Введение к работе
1.Актуальность проблемы. HTLV-I является первым экзогенным ретровирусом человека, этиологически ассоциированным с Т-клеточным лейкозом взрослых (ATL). Имеются убедительные аргументы и в пользу причинной связи этой инфекции с хроническими нервными заболеваниями человека, такими как тропический спастический парапарез (TSP) или атрофическая миэлопатия (НАМ). HTLV-I также ассоциирован с такими патологическими состояниями человека как, увеиты, мелкоклеточный рак легкого, различные формы полиэндокринопатий (Базедова болезнь, инсулинзависимый диабет) и т.д. Выявлены эндемичные регионы, где повышенная заболеваемость указанными болезнями сочетается с высокой инфицированностью KTLV-I. Лица, инфицированные HTLV-I встречаются и спорадически.
Исследованиями нашей лаборатории (лаб. вирусного канцерогенеза, ОНЦ АМН РФ) показано, что вирусоносительство HTLV-I встречается в г.Москве, в Дальневосточном регионе России, в государствах Казахстан, Грузия и в большинстве Среднеазиатских государств. Эти исследования также позволили выявить две инфицированные HTLV-I семьи, у одного из членов которой был диагносцировал HTLV-1-ассоци-ированный случай AIL - первый зарегистрированный случай этого заболевания на территории бывшего СССР. Принимая во внимание пути распространения HTLV-I (половой, с молоком матери, при гемотрансфузи-ях), можно предположить, что наличие таких своеобразных резервуаров вируса угрожает медленным, но неуклонным ростом числа инфицированных людей в регионах, где инфекция HTLV-I является еще спорадической.
Накопленные в настоящее время данные об HTLV-I инфекции с несомненностью указьшают на необходимость широкого скринирования на антитела к HTLV-I доноров крови и представителей так называемых "групп риска". Такое скринирование позволяет осуществлять контроль за. инфицированными лицами и остановить дальнейшее распространение инфекции. Существующие, однако, за рубежом коммерческие скринирую-щие и верифицирующие тесты, приготовленные на основе культуральных вирусных частиц, по данным зарубежных авторов и результатам наших собственных исследований, не обладают достаточной специфичностью и чувствительностью. Поэтому представляются логичным направления исследований с целью экспрессировать диагностически значимые белки HTLV-I в бактериальных и других системах для последующей разработки
скрияирующих тестов на Сазе рекомбинантных белков.
2. Цели и задачи исследования. Поскольку по существующим реко
мендациям ВОЗ, определяющем для диагностики HTLV-I инфегсцииявляет-
ся одновременное 'Янаружение антител к продуктам генов gag (р53,
р24 иди р19) и env (gp62, gp46 и gp21). Целью данной работы явля
лось получение рекомбинантных белков, указаньых выше генов HTLV-I,
иэученио их свойств (стабильность, иммуногенность и т.д.), а также
их анализ в плане потенциального использования для диагностических
целей.
В связи с этим в задачи исследования входило:
-
Молекулярное клонирование отдельных фрагментов генов env и gag HTLV-I в различных типах векторных систем и отбор оптимальной векторной системы.
-
Экспрессия, выделение и анализ различных свойств рекомбинантных белков. '
-
Оценка серологической реактивности полученных рекомбинантных белков с помощью различных образцов позитивных, неопределенных и др. сывороток.
3. Научная новизна. Получена коллекция плазмидных клонов, спо
собных экспрессировать в E.coll гибридные, белки гена env и gag
HTLV-I. .Проанализированы несколько вариантов векторов с различными
типами промоторов и способов индукции белков (дискретный или слит
ный), которые не использовались ранее для экспрессии белков HTLV-I.
Выявлена наиболее чувствительная к лротеовизу часть карбокситерми-
нальной области gp46env HTLV-I, локализующаяся между сайтами
Taq-TaqI и содержатся только 05 аминокислотных оснований. Установ
лено, что бактериальная La-лротеаэа не является ответственной за
процесс лротеолиза HTLV-I гибридных белков AC'-gpi6env " и
АС-р24р15вЫГ в E.coli.
4. Научно-практическая значимость работа. Экспрессированные белки некоторых из полученных клонов после иммувоафинной очистки, могут быть использованы в качестве специфических антигенов при создании тест-систем по выявлении HTLV-I инфекции, а в настоящее время широко используются для скринирования сывороток крови поступающих в лабораторию для выявление специфических антител на HTLV-I.
Использование рекомбинантных белков позволяет проводить оценку серопозитивности, следуя принятым международным критериям и существенно повышает достоверность выявления HTLV-I специфических анти-
тел. Использование некоторых рекомОинантных белков позволяет проводить дифференциальную диагностику между I1TLV-I и HTLV-II инфекцией.
Полученная коллекция клонов, способных экспрессировать реком-бинанткне белки генов gag и env HTLV-I, может быть использована ив только в диагностических целях, но и для получения в будущем полик-лональных и мсноклональных антител, а также в кажестве мслекуляр-но-биологических зондов. Плазмвдные клокы, содержащие различные фрагменты генов env и gag HTLV-I, могут служить также основой для переклонирования в другие векторные системы и их модификаций.
6.Апробация работы. Апробация диссертационной работы была проведена 27 марта 1995 г., на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, иммунологии онксгенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ОНЦ АМН РФ.
Основные положения диссертации докладывались на совете^-французском симпозиуме по вирусологии опухолей (Латвия, Рига. 1990 г.), на П-ой международной конференции "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" (Россия, Санкт-Петербург, 1093 г.), на іх-ой международной конференции по СПИДу (Германия, Берлин, 1993 г.), на Х-ой международной конференции по СПИДу (Япония, Йокохама, 1994 г.). на Ш-ей международной конференции "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" (Россия, Санкт-Петербург, 1995 г.)
6.Публикации. По материалам выполненных исследований опубликовано 23 работы.
7. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (включающего 4 главы), описания' использованных материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа содержит 38 рисунков, 3 таблицы, занимает ,1/? страниц машинописного текста. Библиография включает 2 источников отечественной и 9S иностранной литературы.
![Клинико-морфологическое обоснование эффективности использования ксенодерматотрансплантатов и сероводородных источников с целью предупреждения дерматогенных осложнений у ожоговых больных [Электронный ресурс]](/i/i/4334/203783.png "Клинико-морфологическое обоснование эффективности использования ксенодерматотрансплантатов и сероводородных источников с целью предупреждения дерматогенных осложнений у ожоговых больных [Электронный ресурс] Мартынюк Василий Иванович")
