Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Биология эстрогеновых рецепторов 9
1.2. Реализация клеточного действия эстрогенов 11
1.3. Эстрогеновые рецепторы Р 15
1.4. Принципы антиэстрогеновой противоопухолевой терапии 18
1.5. Эстрогеновые рецепторы Р в различных опухолях
1.5.1. Рак молочной железы 24
1.5.2. Рак пищевода 26
1.5.3. Опухоли яичников 28
1.5.4. Рак предстательной железы 29
1.5.5. Рак прямой кишки 30
1.5.6. Опухоли головного мозга 31
1.5.7. Рак желчного пузыря 33
1.5.8. Рак эндометрия 34
1.6. Эстрогеновые рецепторы Р в ткани немелкоклеточного рака легкого 35
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Материалы 44
2.2. Методы 45
Глава 3. Результаты исследований 50
3.1. Разработка методики иммунофлуоресцентного проточноцитофлуориметрического анализа экспрессии ЭРр
3.2. Сравнительный анализ экспрессии ЭРр и ЗРрі в ткани немелкоклеточного рака легкого
3.2.1. Общая характеристика экспрессии ЭРР и ЗРРі в опухолевой ткани легкого 63
3.2.2. Экспрессия ЭРР и ЗРРі в ткани немелкоклеточного рака легкого у мужчин и женщин.. 68
3.3. Экспрессия ЭРр в ткани немелкоклеточного рака легкого 71
3.3.1. Общая характеристика экспрессии ЭРР в опухолевой ткани легкого 71
3.3.2. Экспрессия ЭРР в ткани немелкоклеточного рака легкого у мужчин и женщин з
3.3.3. Экспрессия ЭРР в ткани аденокарциномы легкого у некурящих пациентов разного 76 пола
3.3.4. Экспрессия ЭРР в ткани плоскоклеточного рака легкого у курящих и некурящих 78
мужчин
3.3.5. Экспрессия ЭРР в ткани аденокарциномы легкого у курящих и некурящих мужчин 80
3.3.6. Сравнительный анализ экспрессии ЭРР в ткани плоскоклеточного рака и аденокарциномы легкого у курящих мужчин
3.3.7. Сравнительный анализ экспрессии ЭРР в ткани плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы легкого у некурящих мужчин
3.3.8. Сравнительный анализ экспрессии ЭРР в ткани плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы легкого у мужчин
3.4. Сравнительная оценка экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака и окружающей нормальной ткани легкого
3.4.1. Экспрессия ЭРР в опухолевой и окружающей нормальной ткани легкогоиндивидуально у каждого больного
3.4.2. Сравнительная характеристика экспрессии ЭРР в опухолевой и окружающей нормальной ткани легкого в группе пациентов
3.4.3. Сравнительная характеристика экспрессии ЭРР в нормальной ткани легкого пациентов с плоскоклеточным раком и аденокарциномой легкого
3.4.4. Сравнительная характеристика экспрессии ЭРР в нормальной ткани и опухолевой ткани легкого пациентов с разным гистологическим типом немелкоклеточного рака легкого.
3.4.5. Сравнительная характеристика экспрессии ЭРР в опухолевой и окружающей нормальной ткани легкого индивидуально у пациентов с аденокарциномой и с плоскоклеточным раком легкого
3.5. Экспрессия ЭРр в ткани метастатического поражения легкого 104
3.5.1 Общая характеристика экспрессии ЭРР в метастазах в легких 104
3.5.2. Экспрессия ЭРР в метастатической ткани легкого при различной локализации 106
первичной опухоли Глава 4. Обсуждение результатов 109
Выводы 120
Список литературы 1
- Реализация клеточного действия эстрогенов
- Опухоли головного мозга
- Сравнительный анализ экспрессии ЭРр и ЗРрі в ткани немелкоклеточного рака легкого
- Сравнительная оценка экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака и окружающей нормальной ткани легкого
Реализация клеточного действия эстрогенов
На сегодняшний день ни один из сигнальных путей с участием ЭР не изучен досконально, но имеется представление об основных принципах регуляции каждого пути. Раньше полагали, что при связывании лиганда с ЭР происходят конформационные изменения, которые приводят к диссоциации белков теплового шока и образованию рецепторных димеров [203]. Однако недавно было установлено, что димеризация ЭР не зависит от связывания с лигандом [30, 255]. Нелигандные ЭР существуют в цитоплазме в виде стабильных димеров с низкой степенью диссоциации: их время полураспада составляет 39 мин. При добавлении эстрогенов димеры становятся до 7 раз менее подвижными и их степень диссоциации понижается [6, 112]. Эстрогены связываются с ЭР в домене LBD, который состоит из 12 а 13 спиралей, уложенных в трехслойный антипараллельный а-спиральный комплекс. После связывания с лигандом происходит переориентация 12-ой а-спирали и генеририуется новый активационный домен из гидрофобных бороздок на поверхности LBD [314]. Также конформационные изменения в карбоксильной части ЭР улучшают стабильность димера, создают связывающую поверхность для прочного взаимодействия с кофакторами, влияют на складчатость DBD, обеспечивая оптимальное взаимодействие с промотерами целевых генов. Такие лиганд-зависимые аллостерические изменения приводят к диссоциации ЭР и шаперонов и открывают возможность ЭР транспортироваться в ядро. Однако существует механизм регуляции эстрогенового сигналинга на этом этапе. При диссоциации белков теплового шока происходит изменение статуса фосфорилирования ЭР, увеличивается их способность взаимодействовать с различными белками, следовательно, рецепторы становятся мишенью для убиквитинирования лигазами и дальнейшей протеасомной деградации [275]. Деградацию ЭР могут инициировать как изменение уровня эндогенных лигандов, нарушение стабильности шапернов, так и увеличение экспрессии убиквитинирующих лигаз. Таким образом, связывание эстрогена с ЭР не гарантирует, что клеточное действие эстрогена будет реализовано.
Активированные димеры ЭР транспортируются в ядро как часть большого белкового комплекса [267] независимо от присоединенного лиганда [30]. Димеры ЭР представляют собой высокоподвижные молекулы, крейсирующие между целевыми сайтами на хроматине и ядерным матриксом. Они связываются с промотером гена-мишени посредством DBD с цинковыми пальцами и рекрутируют коактиваторы. ЭР-связывающий участок промотера отличается высокой степенью консервативности и состоит из двух инвертированных палиндромных последовательностей PuGGTCA мотива, с которыми могут взаимодействовать как гомодимеры (ЭРа/ЭРа, ЭРр/ЭРР), так и гетеродимеры (ЭРа/ ЭРР) [216]. Транскрипционная активность ЭР зависит от двух последовательностей: лиганд-независимой функции (AF1) и лиганд-зависимой (AF-2). Присутствие этих участков ЭР обеспечивает взаимодействие между рецепторами и коактиваторами транскрипционного комплекса. Хотя эти два домена могут функционировать независимо, максимальная активность ЭР достигается благодаря синергии доменов [179]. Независимо от присутствия эстрогенов белок с вильчатой головкой FoxAl взаимодействует с регуляторным гетерохроматиновым регионом гена-мишени. Именно взаимодействие димера ЭР с FoxAl позволяет осуществить связывание рецепторов с ДНК, после чего происходит рекрутирование белков коактиваторного комплекса, необходимых для инициации транскрипции гена-мишени [36]. Функция коактиваторного комплекса заключается в изменении структуры хроматина благодаря действию АТФ-зависимых хроматин-ремоделирующих ферментов в сочетании с факторами, которые содержат гистон-ацетил-трансферазную активность (HAT) [200]. Комплекс состоит из непосредственно коактиваторов (например, SRC1, SRC3), корегуляторных белков, убиквитинирующих лигаз для белкового ремоделирования (изомеразы, хит-шок белки, протеасомы), а такой коактиватор как р160 (или MNAR/PELP3) рекрутирует ещё и белковые метилтрансферазы [116]. Непосредственно с ЭР взаимодействует очень широкий спектр коактиваторов: например, DRTP205/TRAP220/PBP (компонент DRIP/TRAP медиаторного комплекса) [73, 158], PGC-1 (коактиватор экспрессии ключевых генов энергетического обмена клетки) [224], SNURF (малый ядерный С(3)НС(4) пальчиковый белок) [56], NCoA-7(ERAP140) (коактиватор ядерных рецепторов) [290]. При этом важно отметить, что ЭРа и ЭРР отличаются по спектру кофакторов, с которыми они могут взаимодействовать. Например, ЭРР, в отличие от ЭРа, может взаимодействовать с SRC-1 [83]. Некоторые коактиваторы (активатор РНК стероидных рецепторов SRA и РНК хеликаза р68/р72) взаимодействуют с AF-1 доменом ЭРа и увеличивают стабильность активатор ного комплекса [11]. Все упомянутые белки локально модифицируют хроматиновую структуру, формируя сайт посадки РНК-полимеразы II и обеспечивая работу транскрипционной машины, а значит, и активацию генной экспрессии. Таким образом, реализуется классический сигнальный путь ЭР.
Эстрогензависимые гены демонстрируют циклическую транскрипцию, которая может прекратиться довольно быстро. Поэтому требуется подтверждение транскрипционного сигнала каждые 60 мин [35]. Причина заключается в том, что связывание димеров ЭР с промотерами генов-мишеней происходит не постоянно, а циклически, и требует активационных эпигенетических процессов. После транскрипции целевого гена происходит реструктурирование промотерного комплекса и его протеасомная деградация, в результате которой ЭР разрушаются. Показано, что период существования ЭР после связывания с лигандом 45 мин, в то время как нелигандный существует лишь 20 мин [12].
Как известно, в дополнение к классическому сигналингу ЭР могут не связываться с хроматином, а действовать как активаторы, взаимодействуя с целым рядом других ДНК-связывающих транскрипционных факторов: API (активационный белок), SP1 (белок специфичности), CREB (цАМФ-зависимый белок), RUNX1, h53, NF-kB (ядерный фактор), STAT5 (трансдуктор сигнала и активатор транскрипциии) [153, 221]. Наличие транскрипционного ответа на эстрогены возможно и в случае отсутствия самого лиганда [29]. Регуляция ЭР также может модулироватся митогенными путями эпидермального фактора роста (EGF), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), информационными циклическими АТФ и дофамином [75, 281]. Эти сигнальные каскады могут либо влиять на ЭР напрямую, либо регулировать активность их корегуляторов. Например, активация рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) с помощью EGF приводит к тому, что протеинкиназа МАРК р44/42 фосфорилирует Serl 18 в AF-1 домене ЭР. Следствием изменения конформации ЭР является рекрутирование ко-активаторов р68/р72 и активация транскрипции целевых генов по лиганд-независимому пути. Другим примером лиганд-независимого сигналинга ЭР является взаимодействие протеинкиназы А (РКА) с цАМФ, в результате которого происходит фосфорилирование ЭР и увеличение количества транскриптов гена-мишени [15].
Некоторые ЭР ассоциированы с цитоплазматической мембраной с помощью специального белка адаптера (caveolin-І или She) [63] и могут опосредовать быстрые негеномные эффекты эстрогена, которые проявляются уже в течение 3-15 мин. после действия гормона [38, 218, 250, 291]. В этом случае лигандные ЭР модулируют G-белки, тирозинкиназы и рецепторы ростовых факторов, приводя к активации низлежащих протеинкиназ (МАРК, 3 -ОН kinase, РКА, РКС). Этим способом быстро реализуются важные действия эстрогенов, например, ремоделирование актинового цитоскелета [155].
Опухоли головного мозга
Аналогично, при анализе ЗРРі, разные режимы постановки эксперимента позволили получить одинаковые результаты: 59% и 61% окрашенных клеток (рис. 9е). Однако, в большинстве случаев определяемая доля клеток, экспрессирующих антиген, увеличивается при использовании «ночной» инкубации с антителами, что справедливо как по отношению к ЭРР, так и к ЭРРь Таким образом, можно заключить, что инкубация с первичными антителами в течение 15-20 ч. и с вторичными в течение 1,5 ч. необходима для достижения достоверного результата при клиническом иммунофлуоресцентном анализе экспрессии ЭРР и ЗРРі в солидных опухолях человека.
Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что в результате исследования был создан алгоритм проведения количественного анализа экспрессии ЭРР и ЗРРі в солидных опухолях человека, годный для клинического применения. Концентрация специфических антител к ЭРр, мкг/мл
Зависимость количества специфического окрашивания образцов немелкоклеточного рака легкого человека от концентрации антител к ЭРР (а, б, в) и ЗРРі (г, д, е) при различной продолжительности инкубации с первичными и вторичными антителами. Продолжительность инкубации клеток с первичными и вторичными антителами: — - 30 мин и 30 мин.; — - в течение ночи и 1,5 ч. Представлены результаты типичного для конкретных условий эксперимента, который повторен не менее 3-х раз. По оси абсцисс - количество антител; по оси ординат - количество специфически флуоресцирующих клеток относительно изотипического контроля (%).
В соответствии с разработанной методикой, фиксацию и хранение суспензии клеток для возможного повторного исследования целесообразно проводить 4% раствором формальдегида. Количество клеток в суспензии при инкубации с антителами может быть уменьшено от 1 млн. до 100 тыс. в случае минимального размера исследуемого образца опухоли, получаемого при эндоскопическом исследовании или взятии биопсии. По этой же причине допустимо варьирование количества клеток, анализируемых на проточном цитофлуориметре, от 5 тыс. до 500, хотя, безусловно, при анализе большего количества клеток вероятность ошибки измерения меньше.
Адекватным и уменьшающим время анализа является сокращение числа отмывок клеток за счет увеличения до соотношения 1:10 и 1:20 объема промывочного раствора фосфатного буфера: 1 раз - после пермеабилизации и 2 раза - после инкубации с антителами. Продолжительность инкубации с первичными антителами в течение 15-20 ч. (ночная инкубация), а с вторичными - 1,5 ч., является оптимальной с точки зрения большей чувствительности метода, сокращения расхода антител, а также удобства проведения анализа, учитывая нерегламентированность времени получения опухолевого образца и регламентированность продолжительности ежедневной работы клинических лабораторий (табл. 4). Также важно отметить, что при каждом анализе опухолевого материала человека в качестве референсной культуры для контроля активности антител необходимо использовать культуру клеток рака молочной железы линии MCF-7.
И, наконец, отдельный важный вопрос касается концентраций антител, которые необходимо использовать для получения достоверных количественных данных о доле клеток, экспрессирующих ЭРР или ЗРРі в исследуемой суспензии клеток, и, следовательно, - в исследуемом образце опухоли. Считаем, что это должен быть диапазон концентраций, в который включены как область линейной зависимости флуоресцентного специфического окрашивания клеток от концентрации антител, так и область плато. Применительно к культуре клеток MCF-7 эти условия выполняются при концентрациях антител к ЭРР 0,6; 1,2 и 2,5 мкг/мл и при разведении коммерческого раствора антител к ЗРРі в соотношении 1:200; 1:100 и 1:50. При исследовании экспрессии антигенов в солидных опухолях человека, необходимо использовать более высокие концентрации антител, так как при этом увеличивается вероятность получения повторов в области плато, то есть в области выявления всех клеток, экспрессирующих исследуемый маркер. Так, для антител клона 14С8 эти значения составляют 1,2; 2,5 и 5 мкг/мл, а для антител клона EMR02 - разведения коммерческого раствора 1:100; 1:50 и 1:25. В отдельных случаях, если область плато в указанном диапазоне концентраций антител не достижима, анализ должен быть повторен с большими концентрациями антител.
В ходе экспрессии гена ЭРр образуются различные изоформы белка, единственной полноразмерной из которых являются ЭРРь Аминокислотная последовательность ЗРРі имеет сайт связывания с лигандами (эстрогенами и антиэстрогенами), поэтому рецепторы данного типа опосредуют прямой эстрогеновыи сигналинг и являются мишенями для антиэстрогеновои терапии. При цитофлуориметрическом анализе с использованием антител, специфичных к ЭРР, определению подвергают тотальную белковую фракцию ЭРР, которая представляет собой совокупность всех изоформ. Однако доля ЗРРі относительно других изоформ варьирует в зависимости от типа анализируемой ткани. На сегодняшний день отсутствует однозначное представление о том, как соотносятся показатели экспрессии ЭРР и ЗРРі в ткани немелкоклеточного рака легкого. Более того, иногда в публикуемых исследованиях можно обнаружить случаи, когда авторы анализируют один тип рецепторов, а в выводах фигурирует другой. В связи с этим, задача данного раздела - определить, можно ли, охарактеризовав экспрессию ЭРР в образце немелкоклеточного рака легкого, судить об экспрессии ЗРРі и, тем самым, прогнозировать течение болезни или эффективность антиэстрогеновой терапии. Для этого провели сравнительный анализ экспрессии ЭРР и ЗРРі в ткани немелкоклеточного рака легкого группы 32 пациентов (16 мужчин и 16 женщин). Экспрессию эстрогеновых рецепторов в опухолевой ткани оценивали согласно разработанному и запатентованному методу иммунофлуоресцентного анализа с помощью проточной цитофлуориметрии. Использовали первичные моноклональные антитела клона 14С8 (Abeam), специфичные к N-терминальному домену белка ЭРР, и клона EMR02 (Novocastra), паратоп которых комплементарен фрагменту С-концевого домена белка (этот фрагмент присутствует лишь в полноразмерной изоформе рецептора). Для получения достоверных данных о доле клеток, экспрессирующих рецепторы в исследуемом образце опухоли, использовали диапазон концентраций антител, в который включены как область линейной зависимости флуоресцентного специфического окрашивания клеток от концентрации антител, так и область плато. Все обсуждаемые в работе количественные характеристики экспрессии маркера получены при достижении области плато. Для контроля активности антител и корректности условий проведения анализа в каждом эксперименте использовали референсную культуру клеток рака молочной железы человека линии MCF-7.
Презентированность эстрогеновых рецепторов в анализируемой ткани описывали двумя показателями: уровнем и интенсивностью экспрессии. Уровень экспрессии представляет собой долю клеток, экспрессирующих рецепторы, выраженную в процентах. Интенсивность экспрессии отражает количество исследуемого маркера в экспрессирующих его клетках и рассчитывается как отношение флуоресценции клеток, окрашенных специфическими антителами, к аналогичному показателю после окрашивания изотипическими антителами (в относительных единицах).
Одним из важных вопросов при оценке результатов иммунофлуоресцентного анализа было установление порогового уровня флуоресцентного окрашивания, превышение которого свидетельствует об экспрессии ЭР в опухолевой ткани. Многократное повторение анализа одних и тех же образцов позволяет утверждать, что совокупная погрешность определения уровня экспрессии эстрогеновых рецепторов не превышает 10%. Поэтому ЭР-положительной тканью считали лишь ту, в которой доля специфически флуоресцирующих клеток более 10%.
Сравнительный анализ экспрессии ЭРр и ЗРрі в ткани немелкоклеточного рака легкого
Таким образом, можно утверждать, что у мужчин с аденокарциномой легкого уровень, интенсивность и частота экспрессии ЭРР выше, чем у пациентов с плоскоклеточным раком легкого.
В завершение данного раздела резюмируем приведенные этапы анализа. Почти все проанализированные в работе образцы немелкоклеточного рака легкого экспрессируют ЭРр. Для опухолей большинства пациентов характерны умеренный или высокий уровень, а также высокая интенсивность экспрессии маркера. При этом показано, что ЭРР более выражены в опухолях женщин, нежели мужчин. Кроме того, среди женщин, по сравнению с мужчинами, в 2 раза чаще выявлялся высокий уровень экспрессии ЭРР и в 3 раза реже - низкий уровень. Однако полученные данные не позволили судить о половых различиях в экспрессии рецепторов, поскольку фигурирующие в исследовании мужчины и женщины различались по морфологическому варианту опухоли и статусу курильщика. Для установления взаимосвязи между обсуждаемыми клинико-патологическими факторами и экспрессией ЭРР был проведен сравнительный анализ экспрессии маркера в различных группах образцов, отличающихся лишь по одному фактору. Так, было установлено, что некурящие мужчины и женщины с аденокарциномой имеют одинаковый уровень, интенсивность и частоту экспрессии ЭРР, что свидетельствует об отсутствии влияния пола на рецепторы на этой группе пациентов.
Сравнительный анализ показателей экспрессии маркера в опухолевой ткани курящих и некурящих мужчин с плоскоклеточным раком легкого не продемонстрировал различий между группами. Аналогично, экспрессия ЭРР как среди курящих, так и среди некурящих пациентов с
аденокарциномои была одинаковой. Таким образом, было установлено отсутствие зависимости экспрессии ЭРР в ткани рака легкого от статуса курильщика.
Финальный этап сравнительного анализа был посвящен обнаружению возможной корреляции между гистологическим типом опухоли и выраженностью ЭРР в ней. Для этого сравнению подвергали некурящих (либо курящих) мужчин с плоскоклеточным раком и аденокарциномои легкого. Дополнительно сопоставили количественные характеристики экспрессии маркера у всех мужчин с аденокарциномои и всех мужчин с плоскоклеточным раком легкого. Во всех случаях ткани аденокарциномы экспрессировали ЭРР на более высоком уровне и с более высокой интенсивностью, чем плоскоклеточный рак легкого. Также среди пациентов с аденокарциномои чаще встречались образцы опухолей с высокими показателями экспрессии, чем при плоскоклеточном раке. Это позволило заключить, что экспрессия ЭРР в опухолевой ткани соотносится с гистологическим типом рака легкого.
На основании вышесказанного можно утверждать, что половая принадлежность пациента и статус курильщика не оказывают влияния на экспрессию ЭРр. Только гистологический тип опухоли (аденокарцинома) ассоциирован с выраженной экспрессией маркера. Таким образом, тот факт, что немелкоклеточный рак легкого у женщин характеризуется значительно более высокими показателями экспрессии ЭРР по сравнению с мужчинами, есть отражение того, что преобладающим морфологическим вариантом немелкоклеточного рака легкого у пациенток женского пола является аденокарцинома.
В рамках данной работы планировалось установить, существует ли взаимосвязь между экспрессией ЭРР в опухолевой и соответствующей нормальной ткани легкого. В качестве когорты больных, подвергшихся анализу, были выбраны 36 курящих пациентов мужского пола, страдающих немелкоклеточным раком легкого: 18 человек с аденокарциномои и 18 - с плоскоклеточным раком. Оценку экспрессии ЭРР в опухолевой и нормальной ткани проводили, как и на всех других этапах исследования, с помощью разработанного авторами метода иммунофлуоресцентного проточноцитофлуориметрического анализа. В ткани каждого больного были определены уровень и интенсивность экспрессии рецепторов.
Примеры иммунофлуоресцентного окрашивания ЭРР в нормальной ткани легкого (НТЛ) и ткани немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) троих пациентов, а - показатели экспрессии ЭРР в образцах НТЛ и НМРЛ равны; б - показатели экспрессии ЭРР в образцах НТЛ меньше, чем в НМРЛ; в - показатели экспрессии ЭРР в образцах НТЛ больше, чем в НМРЛ. Количественный анализ экспрессии эстрогеновых рецепторов проводился в соответствии с методикой, разработанной авторами. Представлены гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности специфической флуоресценции. По оси абсцисс -интенсивность флуоресценции (усл. ед.), по оси ординат - количество клеток. Закрашенные гистограммы - клетки после инкубации с изотипическими антителами, незакрашенные - после инкубации с антителами к ЭР. Стрелками отмечена доля специфически флуоресцирующих клеток в процентах, в скобках - отношение интенсивности специфически флуоресцирующих клеток к изотипической.
Экспрессия ЭРР была обнаружена в ткани 89% образцов нормального легкого и в 92% опухолевых образцов. При этом у 44% проанализированных пациентов значения уровня экспрессии маркера в нормальной и опухолевой ткани совпадают, у 39% больных количество клеток со специфической флуоресценцией повышается в ходе малигнизации, а у оставшихся 17%, наоборот, понижается. Интенсивность экспрессии рецепторов в нормальной и опухолевой ткани одного и того же пациента меньше подвержена вариации: у 83% больных она совпадает, однако у 6% возрастает в ходе канцерогенеза и у 11% - убывает.
Полученные данные не позволяют обнаружить взаимосвязь между уровнем и интенсивностью экспрессии ЭРР в нормальной ткани легкого пациента и в опухолевой ткани. Поэтому можно заключить, что экспрессия ЭРР в немелкоклеточном раке легкого не предопределена наличием рецепторов в соответствующей нормальной ткани, а является характеристикой опухоли, приобретаемой в ходе малигнизации.
Сравнительная оценка экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака и окружающей нормальной ткани легкого
Обсуждаемый в работе показатель интенсивности экспрессии ЭРР представляет собой соотношение интенсивностей флуоресценции клеток, окрашенных специфическими антителами и изотипическими. Интенсивность экспрессии ЭРР отражает количество молекул антигена в клетках анализируемой ткани, которое, в свою очередь, зависит от баланса между двумя процессами -синтезом рецепторов и их протеасомной деградацией [35]. Регуляция этих процессов осуществляется эстрогенами на транскрипционном (контроль экспрессии генов ЭРР), посттранскрипционном (контроль стабильности мРНК) и пост-трансляционном (контроль убиквитинирования и деградации рецепторов) уровнях. Кроме гомологичной регуляции существует также и гетерологичная, т.е. с помощью других стероидных гормонов, не являющихся лигандами для ЭРР [2, 3, 18]. Но уровень стероидных гормонов, воздействующих на клетку, меняется в течение времени, вследствие чего происходит осцилляция количества эстрогеновых рецепторов. Иными словами, интенсивность экспрессии ЭРР является лабильным показателем, который зависит от нестабильных внешних факторов, влияющих на содержание гормонов в крови. Поэтому данная характеристика экспрессии рецепторов представляется малоинформативной, поскольку описывает их содержание в клетке лишь в момент получения опухолевого образца. Таким образом, значение интенсивности экспрессии ЭРР не позволяет прогнозировать течение болезни или ответ опухоли на терапевтическое воздействие. Безусловно, чем больше в клетке молекул ЭРР, тем выше вероятность, что пролиферативное действие эстрогенов реализуется быстрее и эффективнее, что, в свою очередь, может сказаться на агрессивности течения заболевания. Однако взаимосвязь между противоопухолевыми эффектами антиэстрогенов и количеством молекул-мишеней в каждой клетке вызывает сомнения. Теоретически, сколько бы не было молекул ЭРР в клетке, их функциональная блокировка с помощью антиэстрогенов все равно приведет к остановке передачи пролиферативного стимула и угнетению опухолевого роста. Для прогнозирования эффективности гормонотерапии, равно как и для оценки течения заболевания, более важным представляется информация о том, во скольких клетках опухолевого узла реализуется и, соответственно, может быть заблокирована эстроген-зависимая пролиферация. В соответствии с разработанной методикой определения рецепторов, долю ЭРР-экспрессирующих клеток отражает такой показатель, как уровень экспрессии маркера. Итак, по мнению авторов, при оценке эстрогенового статуса опухоли необходимо рассматривать уровень экспрессии ЭРР, а не её интенсивность, поскольку второй показатель является лабильным и не позволяет прогнозировать ответ малигнизированных клеток на антиэстрогеновую терапию.
На первый взгляд, определение эстрогенового статуса в образце удаленной опухоли с целью планирования адъювантной гормонотерапии может показаться нелогичным, поскольку анализируемая ткань больше не присутствует в организме человека и, соответственно, не может подвергаться воздействию антиэстрогенов. Но нельзя исключать, что после хирургического удаления опухолевого узла, возможна миграция некоторых оставшихся малигнизированных клеток в другие органы, что приведет к новому злокачественному процессу (рецидивированию или метастазированию). Известно, что метастазы формируются из клеток первичной опухоли. Мы считаем, что уровень экспрессии ЭРР (доля ЭРР-положительных клеток опухолевого узла) отражает вероятность формирования метастазов с тем или иным эстрогеновым статусом. Например, если 80% клеток первичной опухоли экспрессируют ЭРР, то вероятность формирования содержащих маркер метастазов этой опухоли значительно выше по сравнению с опухолью, в которой рецепторы присутствуют лишь в 10% клеток. Поэтому ожидаемая эффективность антиэстрогеновой терапии в первом случае выше, чем во втором. Таким образом, предлагаемое авторами назначение антиэстрогенов в адъювантном режиме при лечении немелкоклеточного рака легкого ориентировано на профилактическое подавление пролиферативного сигнала в оставшихся после операции опухолевых клетках и предотвращение метастазирования.
Одной из задач данного исследования являлось обнаружение корреляции между экспрессией ЭРР и некоторыми клинико-паталогическими характеристиками немелкоклеточного рака легкого: половой принадлежностью пациентов, статусом курильщика и гистологическим типом опухоли.
Сравнительный анализ экспрессии ЭРР в опухолевой ткани у пациентов мужского и женского пола продемонстрировал, что средний уровень маркера выше в опухолях женщин, чем мужчин. Кроме того, частота встречаемости образцов немелкоклеточного рака легкого с высоким уровнем экспрессии маркера в два раза выше среди женщин, чем среди мужчин. На первый взгляд, обнаруженные закономерности свидетельствуют о том, что экспрессия ЭРР ассоциирована с половой принадлежностью пациента. Однако этот вывод нельзя считать корректным из-за сильного отличия сравниваемых групп по другим клинико-паталогическим характеристикам. Так, почти все женщины, участвующие в исследовании, не курили и были больны аденокарциномой легкого, в то время как большинство мужчин являлись курильщиками с плоскоклеточным раком легкого. Поэтому на следующем этапе исследования сравнению подверглись показатели экспрессии ЭРР некурящих мужчин и женщин, страдающих аденокарциномой легкого. Статистически значимых различий между экспрессией маркера и частотами его встречаемости в обеих группах обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии взаимосвязи между экспрессией ЭРР в ткани немелкоклеточного рака легкого и полом пациента. Далее в ходе поэтапного сравнения различных групп пациентов удалось показать, что курение не влияет на статус ЭРР в опухолях больных как с аденокарциномой, так и с плоскоклеточным раком. Напротив, связь между гистологическим типом немелкоклеточного рака легкого и экспрессией ЭРР была обнаружена. Установлено, что средние показатели экспрессии ЭРР в опухолях пациентов с аденокарциномой значительно выше, чем у больных плоскоклеточным раком легкого. Обнаруженная закономерность позволяет объяснить вывяленную ранее повышенную экспрессию маркера среди женщин (у большинства из которых диагностирована аденокарцинома) по сравнению с мужчинами. Кроме того, полученные результаты соотносятся с данными современной литературы. Рассмотрим три факта: у пациентов женского пола чаще, чем у мужчин, обнаруживается аденокарцинома легкого; прогноз течения немелкоклеточного рака легкого для женщин благоприятнее, чем для мужчин; ЭРР является благоприятным прогностическим маркером течения немелкоклеточного рака легкого [32, 95, 240, 266, 292, 313]. Установленный факт повышенной экспрессии ЭРР в ткани аденокарциномы легкого прекрасно встраивается в эту логическую цепочку. Так, уровень ЭРР, как благоприятного прогностического маркера, высок в ткани аденокарциномы, поэтому выживаемость женщин, у которых чаще всего диагностируют аденокарциному, лучше, по сравнению с мужчинами. Также известно, что для аденокарциномы легкого свойственны более быстрый рост и раннее метастазирование по сравнению с плоскоклеточным раком [320]. Это, помимо всего прочего, можно объяснить повышенным уровнем ЭРР, который более интенсивно опосредует пролиферативное действие эстрогенов в ткани аденокарциномы.
Описанные выше результаты провоцируют ряд вопросов, важнейшим из которых является наличие предопределенности экспрессии ЭРР в немелкоклеточном раке легкого различных гистологических типов. Неизвестно, приобретается тот или иной уровень экспрессии ЭРР в ходе малигнизации клеток, либо он является стабильной характеристикой, присущей как нормальным, так и опухолевым тканям легкого конкретного пациента. Анализ показателей экспрессии ЭРР в опухолевой и соответствующей нормальной ткани легкого показал, что малигнизация в этом органе чаще сопровождается повышенным уровня маркера, нежели пониженным. Однако формирование плоскоклеточного гистологического типа опухоли происходит без изменения экспрессии ЭРР в нормальной ткани, в то время как в ходе процессов канцерогенеза, приводящих к аденокарциноме, обнаруживается тенденция к повышению уровня маркера. В исследовании не показана статистически достоверная корреляция между гистологическим типом опухоли и представленностью ЭРР в нормальной ткани легкого, хотя и обнаружена тенденция, согласно которой плоскоклеточный рак чаще развивается из легочной ткани с низким уровнем экспрессии рецепторов, а аденокарцинома - из ткани с высоким уровнем ЭРр.
После того, как в данной работе была обоснована целесообразность проведения антиэстрогеновой терапии для предотвращения рецидива первичного немелкоклеточного рака легкого и его метастазирования, возник вопрос относительно возможности реализации этого подхода для профилактики и лечения метастазов в легких, возникающих вследствие прогрессирования опухолей других локализаций. В литературном обзоре приводятся данные об экспрессии ЭРР в солидных опухолях различных локализаций. Основываясь на том, что присутствие маркера в клетках первичной опухоли отражает вероятность его содержания в метастазах, ожидали обнаружить ЭРР в метастатической ткани легкого пациентов, страдающих раком яичка, почки, колоректальным раком, саркомой кости и некоторыми другими опухолями. В результате анализа экспрессия рецепторов ЭРР была обнаружена в 71% образцов метастазов рака яичка, 88% метастазов рака почки и во всех проанализированных образцах метастазов саркомы кости и колоректального рака. При этом более чем в половине образцов метастатической ткани ЭРР представлены на среднем или высоком уровне, что, несомненно, свидетельствует о целесообразности адъювантного применения антиэстрогенов в комплексной терапии метастазирования при указанных опухолях. Более того, полученные данные предоставляют информацию о наличии мишеней для антиэстрогеновой терапии и в первичных опухолях, особенно у больных раком почки, среди которых в 83% случаев показана экспрессия ЭРР на умеренном или высоком уровне. Очевидно, что в будущем должны быть проведены исследования в этом направлении.
В заключении следует еще раз подчеркнуть, что в рамках данной работы была обоснована стратегия применения антиэстрогенов для лечения немелкоклеточного рака легкого, создан алгоритм её реализации и разработана соответствующая методологическая база. Рассматривая перспективы указанного подхода, считаем, что есть все основания рассчитывать на сходный с раком молочной железы положительный эффект антиэстрогенов при их адъювантном применении у больных с ЭРР-положительным немелкоклеточным раком легкого в качестве самостоятельного средства, а также в ходе и после завершения химиотерапии. Группу претендентов могут составить больные с умеренным и высоким уровнем экспрессии ЭРР в опухолевой ткани. По нашим данным, это - более половины пациентов.