Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления об иммунной и неироэндокриннои системах в процессе старения 17
1.1. Возрастная инволюция основных органов, участвующих в процессах взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем 19
1.1.1. Тимус 19
1.1.2. Пинеальная железа (эпифиз) 23
1.1.3. Центральная нервная система 27
1.1.4. Половая система 35
1.1.4.1. Женские половые железы (яичники) 35
1.1.4.2. Мужские половые железы (яички) 38
1.1.5. Сосудистая система 44
1.2. Молекулярные основы старения регуляторных систем 49
1.2.1. Нервная система 49
1.2.2. Эндокринная система 53
1.2.3. Иммунная система 59
І.З.Мелатонини старение 62
1.3.1. Общие представления 62
1.3.2. Ритмы продукции и секреции мелатонина 64
1.3.3. Секреция мелатонина в различных условиях обитания человека 66
1.3.4. Биологические эффекты мелатонина 68
1.3.5. Экстрапинеальная продукция мелатонина 71
1.3.6. Возрастные особенности продукции мелатонина 83
Глава 2. Материал и методы исследования 86
2.1. Дизайн исследований и изучаемый материал 86
2.1.1. Методика изучения пинеальной железы и экстрапинеальных источников мелатонина при старении 86
2.1.2. Методика изучения мелатонин-продуцирующих клеток желудка и двенадцатиперстной кишки в моделях преждевременного старения 88
2.1.3. Методика изучения экстрапинеального накопления мелатонина при различных заболеваниях в пожилом и старческом возрасте 91
2.1.4. Методика изучения накопления мелатонина в неэндокринных злокачественных опухолях у пациентов пожилого и старческого возраста.. 93 2.2. Методы исследования 93
2.2.1. Гистологические и гистохимические методы 93
2.2.2. Иммуногистохимические методы 93
2.2.3. Электронная микроскопия 97
2.2.4. Морфометрия и компьютерный анализ микроскопических изображений 98
2.2.5. Радиоавтография 99
2.2.6. Статистическая обработка результатов 100
Глава 3. Функциональная морфология пинеальной железы и кстрапинеальные источники мелатонина при старении человека 101
3.1. Функциональная морфология пинеальной железы человека при старении 101
3.2. Экстрапинеальные источники мелатонина при старении человека 106
3.2.1. Мелатонин-иммунореактивные клетки желудка и кишечника 106
3.2.2. Накопление мелатонина в нейроэндокринных клетках бронхиального эпителия ПО
3.2.3. Мелатонин-иммунопозитивные клетки поджелудочной железы 113
3.2.4. Нейроэндокринные клетки надпочечников 114
3.2.5. Мелатонин-иммунореактивные клетки предстательной железы 115
3.2.6. Мелатонин-иммунопозитивные клетки плаценты 118
3.2.7. Мелатонин в естественных киллерах (NK-клетках) 120
3.2.8. Мелатонин в эндотелиальных клетках 123
3.2.9. Радиоавтография кинетики экзогенного мелатонина и антител к
нему в организме старых мышей и крыс 126
Глава 4. Мелатонин-содержащие гастроинтестинальные клетки в моделях преждевременного старения 130
4.1. Радиационная модель старения 130
4.2. Пинеалэктомия как модель старения 133
4.3. Нокаутная долгоживущая линия мышей 135
Глава 5. Мелатонин-содержащие клетки у людей при различных заболеваниях пожилого и старческого возраста 138
5.1. Мелатонин-содержащие клетки при патологии желудочно-кишечного тракта у людей в пожилом и старческом возрасте 138
5.1.1. Гастрит и язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки... 138
5.1.2. Хронические колиты и рак толстой кишки 144
5.2. Мелатонин-содержащие клетки в предстательной железе при опухолях, ассоциированных с возрастными изменениями функций простаты 153
5.2.1. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы 153
5.2.2. Рак предстательной железы 158
5.3. Болезнь Паркинсона 164
Глава 6. Накопление мелатонина в неэндокринных злокачественных опухолях у пациентов пожилого и старческого возраста 166
6.1. Опухоли гортани 166
6.2. Опухоли легких 168
6.3. Опухоли желудка * 171
6.4. Опухоли толстой и прямой кишки 173
6.5. Ультраструктурная верификация гормональной функции неэндокринных опухолей 176
Глава 7. Участие мелатонина в процессах старения и патогенезе заболеваний, ассоциированных с возрастом 181
7.1. Экстрапинеальный мелатонин: место и роль в регуляции гомеостаза
при старении 181
7.2. Биологическая роль экстрапинеального мелатонина в процессе онтогенеза и старения 186
7.3. Возможное участие мелатонина в патогенезе заболеваний, ассоциированных с возрастом 189
7.3.1. Мелатонин, старение и опухоли предстательной железы 189
7.3.2. Секреция мелатонина в клетках АПУД-системы неэндокринных опухолей у пожилых и старых людей 193
7.3.3. Мелатонин и нейродегенеративные процессы 199
7.3.4. Мелатонин и патология желудочно-кишечного тракта в пожилом и
старческом возрасте 202
Выводы 205
Практические рекомендации 208
Список литературы 209
- Возрастная инволюция основных органов, участвующих в процессах взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем
- Молекулярные основы старения регуляторных систем
- Методика изучения пинеальной железы и экстрапинеальных источников мелатонина при старении
- Функциональная морфология пинеальной железы человека при старении
Введение к работе
Установлено, что старение сопровождается выраженной инволюцией пинеальной железы (эпифиза) [Reiter R.J. 1999, 2003]. При этом выявлено, что морфологические изменения, развивающиеся в эпифизе в процессе возрастной инволюции, неразрывно связаны с резким падением уровня продукции мелатонина (МТ) - основного гормона пинеальной железы, координирующего биологические ритмы организма на всех уровнях его организации [Анисимов В.Н., Рейтер Р., 1990; Charman W.N., 2003].
МТ является гормоном широкого спектра действия — он участвует в регуляции иммунной и эндокринной систем, обладает пролиферотропным действием, модулирует дифференцировку и апоптоз клеток, участвует в регуляции зрительной функции, снижает уровень холестерина, повышает сопротивляемость организма стрессам и высоким физическим нагрузкам, способствует нормализации кровяного давления и подавляет действие свободных радикалов [Арутюнян А.В. и др., 2003; Reiter RJ. et al., 1998, 2002]. Эти свойства позволяют рассматривать МТ как перспективный для детального изучения эндогенный гормональный фактор, обладающий геропротекторными свойствами.
Снижение уровня МТ в процессе старения демонстрирует существенное изменение уровня ночной экскреции МТ с мочой, как у старых лабораторных животных, так и у пожилых людей [Arendt J., 1995; Bartsch С. et al., 2001].
При пинеалэктомии (общепринятая модель преждевременного старения) наблюдается иммуносупрессия, сходная с таковой при естественном старении, которая снимается введением экзогенного МТ [Maestroni G., Konti А., 2002]. Определенное значение для увеличения вероятности аутоиммунных расстройств при старении имеет снижение продукции МТ, обладающего антиканцерогенными и антиоксидантными свойствами, а также способного
ограничивать возрастной гиперкортицизм, защищая клетки иммунной и нервной системы от окислительного стресса.
Более половины всех мужчин старше 50 лет страдают опухолевыми заболеваниями простаты, что нарушает половую функцию и мочеиспускание. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что МТ предупреждает развитие доброкачественной гиперплазии предстательной железы и задерживает атрофию половых органов, что обычно происходит при старении мужского организма. Учитывая широкий спектр биологической активности МТ и особенно его свойств ключевого регулятора биологических ритмов и мощного природного антиоксиданта, МТ можно рассматривать как важнейший фактор регуляции жизненно важных функций организма. Поэтому уровень продукции МТ в организме имеет принципиальное значение для обеспечения его жизнедеятельности в различные возрастные периоды.
В настоящее время твердо установлено, что пинеальная железа не является исключительным органом, способным продуцировать МТ [Raikhlin N.T. et al., 1975; Raikhlin N.T., Kvetnoy I.M., 1978; Bubenik G. et al., 1985; Kvetnoy I.M., 1999; 2002]. Многочисленными исследованиями показано, что экстрапинеальный МТ широко распространен в организме человека и животных. Клетки, продуцирующие МТ, обнаружены в желудочно-кишечном тракте, дыхательных путях, поджелудочной железе, надпочечниках, щитовидной железе, тимусе, мозжечке, мочеполовой системе, плаценте и других органах. Более того, показана активная продукция МТ в неэндокринных клетках - тучных клетках, естественных киллерах, эозинофильных лейкоцитах, тромбоцитах, эндотелиоцитах [Кветной И.М., Райхлин Н.Т., 1996, 1998; Kvetnoy I.M., 1999; Кветной И.М. и др., 2002]. Такое широкое распространение МТ в организме отражает его ключевую роль как межклеточного нейроэндокринного регулятора и координатора многих сложных и взаимосвязанных биологических процессов.
При возрастной инволюции пинеальной железы происходит снижение концентрации МТ в организме, что, в свою очередь, влечет изменение каскада многих метаболических процессов и негативно отражается на функции многих органов и систем. Однако, при этом сведения о возрастных структурно-функциональных изменениях экстрапинеальных источников МТ и особенностях секреции экстрапинеального МТ при старении отсутствуют, что ограничивает понимание роли и значения МТ и свидетельствует о необходимости исследований в этом направлении.
Фундаментальные исследования, предпринятые с этой целью на молекулярном и клеточном уровне, будут способствовать познанию процессов старения и разработке эффективных методов диагностики, лечения и профилактики патологии, ассоциированной с возрастом.
Цель и задачи работы.
Целью диссертационного исследования является установление роли и значения экстрапинеального мелатонина в процессах старения организма.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
исследовать функционально-морфологические изменения пинеальной железы при старении у человека;
выявить структурно-функциональную организацию экстрапинеальных источников мелатонина при старении у человека и экспериментальных животных;
описать степень и.-характер изменений мелатонин-содержащих энтерохромаффинных клеток желудка в биоптатах слизистой оболочки желудка у людей пожилого и старческого возраста с различной патологией (заболевания желудка и кишечника, болезнь Паркинсона);
выявить связь характера изменений содержания мелатонина в клетках предстательной железы с развитием опухолей, ассоциированных с
возрастом (доброкачественная гиперплазия предстательной железы и рак простаты);
изучить возможность локальной продукции мелатонина в неэндокринных опухолях у пожилых и старых людей и оценить значение этого феномена в процессах опухолевой прогрессии;
проанализировать нейроэндокринные аспекты участия мелатонина в процессах старения и патогенезе заболеваний, ассоциированных с возрастом.
Научная новизна работы и теоретическая значимость работы
Проведенные исследования позволили установить, что при естественном старении у человека, так же как в различных моделях преждевременного и ускоренного старения (пннеалэктомия и облучение сублетальными дозами), у животных наблюдаются изменения структурно-функциональной организации пинеальной железы и экстрапинеальных МТ-содержащих клеток.
Впервые установлено, что в то время как уровень секреции пинеального МТ прогрессивно снижается с возрастом, экстрапинеальная экспрессия МТ в различных органах стабильно сохраняется до 60 лет и только у более старых людей достоверно снижается. При этом наиболее устойчива в структурно-функциональном отношении популяция МТ-содержащих клеток бронхиального эпителия и надпочечников. Показано достоверное снижение накопления МТ в иммунокомпетентных клетках, сопровождающееся нарушением их структурно-функциональной организации.
Проведенные исследования показали неодинаковую реакцию гастро-интестинальных МТ-содержащих клеток в различных моделях старения, что свидетельствует о возможности активного участия экстрапинеального МТ в возрастной инволюции органов и тканей и компенсации нарушенных физиологических процессов при разных способах инициации старения.
Впервые получены данные о динамике распределения меченого МТ и антител к нему в организме молодых и старых животных. Установлены
ключевые органы-мишени МТ и время поглощения МТ их паренхимой.
Детально описано морфофункциональное изменение экстрапинеальных источников МТ при заболеваниях, ассоциированных с возрастом, и опухолях различной локализации у пожилых и старых людей.
Теоретическая значимость исследования состоит в том, что оно существенно расширяет современные представления о нейроиммуноэндо-кринологии и геронтологии для понимания изменения структуры и функции пинеальной железы и значимости экстрапинеальных МТ-содержащих клеток при старении.
Практическая ценность работы.
Впервые установлены диагностически и прогностически значимые изменения функциональной активности экстрапинеальных МТ-содержащих клеток при различной патологии у пациентов пожилого и старческого возраста (заболевания желудочно-кишечного тракта, нейродегенеративные процессы, опухолевый рост), позволяющие проводить оценку прогноза и выбор терапии, оптимизирующей нарушенные нейроиммуноэндокринные взаимодействия, усугубляющие течение патологического процесса при старении.
Установлено, что локальное нарушение синтеза МТ нейроэндокрннными клетками простаты является важным патогенетическим фактором развития возрастных гиперпластических процессов в предстательной железе.
В злокачественных эпителиальных (раковых) опухолях гортани, легких, желудка и толстой кишки обнаружена эктопическая секреция МТ в клетках, локализованных в ткани опухоли. Установлено, что по мере прогрессии опухолей содержание МТ в опухолях снижается, достигая минимальных значений при распространенных метастазах, что может явиться информативным прогностическим маркером опухолевого процесса.
Выявление ключевых органов-мишеней МТ и определение времени его поглощения органами и выведения из организма может явиться предпосылкой для разработки геропротекторных лекарственных препаратов на основе МТ.
Положения, выносимые на защиту:
Экстрапинеальная популяция мелатонин-содержащих клеток сохраняет относительную структурно-функциональную стабильность в пожилом возрасте, что обусловливает возможность участия мелатонина в осуществлении регуляции физиологических процессов в стареющем организме, несмотря на выраженную инволюцию пинеальной железы.
Мелатонин-содержащие клетки являются важным звеном в нейро-иммуноэндокринных процессах старения организма.
Локальное нарушение продукции мелатонина нейроэндокринными клетками простаты является важным патогенетическим фактором развития возрастных гиперпластических процессов в предстательной железе.
Количество мелатонин-содержащих клеток в неэндокринных злокачественных опухолях коррелирует со степенью прогрессии опухолей и помогает прогнозировать развитие заболевания у пожилых и старых людей.
Структурно-функциональные изменения экстрапинеальных мелатонин-содержащих клеток являются важным компонентом в патогенезе соматических заболеваний, ассоциированных с возрастом.
Связь с научно-исследовательской работой института.
Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по
основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Апробация диссертации.
Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и
обсуждены на VI Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2002» (Санкт-Петербург, 2002), XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2003), XIII Европейском конгрессе по микроскопии (Антверпен, Бельгия, 2004), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), VI Международной конференции по нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005), II Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых больных и инвалидов» (Москва, 2005), IV Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 2005), II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Санкт-Петербург, 2006), II Международном экологическом симпозиуме (Полоцк, 2006), VII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2006), Конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии (Санкт-Петербург, 2006), II Научно-практической конференции с международным участием по геронтологии и гериатрии, посвященной памяти Э.С. Пушковой (Санкт-Петербург, 2006).
Реализация результатов исследования.
Результаты исследований изложены в двух главах «Руководства по нейроиммуноэндокринолопш» (М.:-Медицина, 2006), которое рекомендовано Департаментом образования Минздравсоцразвития РФ в качестве учебника для студентов медицинских вузов. Они также используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербургского государственного университета, Института физиологии им. И.П. Павлова РАН,
Медицинского радиологического научного центра РАМН, Института иммунологии ФМБА РФ, Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 37 научных работ, в том числе 11 статей, из них 8 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, монографий - 5, глав в руководстве - 2, тезисов докладов - 19.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 244 страницах, содержит 13 таблиц и иллюстрирован 57 рисунками. Список литературы содержит 367 источников, из которых на русском языке - 95, на иностранных языках - 272.
Возрастная инволюция основных органов, участвующих в процессах взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем
Возрастная инволюция тимуса характеризуется наиболее выраженными (по сравнению с другими органами) изменениями. Процесс инволюции начинается очень рано - в течение первого года жизни, а по некоторым данным, возможно, еще до рождения. Относительная масса тимуса к моменту рождения достигает максимальной величины. После рождения она постепенно уменьшается за счет опережающего роста общей массы тела. При этом абсолютная масса тимуса растет, достигая максимума ко времени полового созревания. С этого момента масса тимуса уменьшается экспоненциально в большей степени за счет коркового слоя и в меньшей - мозгового, с замещением их соединительной и жировой тканью [Ярилин А.А., 1997; Ashwell J.D. et ah, 2000].
Имеются данные о том, что замещение паренхимы тимуса жировой тканью представляет собой непрерывный процесс, достигающий максимума у людей в возрасте 50 лет. Более того, количество нежировой ткани в тимусе может не снижаться далее после достижения 30-летнего возраста. При этом атрофируются тельца Гассаля, нарушается правильное расположение эпителиальных клеток, уменьшается общее число лимфоцитов, накапливаются макрофаги, содержащие различные включения и обломки клеток, плазматические и тучные клетки [Sternber Е.М., 2000; Lunenfeld В., 2006].
Скорость уменьшения клеточного микроокружения тимуса у человека составляет 3-5% в год до достижения среднего возраста, а затем снижается до менее чем 1% ежегодно. При изучении ультраструктуры микроокружения тимуса у старых мышей описаны клеточные повреждения, которые со временем оказывали все большее влияние на строму тимуса. На поздних стадиях (то есть у мышей в возрасте около 18-20 месяцев) наблюдалось исчезновение органной архитектуры и резкое снижение количества лимфоцитов [Dopardenne М., 1999; Фрейдлин И.С., Тотолян А.А., 2001].
Отмечалась гипоплазия клеток микроокружения с лизисом клеточных _ мембран. Многочисленные липидные включения, окружающие отдельные эпителиальные клетки, группируются в округлые образования и/или граничат с полостями, которые также присутствуют в тимусах старых мышей. Поскольку тимическое микроокружение играет важную роль в «обучении» и функциональном использовании Т-клеток, можно предположить, что повреждения мембран, нарушение целостности клеточного микроокружения и дисфункция Т-клеток коррелируют между собой.
С возрастом изменяется ультраструктура эпителиальных клеток и лимфоцитов. Снижается уровень тимусных гормонов, циркулирующих в крови и оказывающих выраженное влияние на развитие и функционирование Т- и, в некоторой степени, В-лимфоцитов, а также на различные виды иммунологических реакций.
С 20-летнего возраста в сыворотке крови человека начинается постепенное снижение концентрации тимического сывороточного фактора, завершающееся полным его исчезновением к 50-60 годам. В отличие от этого, уровень тимозина-а 1 и тимопоэтина снижается значительно раньше — с 10-летнего возраста [Быков В.Л., 2000].
Необходимо отметить, что функциональная инволюция тимуса начинается еще раньше, чем регистрируемая морфологически. При этом утрата разных функций происходит в различной последовательности и не в одинаковой степени. На основе многочисленных экспериментально полученных данных можно представить последовательность снижения/потери различных функций тимуса: - снижение влияния на репопуляцию Т-зависимых участков лимфоузлов; - снижение влияния на выработку реагирующих на РНА (белок, ограничивающий апоптоз) и конканавалин А Т-клеток селезенки; - ослабление регуляции хелперной активности Т-клеток селезенки; - снижение влияния на реактивность клеток селезенки к аллогенным лимфоцитам.
Изменения иммунной системы, связанные с инволюцией тимуса, оказывают влияние на общий гомеостаз организма. Наступающее с возрастом истощение иммунной системы способствует повышению заболеваемости злокачественными новообразованиями, снижению резистентности к инфекциям и более частому возникновению аутоиммунных нарушений. При этом регистрируется уменьшение количества Т-лимфоцитов, нарушается дифференциация В-лимфоцитов в плазматические клетки, продуцирующие антитела; Предполагается, что нарушение регуляторной функции Т-клеток играет критическую роль в этих процессах [Пащенков М.В., Пинегин Б.В., 2001; Пальцев М.А. с соавт., 2003].
Снижению функции Т-клеток способствуют следующие факторы: - дефекты стволовых клеток; - инволюция тимуса; - дефекты в клетках, вырабатывающих антигены; - старение покоящихся иммунных клеток; - нарушение путей активации иммунных клеток; - решшкативное истощение клонально размножающихся клеток. Несмотря на то, что клеточный и гуморальный иммунные ответы с
возрастом претерпевают изменения, снижение иммунореактивности, наблюдаемые у пожилых людей, в основном связано с изменениями в ответе Т-клеток. Потеря эффективной иммунной активности в значительной мере обусловлена изменениями в компартменте Т-клеток, которые происходят отчасти как результат инволюции тимуса [Khavinson V.Kh., 2002].
С возрастом отмечается развитие существенных изменений как в функциональном, так и в фенотипическом профилях Т-клеток. Фактически, двумя наиболее характерными признаками снижения иммунитета являются изменение фенотипа и снижение ответа Т-клеток. Одним из наиболее существенных изменений, отмечаемых с возрастом для популяции Т-клеток, является изменение их соотношения: снижение доли естественных Т-клеток и увеличение доли сопутствующих Т-клеток, обладающих «иммунной памятью» [Ярилин А.А., 1999; Dopay R., Salzet М., 2002].
Молекулярные основы старения регуляторных систем
Накопление многих сигнальных молекул в головном мозге с возрастом изменяется. Снижается накопление киназ и фосфатаз, участвующих в фосфорилировании белка, происходят сдвига кальциевого гомеостаза вплоть до формирования кальцификатов в мозговой ткани. Существенно и прогрессивно снижается передача сигналов через подтип D2 допаминовых рецепторов. Инволютивные процессы, связанные со старением, затрагивают и клеточные системы, осуществляющие укладку белковых цепей (шапероны) и их катаболизм (протеосомы и лизосомы), что приводит к снижению чувствительности гипоталамуса к регуляторным сигналам.
Многие нейротрофические факторы, такие как нейротропины BDNF, NGF, нейротензины (NT-3 и NT-4), FGF, нейротрофический фактор глии (DNF) и цилпарный нейротрофический фактор (CNF) способны повышать выживаемость специфических популяций нейронов при экспериментальных воздействиях, моделирующих старение мозга и нейродегенеративные расстройства.
Половые стероиды (эстроген и тестостерон), а также стрессорные стероиды (глюкокортикоиды), секреция которых снижается с возрастом, не могут обеспечить адекватной трофики ЦНС.
Усиление с возрастом действия окислительного стресса (образования свободных радикалов) и накопление поврежденных окислением молекул (белков, нуклеиновых кислот и липидов) провоцирует множественную дисфункцию сигнальных путей. Нейроны также испытывают дефицит энергии в результате митохондриальных нарушений, приводящих к изменению проницаемости мозговых сосудов. Это стимулирует образование в клетках карбонильных групп, ковалентної! модификации цистеина, лизина и гистидина, также способствует перекнсному окислению липидов, гликированию оснований ДНК и РНК. Образование при окислении липидов мембран двойных связей приводит к синтезу разнообразных липидных пероксидов и альдегидов. Перечисленные модификации белков, нуклеиновых кислот и липидов являются обязательным биохимическими компонентами таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона [Kiechle F.L., Malinski Т, 1993; Elmlinger M.W. et al., 2003].
Болезнь Альцгеймера возникает в результате изменений протеолитического процессинга предшественника Р-амилоидного пептида, что приводит к массовому образованию длинной (42-амшюкислотной) формы Р-амилоидного пептида, который самопроизвольно формирует нерастворимые агрегаты, генерирующие активный кислород, который повреждает мембраны клеток и ухудшает синаптическую рецепторную передачу сигналов. При болезни Паркинсона дегенерация допаминергических нейронов в черной субстанции может вызываться митохондриальной недостаточностью и окислительным стрессом, обусловленными различными экзогенными (по отношению к мозгу) причинами.
Однако не все возрастные изменения ЦНС обязательно выражаются в недостаточности функций сигнальных молекул и продуцирующих их клеток. Так, количество нейросекреторных клеток, продуцирующих вазопрессин и кортикотропин рилизинг фактор в паравентрикулярном ядре гипоталамуса, с возрастом повышается. Возможно, подобное усиление нейросекреции является частью механизма возрастного изменения порогов чувствительности гипоталамуса и является одной из причин гиперреактивности гипоталамо-гипофизарной системы в ответ на стрессорное воздействие [Fasano A., Shea-Donohue Т., 2005].
Многочисленные исследования, проведенные за последние 10 лет, свидетельствуют о том, что даже во взрослом мозге происходят регенерационно-восстановительные процессы. Более того, существуют популяции нервных клеток-предшественников (neural progenitor cells — NPC), принимающие в этих процессах непосредственное участие путем миграции в зоны повреждений и последующей дифференцировки в нейроны или глию.
Основные популяции плюрипотентных,№С присутствуют во взрослом мозге в субвентрикулярной зоне и субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа. Эти клетки могут заменять поврежденные нейроны или астроциты, но не все из них претерпевают успешную днфференцировку, гибнут путем апоптоза. Многие из сигналов, контролирующих пролиферацию, днфференцировку и выживание NPC, в настоящее время идентифицированы. Основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный ростовой фактор (EGF) способны поддерживать пролиферацию NPC, в то время как BDNF и NT-3 направляют днфференцировку и/или выживание клеток. Костный морфогенетнческнй белок может индуцировать днфференцировку NPC в астроциты. Дополнительными сигналами, определяющими судьбу NPC, являются Notch, Numb, нейрогенин и секреторные формы АРР (предшественника Р-амилоидного пептида). Эти факторы активно секретируются при повреждении ткани мозга и определяют как направление миграции NPC, так и зону их дифференцировки [Ferrari Е., Dori D., 1995; Kos-KudlaB.etal.,2002].
Методика изучения пинеальной железы и экстрапинеальных источников мелатонина при старении
Пинеальная железа и экстрапинеальные источники мелатонина в висцеральных органах
Для изучения функциональной морфологии пинеальной железы и экстрапинеальных источников МТ при старении человека было проведено исследование образцов пинеальной железы, различных отделов желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, надпочечников, предстательной железы, полученных как при аутопсиях, так и в процессе проведения диагностических биопсионных исследований. Всего было изучено 175 человек мужского пола в возрасте от 16 до 84 лет. Из исследования исключались люди, имевшие онкологическую и психиатрическую патологию.
Плацента
Объектом для изучения накопления МТ в плаценте человека и оценки его роли в старении плаценты был избран ворсинчатый хорион 57 доношенных и 14 переношенных плацент, полученных при родах в родильном отделении ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН у женщин разного возраста. При анализе морфо-функционального состояния плацент использовали заключения патогистологических исследований последов, проведенных в лаборатории патоморфологии названного института. Для исследования были отобраны плаценты первородящих женщин со срочными родами без осложнений. Материал был распределен на 5 групп в зависимости от возраста женщин (табл. 3). В качестве группы сравнения нами была выбрана группа 2 - плаценты женщин нормального репродуктивного возраста (от 18 до 28 лет). Объектом для исследования были выбраны стволовые, промежуточные и терминальные ворсины, которые играют наиболее важную роль в осуществлении обменных процессов между кровью матери и плода. Таблица 3 Распределение плацент по группам в зависимости от возраста женщин № группы Возраст женщин, лет Числообследованныхженщин Процент от числаобследованных женщинв каждой группе 1 До 18 8 14 2 18-28 22 38,5 3 29-35 13 22,5 4 36-40 лет 9 16 5 старше 40 лет 5 9 Естественные киллеры (NK-клетки)
NK-клетки были получены путем центрифугирования в градиенте фиколла. Для этого гепаринизированную кровь доноров (возраст 27-36 лет) или крыс линии Вистар в возрасте 3 мес. отстаивали в течение 50 мин для получения плазмы. Последнюю наслаивали на фиколлверографин (d = 1,077) из расчета 7 мл: плазмы на 2,5 мл фиколла. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 40 мин. Для электронно-микроскопического исследования осадок клеток фиксировали в смеси 2,5% глутаральдегида и 2% формальдегида на 0,1 М фосфатном буфере Соренсена в течение 1 ч с последующей фиксацией 1 % раствором четырехокиси осмия на том же буфере (рН = 7,2).
Иммуногистохимическому и электронно-микроскопическому изучению подвергались как лимфоциты отдельных доноров, так и инкубированные совместно лимфоциты от разных доноров в течение 4 ч при температуре +37 С. Цель совместного инкубирования заключалась в провокации взаимодействия NK-клеток, принадлежащих разным донорам.
Эндотелий
Объектом исследования были избраны капилляры органов с хорошо развитой системой кровоснабжения (печени, селезенки, костного мозга) крыс линии Вистар в возрасте 3 мес. 2.1,2. Методика изучения мелатонин-продуцирующих клеток желудка и двенадцатиперстной кишки в моделях преждевременного старения Модель ускоренного (радиационного) старения Исследование проведено на 40 самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 4 мес. с массой тела 180-200 г. Животные содержались в обычных условиях вивария при дневном освещении и сбалансированном рационе питания. Все животные были разделены на 4 группы (табл. 4): 1 и 1а -интактные крысы; 2 и 2а - облученные крысы.
Гамма-облучение выполнено на аппарате ЛУЧ-1 (источник 60Со; мощность дозы 17,166x10"4 Гр/с). Животные получали ежедневную дозу 1,25 Гр в течение 5 дней.
Забой животных и выделение органов проводили утром с 10 до 12 ч при естественном освещении под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Животные 1, 2 и 3-й групп забивались на 14-е сутки от начала облучения, а 1а, 2а и За групп - на 21 -е сутки от начала облучения. Таблица 4 Распределение животных по группам и срокам эксперимента
Модель преждевременного старения (пинеалэктомия) Исследование проведено на самцах — крысах Вистар, имеющих массу тела 130-140 г. Животные содержались в обычных условиях вивария при дневном освещении и сбалансированном рационе питания в осенне-зимний период.
Общее количество животных (40) было разделено на 2 группы по 20 особей. 1-я группа (контроль) была представлена интактными животными. У животных 2-й группы была произведена операция по удалению пинеальной железы - пинеалэктомия (ПЭ). ПЭ проводилась под эфирным наркозом по оригинальной методике. По средней линии головы производили разрез кожи длиной 1-1,5 см. После обнажения крыши черепа над местом слияния синусов высверливали отверстие с помощью специально изготовленного из металлической трубки полого бура диаметром 5 мм.
Функциональная морфология пинеальной железы человека при старении
Проведенные исследования показали присутствие полиморфных осмиофильных гранул различной величины в эндотелии капилляров печени, селезенки и костного мозга.
Гранулы в эндотелиальных клетках располагались поодиночке и группами в цитоплазме среди других органоидов - митохондрий, рибосом, лизосом, цистерн шероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума, вакуолей (рис. 23). Элементы пластинчатого комплекса часто выявлялись в непосредственной близости от гранул.
Размеры, форма и строение гранул были различными, однако, наиболее часто встречались гранулы трех типов: - I - гомогенные электронно-плотные гранулы овальной или бобовидной формы с очень узким светлым ободком вокруг электронно-плотной сердцевины или без него; - II - «перстневидные» гранулы характерного вида: электронно-плотная сердцевина расположена центрально или смещена к одному из полюсов с широким светлым ореолом вокруг нее; - III - крупные гранулы округлой формы с электронно-плотной сердцевиной и тонким светлым ореолом вокруг нее.
В некоторых эндотелиальных клетках гранулы располагались в непосредственной близости от цитоплазматической мембраны, обращенной в просвет сосуда. Встречались участки набухшего эндотелия, которые образовывали почковидные выпячивания, в верхушках которых располагались одна или несколько секреторных гранул. Оболочка одной из них составляла единое целое с цитоплазматической мембраной эндотелиальной клетки и, таким образом, электронно-плотная гранула ограничивала сообщение между цитоплазмой эндотелиальной клетки в месте выпячивания и просветом капилляра по типу «пробки».
В настоящее время разработаны объективные ультраструктурные критерии, которые дают основание установить эндокринную природу описанных нами гранул в эндотелиальных клетках и судить о типе синтезируемых в них гормонов.
Так, обнаруженные гранулы овальной или бобовидной формы характерны для МТ и его основного предшественника - серотонина. Подобные гранулы в большом количестве содержатся в энтерохромаффинных клетках желудочно-кишечного тракта, являющихся основным местом биосинтеза этих веществ в организме и в других клетках, продуцирующих эти гормоны в различных органах. «Перстневидные» гранулы по своему строению идентичны секреторным гранулам В-клеток поджелудочной железы, ответственных за продукцию инсулина. Крупные округлые гранулы третьего типа подобны катехоламинсодержащим гранулам клеток мозгового вещества надпочечников.
Таким образом, проведенные электронно-микроскопические исследования позволили впервые установить, что местом локализации эндокринных секреторных гранул являются эндотелиальные клетки капилляров печени, селезенки и костного мозга. Идентификация секреторных гранул свидетельствует о том, что кроме присутствия в нейронах и пептидергических нервных волокнах, обнаруженных в сосудистой стенке, биосинтез гормонов возможен непосредственно в отдельных эндотелиальных клетках. Преобладающим типом гранул в эндотелиальных клетках являются секреторные нейроэндокринные гранулы, характерные для МТ.
При старении количество секреторных гранул в эндотелиальных клетках резко уменьшается, во мнопіх эндотелноцнтах отмечается картина экзоцитоза (рис. 24).
Результаты исследования динамики аккумуляции 3Н-МТ у старых мышей-самцов показывают, что уже через 5 мин после введения самые высокие концентрации МТ зарегистрированы в органах желудочно-кишечного тракта, сердце, плазме крови. При этом в органах желудочно-кишечного тракта наблюдалась максимальная аккумуляция Н-МТ: в слизистой оболочке желудка - через 30 мин после введения меченого гормона; в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки - через 5 мин, продолжала увеличиваться к 15 мин и оставалась высокой к 30 мин; в тонкой кишке -самое высокое содержание Н-МТ по сравнению со всеми остальными исследуемыми органами было через 30 мин, незначительно снижаясь к 6 ч; в толстой кишке - через 30 мин, снижаясь к 1 ч, возрастала к 3 ч и через 1 сут, хотя по абсолютной величине коэффициент дифференциального накопления (КДН) снижался, но оставался более высоким, чем в других органах.
В сердце высокое содержание МТ наблюдалось на протяжении 30 мин (рис. 25), в плазме крови максимум содержания меченого гормона регистрировался к 30 мин. Достаточно высокое содержание 3Н-МТ было в легких и тимусе. Н-МТ не был обнаружен на протяжении всего времени исследования (24 ч) в эпифизе и гипофизе.
Изучение экскреции метаболитов Н-МТ у исследуемых животных проводилось путем отбора мочи и фекалий в течение двух суток. Аликвоты мочи и фекалий радиометрировали. Общая радиоактивность обнаружилась в моче в течение 48 ч и составляла 86-90% от введенного количества 3Н-МТ, 7-10% было обнаружено в фекалиях. Эти данные позволяют заключить, что МТ выводится из организма преимущественно почками.