) Опытная группа, в которых было проведено удаление первичного опухолевого узла с целью исследования метастазирования, которым были подкожно имплантированы исследуемые образцы нано5%.(n=20) 4) Контрольная группа, мыши с привитой меланомой В16, не подвергнувшиеся удалению первичного опухолевого узла. 5) Опытная группа , мыши с привитой меланомой В16, не подвергнувшиеся удалению первичного опухолевого узла с имплантированным с область опухоли пористым образцом 10/90. 6) Опытная группа , мыши с привитой меланомой В16, не подвергнувшиеся удалению первичного опухолевого узла с имплантированным с область опухоли непористым образцом СВМПЭ+5%нано.
Подготовка образцов к эксперименту была начата за 48 часов до начала эксперимента, для стерилизации образцы были помещены в 96% этиловый спирт на 24 часа, после этого образцы были отмыты от спирта в стерильном физиологическом растворе в течение 24 часов. Меланома В16 была привита животным с помощью инъекционного введения клеток опухоли подкожно.Через 7 дней первичный опухолевый узел был удален.
Перед операцией животные были наркотизированы диэтиловым эфиром путем помещения животных в эксикатор, наполненный пропитанной эфиром ватой. Затем рядом с опухолью с помощью ножниц был сформирован карман размером 1х1 см для подкожной имплантации образца и физического контакта образца с опухолью, в который был помещен образец, после чего рана была зашита шелковыми нитями.
Исследование влияния образцов на пролиферацию опухолевых клеток
В результате проведенных исследований было установлено, что экспериментальные образцы не оказывают статистически достоверного влияния на скорость роста опухоли. На 7-ой день после имплантации опухоли у всех трех групп имели размеры без статистически достоверных различий (p 0,05)(рис 22-23).
Для исследования влияния образцов на метастазирование опухоли применялась имплантация образца подкожно мышам, у которых было проведено удаления первичного опухолевого узла. После этого из умерших во время эксперимента мышей изымали легкие и подсчитывали количество метастазов и также считали продолжительность жизни мышей. Через 25 дней все животные были выведены из эксперимента.
В преобладающем числе случаев происходило метастазирование опухоли в лёгкие подопытных животных. Метастазы обнаружены у 60% мышей в случае контрольной и опытной группы с образцом 10/90 и у 70% мышей в группе с образцом СВМПЭ+5%нано. Количество и характер метастазов во всех группах мышей существенно не отличались друг от друга (рисунок 24). Оценка показателей метастазирования не показала статистически значимых различий между контрольной и опытными группами (таблица 6). Исходя из полученных в результате исследования данных, можно утверждать, что исследуемые образцы не влияли на характер метастазирование имплантированной опухоли, так как статистический анализ с помощью критерия Валд-Волфовитца не показал достоверного количества метастазов (Р 0,05)
Легкие, изъятые из мыши контрольной (А) и опытных (Б, В) групп. 25 день эксперимента. В лёгких мышей контрольной группе видны небольшие метастазы (5). В опытных группах: Б – с имплантацией образца 10/90 – в количестве 4-х и В – с имплантацией образца СВМПЭ+5% нано – в количестве 5.
Результаты исследования in vitro действия образцов 10/90 и СВМПЭ+5% нано на опухолевые клетки человека различных линий (MDA-MB-231; MCF-7; К562) показали, что данные материалы являются слаботоксичными по отношению ко всем изученным линиям клеток, в той же степени, что и к ММСК собаки. Выяснено также, что изученные образцы не влияют метастазирование меланомы В16 в легкие подопытных животных и на продолжительность жизни мышей. На основании полученных данных можно заключить, что исследованные образцы не обладают онкогенными свойствами, т.е. не оказывают какого-либо влияния на рост опухоли и её метастазирование у экспериментальных животных.
После проведенного скрининга и оценки влияния биотрансплантатов на опухолевые клетки, на рост и метастазирование опухоли была проведена их гетеротопная трансплантация с целью изучения биосовместимости, стимуляции роста сосудов и реакции организма на образцы при долгосрочной имплантации.
Мышей с подкожно имплантированными образцами содержали в виварии в стандартных условиях в течение 60-дней.
Экспериментальные мыши (с имплантированными образцами) в течение содержания в виварии сохраняли активность, не было отмечено каких-либо отличий их поведения от поведения мышей контрольной группы (без имплантатов). Имплантаты животных, выведенных из эксперимента, были изъяты и исследованы макро- и микроскопически.
Макроскопическое исследование показало биосовместимость пористого образца 10/90 с организмом реципиента при гетеротопной трансплантации (рисунок 25-28). Образец был плотно интегрирован в прилегающие соединительные ткани кожи (рисунок 25). Окружающая его соединительнотканная капсула настолько близко прилегала к имплантату, что невозможно было отделить её при изъятии образца (рисунок 26). Отмечалась обильная васкуляризация выделенных образцов (рисунок 27). Вокруг имплантата не наблюдалось ни признаков острого воспаления или другой патологии, ни характерных признаков отторжения (рисунок 25-26). После гетеротопной трансплантации образцы сохраняли свой размер, форму и структуру.
Изучение влияния образцов на пролиферацию опухолевых клеток, рост и метастазирование опухолей
В настоящем исследовании были изучены образцы новых материалов на основе СВМПЭ, которые перспективны для создания костно-хрящевых имплантатов. Было проведено исследование ,которое состояло из двух частей — предварительный скрининг in vitro для отбора перспективных образцов и исключения неудачных и изучение бисовместимости перспективных образцов. Результаты скрининга выявили перспективные(10/90 и СВМПЭ+5%нано) и неудачные образцы(№1,№2,№3, 20/80,30/70,50/50). Перспективные образцы были подвергнуты дальнейшему изучению, было изучено влияние образцов на пролиферацию опухолевых клеток и метастазирование опухолей, так как изучаемые образцы предполагается использовать для лечения онкологических пациентов.Последним этапом было проведение гетеротопной и ортотопической имплантации с целью изучения биосовместимости прошедших скрининг образцов.
Анализ современных литературных данных приводит к заключению, что материалы, используемые в настоящее время в клинике при замещении дефектов костной и хрящевой тканей, дают удовлетворительные результаты [20] Имплантаты, изготовленные из металла и полимеров, обладают удовлетворительными механическими характеристиками, успешно замещая дефекты кости и хряща. Однако при их применении имеется ряд нерешенных проблем. Одна из основных – резорбция трансплантированных материалов в процессе жизнедеятельности организма реципиентов [11,14]. Срок службы имплантатов ограничен несколькими годами, после чего он обычно ломается. Как показывают исследования, материал имплантата подвергается разрушению с выделением микрочастиц – так называемого дебриса [14]. Частицы материала вызывают повышенную активность иммунной системы организма, что является причиной возникновения воспаленияи и привлечения большего количества иммунокомпетентных клеток в эту область. Развитие иммунных реакций ухудшает состояние тканей в зоне имплантации, приводя к дальнейшему разрушению имплантированного материала и здоровых тканей. Эти процессы вызывают образование еще большего количества дебриса, что в свою очередь приводит к еще более активным иммунным реакциям [14]. Таким образом, решение проблемы резорбции имплантированных материалов служит первостепенной задачей и клиницистов, и исследователей.
Данная проблема изучается достаточно подробно. В литературе имеются сведения о различных формах ответа организма на имплантат в зависимости от материала [173]. Показано, что полимерные материалы и металлы вызывают разные формы ответа организма [173]. Это связано с тем, что дебрис полимеров представляет собой частицы самого материала, в то время как среди частиц износа металлов присутствуют ионы и, таким образом, различные объекты активируют различную реакцию организма [10,19,22]. Полимерные материалы, например СВМПЭ, индуцируют иммунный ответ, осуществляемый реакциями врождённого иммунитета [173]. Материалы на основе СВМПЭ подвергаются воздействию со стороны макрофагов [19,54], гигантских клеток [19,38] и остеокластов [11,62]. Ответ же на металлы осуществляется с помощью клеток адаптивного иммунитета [172], так как выделившиеся ионы привлекают в область имплантата Т- [10,22] и В-лимфоциты [63]. Таким образом, металлы вызывают более сложный и агрессивный ответ и способны индуцировать прямую цитотоксичность [172]. Кроме того использование различных модификаций СВМПЭ позволяет ослабить негативные последствия путем уменьшения количества выделившихся частиц [173].
В лабораториях создаются модели экспериментального получения частиц дебриса для последующего исследования [11]. В результате применения данных методов было отмечено, что металический дебрис вызывает более выраженное воспаление, чем полимерный, изучены различные формы частиц дебриса [14]. Однако точная причина возникновения частиц дебриса так и не установлена [11,14]
С проблемой резорбции имплантатов пытаются бороться разными способами: либо путём модификации состава материала для предотвращения образования дебриса, либо путём понижения активности иммунной реакции с целью охраны от разрушений, вызванных деятельностью иммунной системы [15]. Однако вопрос остается открытым и предложенные методы лишь уменьшают резорбцию, продлевая тем самым срок службы имплантата, но не сохраняя его полностью. Применение заселяемых клетками имплантов также даёт удовлетворительные результаты, хотя уровень «золотых стандартов» ещё не достигнут.
В настоящем исследовании проведена попытка решения проблемы резорбции имплантата с помощью модификации процесса изготовления материала. В этом случае исследовались предназначенные для восстановления хряща образцы, сформированные на основе СВМПЭ и подвергнутые в процессе изготовления механической обработке. СВМПЭ+5%нано, 20\80, 30\70, 50\50. Проведено трехступенчатое исследование свойств материалов, первая часть которого – первоначальная оценка образцов путём скрининга in vitro. Cкрининг включал 3 вида исследований: выявление уровня индуцированного гемолиза, адгезионных свойств с ММСК собаки и спленоцитами мыши и степени цитотоксичности материалов к ММСК собаки.
Пористые образцы №1,№2,№3 полностью разрушились при помещении их в культуральную среду. При изготовлении данных образцов было применено сильное механическое воздействие, которое вызвало обволакивание частиц порошка СВМПЭ кристаллами соли при смешивании смеси порошка СВМПЭ и соли и создало препятствия для спекания частиц.
Результаты цитотоксического теста были удовлетворительными для непористых образцов СМВПЭ+5%нано. Напротив, пористые образцы 50\50 и 30\70 имели индекс цитотоксичности 38-45%. По-видимому, высокий уровень цитотоксичности был связан с большим количеством поваренной соли, остающейся в образцах при обработке. На электронных микрофотографиях экспериментальных образцов выявлялись кристаллы соли на их поверхности. Образец 20\80 имел низкую цитотоксичность по сравнению с другими материалами, хотя на его поверхности также выявлялись кристаллы соли. По-видимому, уровень содержание соли в нём не достигал степени, приводящей к повышению цитотоксического эффекта.
Поваренная соль, используемая для создания пор, должна быть удалена из образца после его изготовления, но этого не произошло в материалах 20/80, 30/70, 50/50. По-видимому, 80%,70% и 50% масса соли оказалась недостаточной для создания необходимого уровня пористости, что затруднило проникновение воды и вымывание соли из материала. Высокие концентрации соли вызывают засаливание среды, что по законам диффузии и осмоса приводит к обезвоживанию клеток и угнетению их жизнедеятельности .
Цитотоксичность непористых образцов, вероятно, была вызвана вымыванием в культуральную среду входящих в их состав частиц оксида алюминия, которые могут оказывать негативное влияние на клетки [79]. Исследование адгезии показало практически полное её отсутствие на поверхности всех непористых образцов, но были отмечены отдельные случаи адгезии на пористых образцах. Данные результаты можно объяснить наличием остатков соли на поверхности некоторых пористых материалов, что затрудняло адгезию клеток. В случае непористых образцов можно предположить, что наличие оксида алюминия делает поверхность данных образцов ещё менее пригодной к адгезии [79].
В исследованиях уровня индуцированного гемолиза образцы 20/80 и 50/50 демонстрировали очень высокие показатели. Образцы 30/70 проявляли некоторую гемолитическую активность, которая, по-видимому, объясняется остатками соли у пористых образцов и возможным вымыванием оксида алюминия из непористых образцов. [79].