Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Краткая историческая справка 11
1.2. Клиническая характеристика раков полости рта 12
1.3. Генетические повреждения, ассоциированные с развитием рака полости рта 18
1.4. Мутации и экспрессия гена рецептора эпидермального фактора роста (EGRF) у больных с плоскоклеточным раком полости рта 21
1.5. Роль мутаций в гене BRCA1 в изменениях клеточного ответа при возникновении и развитии раковых опухолей 26
1.6. Применение химиотерапевтических препаратов при плоскоклеточном раке полости рта 1.6.1. Цистпластин 35
1.6.2. Гефитиниб 38
1.6.3. Эрлотиниб 39
1.6.4. Низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ 40
1.6.5. Комбинированное лечение химиопрепаратами и лучевой терапией 40
1.7. Устойчивость опухолевых клеток к лекарственным препаратам 42
Глава 2. Объект и методики исследования 44
2.1. Объект исследования 44
2.2. Методики исследования 47
2.2.1. Оценка архивного клинического материала 47
2.2.2. Гистологические исследования 48
2.2.3.Выполнение иммуногистохимического исследования 49
2.2.4. Статистический анализ данных 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 54
3.1. Клинические и молекулярно-генетические показатели опухолей у
пациентов с доброкачественными заболеваниями слюнных желез 54
3.2. Особенности клинических проявлений и результаты молекулярно генетических исследований у пациентов со злокачественными заболеваниями полости рта 55
3.2.1. Клинические данные 56
3.2.2. Результаты молекулярно-генетических исследований 57
3.2.3. Клинические данные 59
3.2.4. Анализ мутаций EGFR, экспрессии BRCA1 и статуса онкогена RET при злокачественных и доброкачественных опухолях слюнных желёз 63
3.2.5. Определение мутационного статуса гена EGFR 69
3.2.6. Молекулярно-генетические исследования, как фактор диагностики опухолевых заболеваний полости рта 69
3.2.7. Анализ мутаций в гене EGFR 70
3.2.8. Определение мутационного статуса гена ALK 73
3.3. Оценка результатов различных типов лечебных мероприятий по данным историй болезни пациентов со злокачественными новообразованиями в полости рта 80
Список литературы
- Генетические повреждения, ассоциированные с развитием рака полости рта
- Оценка архивного клинического материала
- Особенности клинических проявлений и результаты молекулярно генетических исследований у пациентов со злокачественными заболеваниями полости рта
- Определение мутационного статуса гена ALK
Генетические повреждения, ассоциированные с развитием рака полости рта
Важность влияния EGRF на прогноз рака полости рта стала основанием для разработки соответствующих медикаментозных средств - анти EGRF терапии, целью которой стали как экстрацеллюлярные домены (моноклональные антитела
Рецептор эпидермального фактора роста представляет собой трансмембранный протеин ErbB - семейства рецепторов тирозинкиназ. EGFR наибольшее распространение имеет в клетках эпителия и эмбриональной ткани, хотя обнаружен и во многих других тканях организма. Он продуцируется одним из онкогенов erb - c-erbB-1 (HER-1), в состав этого семейства входят с-егЬВ-2 (HER-2/neu), с-егЬВЗ и с-егЪВ-4.Генетический локус, где расположен ErbBl, находится на коротком плече 7 хромосомы - 7р12 (Рис. 1). Взаимодействие с клеткой происходит на её мембране через рецептор эпидермального фактора (Epidermal growth factor receptor, EGFR) роста путём активации внутриклеточных киназ. Были получены данные, что гиперэкспрессия EGFR связана с процессами пролиферации и апоптоза, передачей митогенных сигналов в клетках опухолевой ткани (Sheikh A. et al., 2008).
В лиганд-связывающем домене существует два участка богатых цистеином (Cys). Функция этих участков стабилизация вторичной структуры домена. А также пара глобулярных фрагментов (насыщенные глицином). Функция -узнавание специфических лигандов, обеспечивают специфичность восприятия сигнала. 2. Трансмембранный домен, а-спиральный участок, состоит из 23 гидрофобных аминокислот. Внутриклеточный домен. Цитоплазматический тирозинкиназный домен - это самая консервативная область EGRF. Имеет сайт связывания АТФ (АТР, Adenosine-5 riphosphate). Состоит из 542 аминокислоты. Внутриклеточный домен обладает тирозинкиназной активностью (фосфорилируют белки по тирозиновым остаткам), что важно для осуществления контроля за пролиферацией, инициацией ДНК, подвижностью клеток.
Влияние этой системы сигнализации на опухолевый процесс в человеческом организме реализуется сложными механизмами. В частности, аутокринная петля - EGFR секретируемый клеткой, индуцирует синтез своего EGFR в этой же клетке. Паракринная петля - факторы роста приводят к индукции синтеза EGFR в соседней клетке. Таким образом избыточно экспрессируется или активируется, по крайней мере, 50% эпителиальных злокачественных опухолей. Далее, FIER2 очень активен и избыточно экспрессируется примерно в 20% - 25% раковых опухолей молочной железы, FfER и FIER4 экспрессируются, но очень вариабельно, в опухолях молочной железы, а также в других видах рака (Bernardes V. etal. 2010).
На сегодняшний момент существуют доказательства гиперэкспрессии EGFR во многих опухолях, в том числе и в раках полости рта. Избыточная экспрессия и/или активации EGFR, FfER2, FfER3 коррелирует с плохим прогнозом заболевания. Поэтому в терапии больных раком используются различные ингибиторы этих белков (Bonner J. et al, 2006; Vermorken J.et al., 2008).
Система формирования сигнала, состоящая из четырёх интерактивных рецепторов и 10 различных лигандов, делает крайне сложным измерение результата такого взаимодействия в человеческих раковых опухолях и изучение роли данных семейств в физиологической и неопластической трансформации клеток. Также, вопреки мнению множества источников, делающих акцент на контроле роста при исследовании EGFR, необходимо отметить, что активация некоторых лигандов может приводить к изменению опухолевых клеток, сопровождающемуся прекращением их роста. Например, Шелтон (Shelton Н. et al. 2003), показали в своей работе антипролиферативный эффект HER4 при взаимодействии EGFR с определёнными аддентами. В различных исследованиях опухолей полости рта были обнаружены мутации в виде амплификации генов эпидермального фактора рост, геномного имбаланса и делеций. Также было показано, что любые изменения в локусе 7р12 должны рассматриваться в совокупности с общим анализом всех геномных нарушений, присутствующих при плоскоклеточном раке полости рта (Bachman К. et al, 2004; Gebhart Е. et al., 2004; Temam S. et al, 2007; Sheikh A. et al, 2008; Van Damme N. et al. 2010; Bernardes V. et al, 2010; Morris L. et al., 2011).
Гиперэкспрессия EGRF в раковых клетках полости рта достигается путём аутокринной стимуляции посредством ко-экспрессии рецептора и связывание его с одним из лигандов (Sheikh A. et al., 2008), с TGFa или при экспрессии мутантных усечённых форм рецептора (EGRF вариант III).
Клинически гиперэкспрессия ErbB/EGRF ассоциируется с низким уровнем дифференциации опухолевых клеток, увеличением пролиферации, ингибированием апоптоза и неоангиогенезом. По аналогии с этим определение в плоскоклеточном раке полости рта экспрессии EGFR и HER-2 иммуногистохимическим методом с помощью моноклональных антител клон 31G7 и клон СВ11 (145) столь же важно для прогнозирования клинического течения заболевания. На рисунке 44, показана позитивная реакция -гиперэкспрессия EGFR, на рисунке 45 - негативная для HER-2.
Все эти изменения согласуются также с плохим прогнозом, агрессивным поведением опухоли, дальнейшим распространением опухоли, увеличением размеров, вовлечением лимфатических узлов, резистентностью к лучевой терапии и высокому риску метастазирования. Помимо мутаций EGFR фактором высокого риска для развития опухолей плоскоклеточного рака полости рта, а также молочной железы, простаты, поджелудочной железы, желудка, являются мутации в генах и BRCA1 (Duncan J. et al, 1998; Карпухин А. и др. 1999; Lane Т., 2004; Antoniou A. et al, 2010; Saiki Y. etal.,2011).
Оценка архивного клинического материала
Цистпластин представляет собой производное платины и обладает выраженным алкилирующим действием.
Токсическое действие препаратов платины на клетки было открыто Б. Розенбергом в начале шестидесятых годов прошлого века. Наибольший эффект показывала соль платины (цис-дихлородиамминплатина). Противоопухолевый эффект которой был подтверждён в дальнейшем в опытах на мышах. С 1980 года препарат получил название - «Циспластин». Фармакологическое действие основано на нарушении функции ДНК. Путём соединения препарата с гуаниновыми основаниями ДНК. Что приводит к нарушению репликации и транскрипции с последующей задержкой клеточного цикла и апоптозом. Наиболее часто назначают Циспластин в сочетании с 5 - фторурацилом для проведения неоадъювантной химиотерапии (186, 191, 193, 197). Экспериментально был показан синергизм между этими препаратами. И уже в пилотных клинических исследованиях были получены обнадёживающие результаты. Однако в дальнейшем высокая эффективность не была подтверждена. Также воодушевление онкологов от применения этой комбинации снизилось в связи с отрицательными результатами по продолжительности жизни данных пациентов. Кроме того, последние данные рандомизированных испытаний, сравнивающих применение цисплатина и фторурацила с другими комбинациями и даже отдельными препаратами, не продемонстрировали преимущества этой схемы (194). Тем не менее, эта комбинация остается самой популярной и является у многих врачей методом выбора для лечения распространенного процесса и в качестве неоадъювантной химиотерапии. По сводным данным эффективность схемы "цисплатин + фторурацил" при неоадъювантной химиотерапии составляет 79%, а при рецидивах заболевания - 31% (193). Применение менее токсичной схемы, включающей карбоплатин с фторурацилом, показало эффективность эквивалентную цисплатину с фторурацилом (Платинский Л., 2001)
В многочисленных работах были проведены исследования различных комбинаций химиотерапевтических препаратов, дозировок и режимов, включавших метотрексат, цисплатин, фторурацил и блеомицин. Было установлено, что лечебные схемы, включавшие комбинации препаратов платины с блеомицином, были активнее схем без препаратов платины. (Платинский Л., 2001).
Также, в различных исследованиях было показано, что снижение экспрессии BRCA1 ведёт к повышению чувствительности опухолевых клеток к Циспластину (Tassone P. et al, 2003; Quinn J. et al, 2003; Kennedy R. D. et al, 2004; Kelland L. et al, 2007; Burkitt K. et al, 2008; Stordal B. et al, 2009; Saiki Y. et al, 2011; Gao Y. et al., 2013). Это связано с тем, что в клетке с нормальной функцией BCRA1 уровень репарации ДНК находится также на нормальном уровне. И повреждающее действие химиотерапевтических препаратов на ДНК тем самым нивелируется. Как механизм резистентности опухолей также рассматривается сверхэкспрессия BRCA1 (Kennedy R. et al., 2004). В работе Burkitt К. and Ljungman М. 2007, посвященной оценке чувствительности рака полости рта к лечению Циспластином была показана взаимосвязь между FA / BRCA метаболического пути в репарации межцепочечных сшивок, которые вызывает применение Циспластина (Burkitt К. et al., 2007).
Метаболический путь FA / BRCA имеет важное значение для полноценного ответа опухолевой клетки на цисплатин и другие подобные препараты. Клетки с мутациями FA (Fanconi anemia) в отличие от нормальных проявляют сильную задержку в S-фазе клеточного цикла. В S-фазе клеточного цикла во время столкновения репликационной вилки с повреждением, в том и другом случае происходит образование двухцепочечного разрыва. Активируются FA/BRCA белки, это приводит к процессу присоединения к белку FANCD2 молекулы убиквитина. Эта система инициирует процесс гомологичной рекомбинации с последующей репарацией двухцепочечного разрыва (Долгова Е.В. и др., 2010).
При появлении повреждения в молекуле ДНК происходит активация FANCD2 фактора. Активированный (моноубиквитинированный) FANCD2 (FANCD2-L) обеспечивает соединение BRCA2 с RAD51 и присоединения комплекса на места повреждения ДНК. Комплекс BRCA2 - RAD51 производит обнаружение гомологичных последовательностей на гомологичных хромосомах либо в гомологичных регионах сестринских хроматид, что нужно для гомологичной рекомбинации. Было выявлено, что метаболический путь FA/BRCA, необходимый в процессе репарации межцепочечных сшивок, активируется в S-фазе после формирования двухцепочечного разрыва (206).
К. Burkitt and М. Ljungman в своём исследовании 2007 года установили, что три из четырех цисплатин - чувствительных клеточных линий рака головы и шеи показали дефектное образование FANCD2, в то время как все четыре цисплатин -устойчивые клеточные линии формировали FANCD2 после лечения цисплатином.
Гефитиниб (ZD 1839, Иресса, Тарцева) - препарат, разработаный в лаборатории англо-шведской фармацевтической компании AstraZeneca London, UK. По своему химическому строению относится к группе анилинохиназолинов. Механизм действия Гефитиниба основан на том, что препарат конкурентно и обратимо связывается с тирозинкиназой - С, где фосфорилируется. Это приводит к блокировке фосфорилирования белков 3-киназа фосфатидининозитола, активатора ГТФазы белка ras (GAP белок), киназы белков MAP, киназы белков raf, липокортина и белка c-crb В-2. Таким образом, на уровне тирозинкиназного С - конца происходит, обрыв передачи сигнала к транскрипционным факторам (207, 208). (Тюляндин С. и др., 2002; Mendelson, J. et al., 2003).
Применение Гефитиниба имело неплохой клинический эффект у пациентов с диссеминированным не мелкоклеточным раком лёгких. Больные имели улучшение на фоне лечения уже в первые дни применения препарата. Также, был выявлен положительный эффект от терапии Гефитинибом у пациентов с устойчивостью к стандартным схемам химиотерапевтического лечения.
Однако в последующих исследованиях лечения рака, в том числе головы и шеи, не было продемонстрировано клинической пользы, связанной с добавлением гефитиниба к стандартной терапии (Caponigro F. et al, 2008). Кроме того, было проведено большое, многоцентровое исследование III фазы. В этом исследовании проводилось сравнение применения 250 мг гефитиниба и 500 мг гефитиниба с добавлением метотрексата при лечении резистентных форм плоскоклеточного рака головы и шеи. Выяснилось, что введение гефитиниба в химиотерапевтическую схему не улучшило общую выживаемость (Stewart J. et al., 2009).
Особенности клинических проявлений и результаты молекулярно генетических исследований у пациентов со злокачественными заболеваниями полости рта
Пациенты контрольной группы с доброкачественными опухолями слюнных желёз были включены в отдельную группу. Численность этой группы -13 человек, что составило 22, 8 % от общего числа больных, которым были выполнены молекулярно-генетические исследования.
В клинической картине заболевания отмечены характерные жалобы больных на дискомфорт в полости рта и наличие безболезненного или малоболезненного опухолевидного образования. Длительный анамнез, медленное прогрессирование заболевания, четкие границы и высокая подвижность опухоли позволяли в большинстве своем еще до выполнения биопсии предполагать доброкачественность опухоли. Результаты патоморфологического исследования позволяли точно определить гистологический вид новообразования.
Как видно из материалов таблицы 9, основную часть (10 наблюдений из 13) составили пациенты с плеоморфной аденомой. Здесь же представлены результаты поиска в опухолевом материале мутаций EGFR и ALK.
Результаты иммуно-гистохимических исследований в контрольной группе пациентов с определением наличия молекулярно-генетических маркеров опухолевого роста показали полное отсутствие таковых в доброкачественных опухолях слюнных желез. Таблица 9.
Наиболее часто уровень экспрессии BRCA-1 оставался в пределах от 3,0 до 4,0 и в среднем по всей контрольной группе составил 3,3. Таким образом, для пациентов с доброкачественными заболеваниями слюнных желез характерно отсутствие мутаций EGFR и ALK в геноме опухолей и относительно устойчивые низкие показатели BRCA1 с небольшим размахом варьирования.
Клинические проявления при злокачественных заболеваниях зависели от локализации опухоли, стадии заболевания. У части пациентов удалось обнаружить молекулярно-генетические аномалии. Однако на уровне выполненного много факторного анализа не проявилась связь между результатами иммуно-гистохимических исследований и нозологическими формами заболевания, а также их связь с индивидуальными особенностями клинического течения заболевания.
Анализ историй болезни показал, что пациенты, страдающие злокачественными заболеваниями полости рта, предъявляли жалобы на чувство дискомфорта, болезненность в области языка при приеме пищи, наличие изъязвлений, кровоточивость, формирование опухолевидных образований на слизистых оболочках полости рта, увеличение шейных лимфатических узлов, затруднения при глотании. При этом в большинстве случаев результаты последующего обследования пациентов показывали, что характер поражения по своей тяжести и объему распространения намного превосходил субъективные ощущения. Здесь, как и во многих случаях онкологических заболеваний, при начальных стадиях отсутствуют субъективно значимые клинические проявления опухолевого роста, и этот факт во многом определил позднее обращение пациентов за медицинской помощью.
Специальный анализ состава обследованных пациентов по длительности уже проявившегося периода до момента обращения пациентов к врачу показал, что этот срок составлял от до мес и в среднем - мес.
На момент обращения к врачу в % случаев была диагностирована 2. В % - 3 и в % - 4 стадия, (см данные в таблице Длительность заболевания до обращения к врачу ....).
Причины поздней диагностики рака полости рта стали предметом наших дополнительных исследований, и данный вопрос изложен в главе обсуждения результатов исследования. При физикальном обследовании больных пальпация изменения подчелюстных лимфатических узлов позволила выявить их изменения и диагностировать 2а и 3 стадии заболевания у % больных. Дополнительные обследования выявили метастазы у.... пациентов, что составило % от общего числа госпитализированных больных. Направлением гематогенного распространения процесса в этих случаях было метастазирование в легкие.
Для иммуно-гистохимического исследования была сделана специальная выборка различных по своему гистологическому строению злокачественных опухолей полости рта у 44 пациентов.
При определении мутационного статуса гена EGFR в группе пациентов с опухолями полости рта нами не обнаружены мутаций в виде микроделеции в 19 экзоне и однонуклеотидной замены L858R, которые представляют до 90% всех активирующих мутаций, обнаруженных в опухолях легкого (Furugaki et al., 2014). Этот факт может служить подтверждением имеющейся информации из базы данных соматических мутаций в опухолях COSMIC, о том, что спектр мутаций EGFR в новообразованиях головы и шеи может значительно отличаться от такового для опухолей легкого. В связи с этим мы расширили зону поиска и использовали систематический анализ последовательности киназного домена (экзоны 18-24) EGFR, результаты которого оценивали по характерным кривым плавления с использованием методики высокого разрешения в комбинации с секвенированием по Сэнгеру. Кривые плавления исследуемых образцов сравнивали с кривой плавления контрольного образца без мутаций. Образцы с аномальными кривыми плавления подвергались секвенированию. Анализ последовательности киназного домена EGFR в одном случае выявил образец с мутацией p.A702S (c.2104G T) в экзоне 18 гена EGFR, как это уже было отмечено выше. Ранее названная мутация была обнаружена в группе опухолей легкого китайских пациентов (Xu et al., 2009). Данные о чувствительности или резистентности опухолей с этой мутацией к терапии ингибиторами тирозинкиназ в литературе отсутствуют. Однако опухоли с другой мутацией в 18 экзоне (G719S) считаются чувствительными к такому лечению.
Кроме того, нами был проведен анализ наличия несбалансированной экспрессии 5Л и 3Л фрагментов мРНК EGFR. Это тестирование основывалось на сравнении уровней экспрессии экзонов 5-7 и экзонов 21-23 гена. Наличие повышенного уровня экспрессии 3Л фрагмента гена может говорить о присутствии в опухоли транслокации, затрагивающих киназный домен EGFR или других нарушениях, вызывающих активацию киназного домена. Тест на наличие несбалансированной экспрессии EGFR удалось провести для 51 образца. Ни в одном из них не был обнаружен повышенный уровень экспрессии 3Л-фрагмента гена.
Определение мутационного статуса гена ALK
Провести иммуногистохимическое исследование всех образцов опухолевого материала, не представлялось возможным, в связи с возвратом парафиновых блоков по запросу больных. Так как пациенты продолжали лечение в других медицинских учреждениях С-Петербурга. Полному исследованию удалось подвергнуть морфологический материал 57 пациентов.
Подготовка материала заключалась в том, что с каждого парафинового блока злокачественной опухоли плоскоклеточного рака слизистой полости рта, доброкачественных и злокачественных опухолей слюнных желёз с помощью микротома Leica SM 2000R (Sliding Microtome for Routine Applications) были сделаны срезы толщиной 4 мкм (222). Парафиновые срезы расправили на водяной бане Гистобат Leica НП210. Далее срез поместили на стекло, покрытое L-полилизином и высушили в термостате при t 37С в течение 2-х часов. После этого срезы депарафинизировались в двух о-ксилоле 5 минут в каждом. В течение 5 минут обезвоживали и отмыли в концентрированном этиловом спирте. Далее проводилось блокирование эндогенной пероксидазы в 3 % перекиси водорода на воде пять минут и промывка стёкол в дистиллированной воде 3 минуты. После этого была проведена демаскировка антигенов с помощью кипячения в цитратном буфере с рН 6,0 или в ЭДТА с рН 9,0 в водяной бане при температуре буфера 95-99 С 20 мин, затем стёкла остужались в контейнерах 20 мин при комнатной температуре. После охлаждения стёкла перенесли в дистиллированную воду на 1-2 мин и затем промывались ТВ S -промывочным буфером (DAKO, Дания) два раза по 5 минут. В конце срезы обвели парафиновым карандашом (DAKO Cytomation Pen) в контейнере с плоским дном во влажной среде.
Разведение антител проводилось при помощи буфера Antibody Diluent with Background Reducing Components фирмы DakoCytomation, code S3022, содержащий компонент, препятствующий неспецифическому связыванию антител (Таблица 8).
Экспозиция первых антител составляла 1 час при постоянной температуре 20С, после этого стёкла со срезами промывали в TBS-буфере дважды по 5 минут. Связывание вторых антител с опухолевыми клетками определяли с помощью стандартной биотин-стрептавидин-пероксидазной методики с диаминобензидином в качестве хромогена. После реакции с диаминобензидином срезы промывали в дистиллированной воде в течение 3 минут и подвергали дополнительному окрашиванию гематоксилином Майера 1-2 минуты, потом отмывали в воде ещё 15 минут, обезвоживали в 96 % спирте, изопропиловых спирте и осветляли в ксилоле в течение 5 минут. Полученные срезы заключили в канадский бальзам.
Определение EGFR мутации в исследуемых образцах также проводили после обработки парафиновых блоков, полученных из первичной опухоли. Срезы толщиной 15 микрон с данных блоков, которые предварительно прошли морфологическую верификацию на присутствие опухолевой ткани, нанесли на предметные стекла. Выделение опухолевых клеток проводилось путём стереотактической диссекции под контролем светового микроскопа из срезов, содержавших не менее 40 % опухолевых клеток. Для получения ДНК применяли следующий метод (Imyanitov, Е. et al, 2001). - депарафинизация - инкубация два раза в растворе ксилола 500мкл при комнатной температуре или 37 С и один раз в 96 % этаноле в течение 20 - 30 минут; - растворение в 200 мкл лизирующего буфера: ІхТЕ (Юммоль Tris-HCl при рН=8,0, 0,1 ммоль ЭДТА; рН=8,0), 2 % натрия додецилсульфат + 3,5 мкл протеиназы К в течение ночи, при 60С, для полного растворения ткани, можно добавить ещё порцию протеиназы К 3,5 мкл утром; - очистка - фенол нейтральный 1 объем 200 мкл + 60 мкл смеси хлороформа + изоамиловый спирт 24:1 (1/3 объема), всё перемешать 5-10 минут и отцентрифугировать в течение 10-30 минут на максимальных оборотах; - в чистые пробирки собирать верхнюю фазу, добавить 60 мкл хлороформа (1/3 объема), перемешать, отцентрифугировать; - собрать верхнюю фазу в чистые пробирки, добавить 1/10 объема натрия ацетата, перемешать; - добавить один объем изопропанола, добавить 1 мкл гликогена; - осаждать не менее 2-х часов при температуре 20С; - отцентрифугировать 15-20 минут на максимальных оборотах; - удалить спирт, добавить 70 % спирт, перемешать медленно 10 мин, отцентрифугировать 1 мин; - полностью удалить спирт и растворить осадок в 100 мкл воды при 60С.
Обнаружение EGFR мутаций производилось при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР - реакция осуществлялась в объеме 10 микролитров, содержащий 1 мкл раствора ДНК, 0,5 ед. ДНК-полимеразы, 1-кратный ПНР-буфер (рН буфера 8,3), 2,5 миллимоль хлорида магния, 200 мкМ каждого из нуклеотидтрифосфатов, 0,3 мкМ прямого и обратного праймеров. ПЦР начинали с 10-минутной активации Taq-полимеразы при 95С. Для накопления ПЦР-продукта проводилось 45 циклов амплификации - денатурация - 15 секунд при 95С - отжиг - 30 секунд при 57С - синтез - 30 секунд при 72С Конечный продукт разделяли путём электрофореза в 10 % полиакриламидном геле. Аллелю дикого типа соответствует фрагмент 127 пар оснований, в случае делеции должен был наблюдаться дополнительный фрагмент меньшего размера.
Размер ампликона контролировали с помощью pUC19, порезанная рестриктазой MSP1 (маркер молекулярного веса).
Положительный контроль - ДНК, 19 экзон которой подвергали секвенированию, которое выявляло наличие делеции в этом экзоне. Отрицательный контроль - ДНК без мутации в этом экзоне. В качестве метода систематического анализа последовательности киназного домена (экзоны 18-24) EGFR нами был выбран анализ кривых плавления с высоким разрешением (High Resolution Melting Analysis, HRMA) в комбинации с секвенированием по Сэнгеру. Анализ кривых плавления с высоким разрешением является относительно новым методом - он был разработан в 2003 году (Vossen et al, 2009; Wittwer et al, 2009). HRMA основан на регистрации флуоресценции интеркалирующих красок при нагревании продуктов ПЦР до 95С (плавлении). Выявление малейших отклонений, вызванных однонуклеотидными заменами, в температуре или форме кривой плавления ДНК возможно благодаря высокой разрешающей способности приборов.