Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы индивидуализации лекарственной терапии пациентов различными солидными опухолями (обзор литературных данных) 11
Глава 2. Характеристика клинического материала и методов исследования 44
Глава 3. Оценка уровня экспрессии молекулярно-генетических маркеров у пациентов различными солидными опухолями 53
Обсуждение результатов 102
Выводы 121
Практические рекомендации 122
Список литературы 123
- Современное состояние проблемы индивидуализации лекарственной терапии пациентов различными солидными опухолями (обзор литературных данных)
- Характеристика клинического материала и методов исследования
- Оценка уровня экспрессии молекулярно-генетических маркеров у пациентов различными солидными опухолями
Введение к работе
Актуальность проблемы. Лекарственное лечение больных солидными опухолями представляет одну из наиболее сложных проблем клинической онкологии. Прежде всего, это связано с отсутствием абсолютных признаков чувствительности и резистентности опухоли к современным противоопухолевым препаратам, назначение большей части которых носит эмпирический характер и основывается на статистической вероятности получения положительного эффекта. Любая неудачная попытка противоопухолевого воздействия сопровождается дальнейшим ростом опухоли, что неминуемо ведет к увеличению риска нарушения функционирования жизненно важных органов (Robert J. et al., 2004; Chabner В. et al., 2005; Robert J. et al., 2005). Кроме того, противоопухолевые препараты обладают весьма низким терапевтическим индексом, их применение почти всегда сопровождается тяжелыми, зачастую угрожающими жизни побочными эффектами. Поэтому сознательный отказ от назначения заведомо неэффективных препаратов может рассматриваться как наилучшее терапевтическое решение (Imyanitov Е. et al., 2007). Важным аспектом противоопухолевого лечения является и то, что большинство современных онкологических препаратов чрезвычайно дороги: расходы на одного пациента могут составлять десятки (сотни) тысяч рублей в месяц. Очевидно, что разработка маркеров химиочувствительности новообразований поможет уменьшить затраты на терапию за счет более обоснованного использования дорогостоящих лекарств (Robert J. et al., 2004; Chabner В. et al., 2005; Robert J. et al., 2005).
При оценке вероятности получения положительного эффекта противоопухолевого лечения клиницисты, как правило, могут полагаться лишь на отдельные фенотипические характеристики, такие как гистологический тип опухоли, степень ее дифференцировки, общее состояние пациента и другие (Jain К. et al., 2005). Предполагается, что идентификация молекулярных маркеров химиочувствительности и химиорезистентности позволит существенно улучшить результаты противоопухолевой терапии. Одним из возможных путей повышения \
эффективности лечения является индивидуализация противоопухолевой терапии на основе молекулярных маркеров.
Все вышеизложенное подтверждает чрезвычайную актуальность проблемы лекарственного лечения больных солидными опухолями и является убедительным основанием для проведения специальных исследований в этой области.
Цель настоящего исследования:
Изучить экспрессию маркеров чувствительности к цитостатикам в опухолях различных локализаций.
Задачи исследования:
-
Оценить частоту экспрессии различных маркеров чувствительности к химиотерапевтическим препаратам (DPD, TS, ТР, ERCC1, р-тубулина, PDGFR-a, PDGFR-p, c-kit, muc-1, NY-ESOl, VEGF, COX2, мутации EGFR, k-ras и амплификация Her-2/neu) в опухолевой ткани больных солидными новообразованиями.
-
Определить возможную зависимость уровня экспрессии маркеров чувствительности к лекарственной терапии от пола, возраста больных и/или гистологического типа опухоли.
-
Изучить распределение частоты экспрессии маркеров у больных солидными опухолями в зависимости от локализации новообразования.
Положения, выносимые на защиту:
1. Все солидные опухоли независимо от первичной локализации
характеризуются крайней гетерогенностью с точки зрения экспрессии
предиктивных и прогностических молекулярно-генетических маркеров.
2. Определение уровня экспрессии в ткани опухоли маркеров чувствительности
или маркеров токсичности к химиотерапии до начала терапии может позволить
индивидуализировать лечение.
Научная новизна работы:
Впервые на значительном клиническом материале проведена оценка частоты экспрессии маркеров чувствительности к лекарственной терапии в опухолях различных локализаций.
Выполнена оценка распределения предиктивных маркеров у больных различными солидными опухолями и определена возможная их связь с полом, возрастом и гистологическим типом.
Научно-практическая значимость:
Предполагается, что выполненная работа может позволить увеличить эффективность лекарственного лечения у больных солидными опухолями, за счет индивидуализации противоопухолевой терапии на основе молекулярных маркеров, а также снизить риск побочных эффектов, сопряженных с назначением химиотерапевтических препаратов.
Разработаны для клинического применения в онкологических учреждениях методики оценки экспрессии генов в минимальных количествах биологического материала у больных различными солидными опухолями.
Внедрение результатов исследования:
Результаты исследования внедрены в практическую работу отделения трансплантации костного мозга и биотерапии, химиотерапевтического и торакального отделения, отделения опухолей желудочно-кишечного тракта и отделения общей онкологии ФГУ «НИИ онкологии» Минздравсоцразвития России совместно с кафедрой онкологии Медицинской академии последипломного образования (МАПО).
Апробация работы:
Материалы диссертации были доложены в 2010 году на объединенной научной конференции отделения биотерапии и трансплантации костного мозга, отделения детской онкологии, общей онкологии и гематологии, химиотерапевтического и торакального отделений ФГУ НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова совместно с кафедрой онкологии и Медицинской академии последипломного образования (МАПО).
Основные результаты работы докладывались на Научном обществе онкологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области (Санкт-Петербург, 2007г.), XII, XIII Всероссийском онкологическом конгрессе (Москва, 2008г., 2010), конгрессе молодых ученых «Экспериментальная и клиническая онкология» (Киев, 2010).
Объем и структура диссертации:
Современное состояние проблемы индивидуализации лекарственной терапии пациентов различными солидными опухолями (обзор литературных данных)
Проблема онкологических заболеваний — глобальная и чрезвычайно важная. По данным ВОЗ, ежегодно в мире выявляют около 10 000 000 новых случаев онкозаболеваний, и не менее 8 000 000 больных умирает от этой патологии (Ferlay J. et al., 2001; Greenlee R. et al., 2001). Число впервые выявленных больных со злокачественными новообразованиями в 2008 году составило 490 000, за последние 10 лет прирост заболеваемости составил около 15%, в то же время показатели смертности стабилизировались (Чиссов В.И., 2009). Основную тревогу вызывает удельный вес впервые выявляемых запущенных форм рака, который достигает 20 - 40% и не имеет существенной тенденции к снижению.
Лекарственное лечение больных диссеминированными опухолями представляет одну из наиболее сложных проблем клинической онкологии. Основная причина - биологическая неоднородность солидных опухолей, которая определяет различную их чувствительность к химиотерапии и иным терапевтическим воздействиям. В последние годы в связи с новейшими достижениями молекулярной онкологии, генетики и иммунологии, которые обеспечили понимание механизмов и этапов канцерогенеза, наблюдается существенный прогресс в лекарственном лечении злокачественных опухолей в целом (Lesko L., 2007). К сожалению, современная противоопухолевая терапия имеет ряд существенных недостатков, одним из которых является эмпирический характер ее назначения. Если вероятность эффекта достигает 70-80% при применении современных комбинаций цитостатиков на начальных этапах терапии относительно химиочувствительных опухолей, то во многих ситуациях, например при лечении колоректального рака (КРР) 5-фторурацилом (5-ФУ), регресс новообразования наблюдается менее чем у 1 из 5 пациентов (Imyanitov Е. et al., 2007). К существенным недостаткам противоопухолевой терапии следует отнести и ограниченную эффективность цитостатиков; диапазон их активности колеблется от 20% до 80%. Противоопухолевые препараты обладают весьма низким терапевтическим индексом, их применение почти всегда сопровождается тяжелыми, зачастую угрожающими жизни побочными эффектами. Сознательный отказ от назначения заведомо неэффективного воздействия во многих ситуациях может рассматриваться как наилучшее терапевтическое решение (Imyanitov Е. et al., 2007). Большинство современных онкологических препаратов чрезвычайно дороги. Ожидается, что разработка маркеров химиочувствительности новообразований поможет уменьшить затраты на терапию за счет более обоснованного использования дорогостоящих лекарств (Robert J: et al., 2004; Chabner В. et al., 2005; Robert J. et al., 2005). На сегодняшний день отсутствуют абсолютные признаки чувствительности и резистентности опухоли к цитостатикам (Jain К. et al., 2005). Назначение противоопухолевой терапии основывается на статистически вероятных категориях получения положительного эффекта и основных фенотипических характеристиках, таких как: локализация первичной опухоли, гистологический тип и степень ее дифференцировки, общее состояние больного, характер распространения опухолевого процесса и т.д. Существенный вклад в генетическую составляющую ответа на лекарственные препараты вносит также межэтническая вариабельность (Burchard Е. et al., 2003). Знание вопросов полиморфизма генов, кодирующих ферменты, принимающих участие в метаболизме лекарственных препаратов, полиморфизма транспортеров лекарственных средств, а также функциональную вариабельность генов, кодирующих мишени (например, рецепторы), на которые воздействует лекарство, может быть полезным при назначении определенного лекарственного средства в адекватной для данного конкретного больного дозе. В фармакогенетике рассматриваются: взаимосвязь генотипа с лекарственным метаболизмом, с извращенной реакцией на препарат, с клинически значимым эффектом лекарственного препарата. Вклад генетического компонента в вариабельность ответа на лекарственный препарат составляет от 20% до 90% (Kalow W. et al., 1998).
На сегодняшний день известно более 100 белков и/или генов, изменения которых обнаружены в злокачественных клетках. Каждая опухоль является уникальной по набору нарушений, вовлеченных в процессы канцерогенеза (Кешта Р., 2002). Знание молекулярно-генетической характеристики пациента может позволить индивидуализировать выбор препарата, его дозу и уменьшить риск появления токсических реакций (Jain К. et al., 2004).
Характеристика клинического материала и методов исследования
Оценка распределения и анализ зависимости экспрессии молекулярно-биологических маркеров от пола, возраста или гистологического типа опухоли был выполнен на основании наблюдений за больными различными солидными опухолями, находившихся на обследовании и лечении в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздравсоцразвития России» в период с октября 2004 по март 2009 гг. В работе использованы данные о 1058 пациентах, получавших стационарное и амбулаторное лечение и наблюдавшихся до марта 2009 года включительно. В процессе исследования проанализированы истории болезни и амбулаторные карты, оценены результаты инструментальных и лабораторных обследований пациентов. В исследование включались пациенты в возрасте 18 лет и старше, диагноз был верифицирован морфологически (гистологически) в результате исследования препаратов, полученных во время операции или трепан - биопсии первичной опухоли и/или метастазов в периферических лимфатических узлах и коже.
В зависимости от локализации опухолевого процесса распределение больных было следующим: немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) - 486 (45,9%), колоректальный рак (КРР) - 262 (24,8%), рак шейки матки (РШМ) - 19 (1,8%), рак молочной железы (РМЖ) - 55 (5,2%), рак почки (РП) - 35 (3,3%), плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) - 15 (1,4%), рак желудка (РЖ) -51 (4,8%), рак яичников (РЯ) - 25 (2,4%), меланома кожи (МК) - 58 (5,5%), саркомами мягких тканей (СМТ) - 52 (4,9%). На данной панели новообразований изучена экспрессия маркеров DPD, TS, ТР, ERCC1, Р тубулина, PDGFR-a, PDGFR-p\ c-kit, muc-1, NY-ESOl, VEGF, COX2, мутации EGFR, k-ras, амплификации Her-2/neu.
Все пациенты соответствовали стандартным критериям включения в исследование, таким как морфологическая (гистологическая) верификация диагноза, возраст 18 лет и старше, ожидаемая продолжительность жизни не менее 12 недель.
Оценку экспрессии молекулярно-генетических маркеров чувствительности к цитостатикам в опухолях проводилась методом RT-PCR на срезах парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования.
С 2006 года по 2009 год проведено изучение особенностей экспрессии маркеров химиочувствительности у пациентов различными солидными опухолями. Основная цель исследования: изучить экспрессию маркеров чувствительности к химиотерапии в опухолях различной локализации. В задачи исследования входило определение в опухолевой ткани больных солидными опухолями экспрессии различных маркеров чувствительности к химиотерапии (DPD, ТР, TS, ERCC-1, СОХ2, muc-1, c-kit, Р-тубулин, VEGF, NY-ESO-1), выявление мутаций в гене EGFR (микроделеция в 19 экзоне, EGFR L 858R), k-ras. Отдельные характеристики больных, вошедших в данную работу представлены в таблице 2.
Как видно из представленной таблицы, в исследование включены больные в возрасте от 18 до 86 лет, медиана возраста составила 55,6 лет. Пациентов женского пола было несколько больше (52,9%) по сравнению с пациентами мужского пола (47,1%). Из всех пациентов большую часть составили больные НМРЛ (45,9%); больные КРР составили 24,8%, МК 5,2%, РМЖ 5,2%, СМТ 4,9%, РЖ 4,8%, РП 3,3%, РЯ 2,4%, РШМ 1,8%, ПРГШ 1,4%.
Экспрессия изучаемых молекулярно-биологических маркеров при различных новообразованиях может быть определена с помощью белковых и генных методов. Кроме этого, у части использовалось непосредственное исследование функциональной активности ферментов в опухолевых тканях -метод связывания молекул FdUMP злокачественными клетками.
Изучение концентрации маркеров чувствительности к лекарственной терапии в опухолевой ткани проводится с помощью обратной полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени. Именно данный метод, направленный на выявление уровня транскрипции, позволяет количественно определять экспрессию мРНК в цитозоле злокачественных клеток. Использование ПЦР в реальном времени обеспечивает наиболее точную оценку концентрации мРНК изучаемых ферментов в небольшом объеме ткани, полученной, например, при пункции или биопсии. Основным требованием к исследуемому материалу является наличие в образце более 80% опухолевых клеток. Учитывая это условие, использование определенного метода обработки срезов с парафиновых блоков путем микродиссекции с последующим проведением количественной ПЦР позволяет определять уровень экспрессии генов метаболизма с высокой точностью. Именно данный анализ внутриопухолевой экспрессии молекулярно-биологических маркеров стал основой нашей работы как наиболее точный, воспроизводимый в условиях большинства лабораторий современных клиник и доступный по своей стоимости.
Выделение РНК из архивных патоморфологических образцов Выделение РНК из архивных патоморфологических блоков производилось по модифицированному методу К. Specht et al. (2001). Гистологические срезы с целью получения участка опухоли и во избежание контаминации нормальной ткани подвергались микродиссекции. Полученные таким способом срезы толщиной 10-15 мкм депарафинизировались с помощью двухкратной обработки ксилолом при комнатной температуре. Затем фрагменты ткани регидратировались с помощью последовательной промывки в 96%, затем в 85% и 75% растворах этанола - по 10 минут в каждом. После тщательного удаления этанола в пробирку добавляли 180 мкл лизирующего буфера: ІхТЕ (Юммоль Tris-HCl (рН=8,0), ОД ммоль ЭДТА; рН=8,0), 2% натрия додецилсульфат и 20 мкл протеиназы К (20 мг/мл). Пробирки подвергались инкубированию при t=60C в течение 16 часов до полного растворения ткани.
К полученным таким образом лизатам добавляли однократный объем кислого сатурированного фенола и 0,3 объема хлороформа. После интенсивного встряхивания пробирки в течение 10 минут при комнатной температуре пробы подвергались центрифугированию при 15000 g в течение 15 минут при температуре ротора 0-2С (Centrifuge 5415 R, Eppendorf).
После центрифугирования осторожно отбирали суперфазу в новые эппендорфы и добавляли 0,3 объема хлороформа с последующим интенсивным перемешиванием и центрифугированием аналогично описанному выше.
К осторожно отобранной верхней фазе прибавляли 0,1 объема ЗМ ацетата натрия (рН=4,0), 1 мкл раствора гликогена (20мг/мл) в качестве коосадителя и 1 объем охлажденного до -20 С изопропанола. После перемешивания растворов пробы оставлялись не менее чем на 3 часа при-20С. Преципитат РНК осаждали центрифугированием пробы при 15000 g в течение 30 минут при температуре ротора 0-2С. После центрифугирования на дне пробирок образуется небольшое количество белого осадка. После удаления изопропанола промывали осадок в 500 мкл 70% этанола в течение 10 минут при комнатной температуре, слегка встряхивая пробирку. Тщательно удаляли этанол. После подсушивания в термостате при 40 С осадок растворяли в 25 мкл стерильной воды при 65 С в течение 10 минут. Раствор РНК хранили при - 20 С до использования в реакции обратной транскрипции, но не более 2-х суток.
Оценка уровня экспрессии молекулярно-генетических маркеров у пациентов различными солидными опухолями
Мы провели оценку уровней экспрессии DPD у пациентов различными с солидными опухолями. Полученные данные представлены в таблице 3.
Различия выявлены между уровнями экспрессии DPD у больных НМРЛ и пациентами КРР (р=0,001), РМЖ (р=0,005). Высокий уровень фермента встречался чаще у пациентов НМРЛ, по сравнению группой КРР и РМЖ (47,9% и 17,4%; 22,2% соответственно). Высокая экспрессия маркера достоверно чаще преобладала у больных РШМ, ПРГШ и РЖ по сравнению с пациентами с КРР (52,6%, 50,0%, 40,5% и 17,4% соответственно; р=0,001, р=0,004 и р=0,004).
Низкий уровень данного маркера у больных КРР, для которого применение фторпиримидинов входит в стандарты лечения, встречался в 70,6% случаев. В тоже время, отмечено преобладание низкого уровня данного фермента и у пациентов с РП (64,5%), РЯ (66,7%), МК (70,8%) и НМРЛ (52,1%) в лекарственном лечении которых препараты фторпиримидинового ряда не используются. Нами проведен анализ зависимости экспрессии DPD от пола и возраста пациентов.
Корреляции между уровнем экспрессии DPD и полом, возрастом пациентов в целом не выявлено (г=0,03, р=0,041; г=0,064, р=0,043).
Однако при детальном рассмотрении зависимости уровня DPD от пола пациентов, отмечены статистически значимые различия между уровнем данного маркера и полом пациентов НМРЛ (р=0,004). У мужчин чаще (60,7%), чем у женщин (32,4%) встречается низкий уровень экспрессии этого фермента, в то время как высокий уровень чаще отмечался у женщин (67,6%), чем у мужчин (39,3%). Среди пациентов с ПРГШ у женщин в несколько раз чаще, чем у мужчин, встречался высокий уровень экспрессии фермента DPD (85,7% против 14,3%; р=0,027), а низкий уровень преобладал у мужчин, по сравнению с женщинами (71,4% и 14,3%).
Выявлена слабая корреляция между уровнем экспрессии DPD и полом у пациентов НМРЛ (г=0,3; р=0,004) и ПРГШ (г=0,7; р=0,009). В обоих случаях преобладал высокий уровень маркера среди женщин (67,6% и 85,7% соответственно). Полученные результаты представлены на рисунке 1.
Также в исследовании выполнен анализ зависимости уровней экспрессии фермента DPD от морфологического типа опухоли среди больных НМРЛ. Данные представлены в таблице 5.
Выявлена слабая обратная корреляционная связь между аденокарциномой и плоскоклеточным раком у пациентов с НМРЛ и уровнем экспрессии DPD в опухолевой ткани. Среди пациентов с плоскоклеточным раком легкого чаще встречался низкий уровень экспрессии DPD (65,5%), в то время как у больных аденокарциномой легкого преобладал высокий уровень фермента (54,5%).
Таким образом, в опухолевой ткани больных КРР, РМЖ отмечено преобладание низкого уровня экспрессии DPD, что подтверждает эффективное применение препаратов фторпиримидинового ряда у данной категории больных. В тоже время высокая частота низкого уровня этого маркера у больных НМРЛ, МК, СМТ, РП позволяет обсуждать применение фторпиримидинов в лечении этих пациентов. Преобладание низкого уровня экспрессии среди мужчин НМРЛ и ПРГШ по сравнению с женщинами, позволяет предположить более высокую эффективность терапии фторпиримидинами среди мужчин.
Тимидинфосфорилаза (ТР) - ключевой фермент метаболизма капецитабина. Активность ТР в различных солидных опухолях превышает таковую в здоровых органах в 3-10 раз и тесно коррелирует с выраженностью ангиогенеза и агрессивностью злокачественного роста. Особенно высокая его концентрация в таких злокачественных новообразованиях, как РМЖ, РЖ, КРР, РШМ, РЯ, а также в метастазах рака этих локализаций. Определение концентрации ТР в опухолевых клетках служит индикатором чувствительности к капецитабину. Таким образом, высокая внутриопухолевая активность ТР с одной стороны, свидетельствует об агрессивности течения онкологического заболевания, а с другой - избирательности действия пероральных форм фторпиримидинов (Adlard J. et al., 2002; Longley D. et al., 2003; Toi M. et al., 2005).
Такие опухоли, как КРР, МК, СМТ характеризуются преобладанием низкого уровня экспрессии ТР в опухолях.
При определении экспрессии ТР в различных солидных опухолях в нашем исследовании было выявлено, что высокий уровень чаще встречался среди больных НМРЛ (41,0%), РШМ (42,1%), РЖ (43,9%), ПРГШ (50,0%) по сравнению с пациентами, страдающими раком толстой кишки (26,0%) или СМТ (26,3%). И наоборот, низкий уровень экспрессии ТР преобладал у больных КРР (60,2%), МК (62,5%) и СМТ (68,4%). Полученные результаты представлены в таблице 6.
![Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия опухолей органа зрения с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда [Электронный ресурс]](/i/i/4602/185091.png "Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия опухолей органа зрения с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда [Электронный ресурс] Крупнов Роман Николаевич")
