Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Отечно-инфильтративный рак молочной железы, современное состояние проблемы (обзор литературы) 11
1.1 Вопросы классификации и формулировки диагноза при отечно-инфильтративной форме рака молочной железы 11
1.2 Клинические особенности инфильтративно-отечной формы рака молочной железы
1.3 Инструментальная диагностика отечно-инфильтративной формы рака молочной железы 16
1.4 Морфологическая характеристика отечно-инфильтративной формы рака молочной железы 21
1.5 Лечение отечно-инфильтративной формы рака молочной железы 22
1.6 Особенности молекулярной биологии отечно-инфильтративной формы рака молочной железы 26
ГЛАВА 2. Клинический материал и методы исследований 33
2.1 Дизайн исследования 33
2.2 Общая характеристика методов исследования и анализа его результатов 34
2.3 Общая характеристика больных 37
2.4 Методы изучения молекулярно-биологических характеристик в группах сравнения
2.4.1 Материал для проведения молекулярно-биологических исследований 47
2.4.2 Анализ экспрессии рецепторов стероидных гормонов, экспрессии HER2, ki-67 в опухолевой ткани 48
2.4.3 Метод определения транслокаций в гене ALK 49 2.4.4 Метод определения амплификации гена HER2/neu 50
2.4.5 Анализ соматический мутаций в генах РІКЗСА, АТК1, ALK 51
2.4.6 Анализ наследственных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBNHBLMI 52
ГЛАВА 3. Особенности течения отечно-инфильтративного рака молочной железы и эффективность его лечения
3.1 Критерии установления диагноза отечно-инфильтративный рак молочной железы 55
3.2 Клинические особенности и результаты лечения отечно-инфильтративной формой рака молочной железы
3.2.1 Возрастные характеристики больных отечно-инфильтративной формой рака молочной железы на момент установления диагноза 60
3.2.2 Избыточная масса тела и ожирение, как фактор риска возникновения отечно-инфильтративной формы рака молочной железы 61
3.2.3 Отдаленные результаты лечения у больных в группе отечно-инфильтративной формы рака молочной железы и в группе неотечных местно-распространенных форм рака молочной железы 62
3.2.4 Метастатический потенциал опухоли при отечно-инфильтративной форме рака молочной железы и неотечных местно-распространенных формах РМЖ 65
3.3 Прогностическое значение клинических и молекулярно-биологических факторов у больных отечно-инфильтративной формой рака молочной железы 66
3.3.1 Зависимость клинических исходов от гистологического типа опухоли 67
3.3.2 Зависимость клинических исходов от степени злокачественности опухоли 69
3.3.3 Зависимость клинических исходов от рецепторного статуса опухоли 72
3.3.4 Зависимость клинических исходов от амплификации гена HER2/neu 75
3.3.5 Зависимость клинических исходов от значений пролиферативной активности (ki-67) 78
3.3.6 Зависимость клинических исходов от молекулярно-биологического подтипа опухоли 80
3.3.7 Влияние возрастных характеристик, ожирения и репродуктивного статуса на показатели выживаемости у больных отечно-инфильтративной
формой рака молочной железы 83
ГЛАВА 4. Определние специфических молекулярно биологических маркеров отечно-инфильтративного рака молочной железы 86
4.1 Обоснование выбора исследуемых молекулярно-биологических маркеров 87
4.2 Собственные результаты молекулярно-генетических исследований 91
Заключение 99
Выводы 109
Практические рекомендации 111
Список литературы
- Инструментальная диагностика отечно-инфильтративной формы рака молочной железы
- Методы изучения молекулярно-биологических характеристик в группах сравнения
- Возрастные характеристики больных отечно-инфильтративной формой рака молочной железы на момент установления диагноза
- Собственные результаты молекулярно-генетических исследований
Инструментальная диагностика отечно-инфильтративной формы рака молочной железы
Основой для лучевой диагностики отечного рака молочной железы являются методы стандартной визуализации - маммография и ультразвуковое исследование (УЗИ), а в качестве дополнительного используется магнитно-резонансная томография (МРТ). Кроме того, на современном этапе развития новых диагностических технологий особую роль играют методы т.н. гибридной визуализации позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография (ПЭТ/КТ) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография/компьютерная томография (ОФЭКТ/КТ).
Маммография на сегодняшний день является «золотым стандартом» диагностики заболеваний молочных желез [7, 17, 18, 39]. В то же время маммография остается наименее чувствительным методом для визуализации паренхиматозных изменений при ОИРМЖ [51].
В некоторых случаях ОИРМЖ выполнение маммографии не представляется возможным из-за выраженного болевого синдрома вызванного сжатием пораженной молочной железы при попытке выполнения исследования.
Рентгенологические изменения у пациентов с ОИРМЖ включают в себя утолщение кожи, утолщение трабекул, потерю четкости изображения деталей, локальное или диффузное ассиметричное увеличение плотности паренхимы, наличие объемного образования с типичными признаками злокачественности [32, 39, 43, 203].
Утолщение кожи наиболее частый рентгенологический признак ОИРМЖ (частота встречаемости 84%), который является результатом нарушения дренажной функции лимфатических сосудов кожи, обтурированных опухолевыми эмболами [108, 126]. Частота встречаемости утолщения трабекул доходит до 81%. Увеличение плотности паренхимы связано с интрамаммарным отеком и выявляется в 93,5% случаев ОИРМЖ [184]. С увеличением плотности паренхимы связано затруднение визуализации опухолевой массы. По данным Gimhan-Bilgen I. при выполнении маммографии опухоль выявляется лишь у 16% больных ОИРМЖ [108]. В исследовании Yang W. частота выявления опухоли при маммографии доходит до 80% [203]. Возможности визуализировать опухоль при рентгенологическом исследовании молочных желез на фоне отека тканей увеличились с появлением в клинической практике цифровой маммографии, которая обладает преимуществами, свойственными цифровым методам [42, 116]. Преимущества заключаются в возможности получать больше диагностической информации при обследовании молочных желез за счет применения компьютерных технологий обработки снимков. Используя данные технологии можно воспроизвести картину мельчайших патологических изменений, используя разные дополнительные функции обработки снимков, такие, как панорамирование, изменение масштаба снимка, измерение длин прямолинейных и криволинейных отрезков, измерение углов, измерение произвольных площадей, изменения яркости/контрастности, возможности инверсии изображения, поворот изображения. Кроме того, существует возможность просмотра одновременно нескольких снимков, что позволяет проводить сравнительную оценку структуры левой и правой молочных желез, а также проводить мониторинг состояния молочных желез в динамике [25].
Ультразвуковое исследование УЗИ молочных желез с конца 90-х годов стало обязательным дополнением к маммографии и обычно используется на заключительных этапах диагностики. Преимущества УЗИ включают в себя, высокую пропускную способность, визуализацию элементов структуры железы на плотном фоне и безопасность в плане дозовой нагрузки [41]. С внедрением новых компьютерных технологий диагностические возможности ультразвукового метода расширились благодаря энергетическому и цветовому доплеровскому картированию, эластографии, бесконтрастной и эхоконтрастной ангиографии, нативной и второй гармонике, трехмерной и панорамной эхографии. Особый интерес представляет получение изображений сосудов, в том числе опухолевых, с помощью УЗИ. Характер васкуляризации опухоли считают критерием роста и инвазивности [42].В возможности метода входит определение паренхиматозных изменений у пациентов с ОИРМЖ, что облегчает дальнейшую морфологическую диагностику инвазивного компонента опухоли [108, 133, 203].
Ультразвуковое исследование отечной молочной железы позволяет выявить опухолевую массу, которую не всегда удается визуализировать при выполнении рентгенологического исследования.
На ультразвуковом изображении ОИРМЖ наиболее часто представлен гетерогенной инфильтрацией паренхимы или, как объемное образование с утолщением кожи (диффузным или локальным) и отеком подкожно-жировой клетчатки [203]. Особенно хорошо утолщение кожи видно при использовании функции панорамирования. Опухолевая масса в молочной железе при выполнении УЗИ выявляется в 80% случаев [51].
При помощи УЗИ осуществляется выявление метастазов в регионарные лимфатические узлы, чувствительность метода составляет 93% [51]. Эти данные используются для планирования лечения [9, 40, 52, 198]. Кроме того, ультразвуковое исследование чрезвычайно полезно в оценке ответа на неоадъювантную химиотерапию метастатических регионарных лимфатических узлов [177]. Магнитно-резонансная томография МРТ с динамическим контрастным усилением, многоплоскостной метод визуализации. Данный метод является наиболее точным для обнаружения изменений паренхимы молочной железы при ОИРМЖ, в том числе и для оценки эффекта после проведения неоадъювантной химиотерапии [77, 76, 116, 169, 187]. Патологические изменения в отечной молочной железе при выполнении МРТ выявляются в 100% [132].
МРТ признаки ОИРМЖ включают диффузное утолщение кожи, увеличение объема молочной железы, отек и опухолевую массу или повышение плотности паренхимы. Опухоль в молочной железе при выполнении исследования выявляется у 97%, а утолщение кожи у 90-100% больных ОИРМЖ [49, 70, 186, 197]. Другие особенности заболевания, преимущественно связанные с воспалительным компонентом, такие как расширенные лимфатические протоки, отек молочной железы или грудной стенки, лучше всего визуализируются в Т2-взвешенных изображениях [134].
Позитронно-эмиссионная томография совмещенная с компьютерной томографией (ПЭТ/КТ) ПЭТ представляет собой молекулярный метод визуализации, который чувствителен к функциональным или метаболическим изменениям в тканях, а совмещение ПЭТ с компьютерной томографией позволяет топировать выявленные изменения.
Поскольку функциональные изменения предшествуют анатомическим изменениям, имеется возможность для раннего обнаружения жизнеспособной ткани опухоли через уровень метаболизма глюкозы, которая в ней выше, чем в окружающей нормальной ткани [105]. При ОИРМЖ, отсутствие клинически определяемой опухолевой массы делает ПЭТ/КТ еще более привлекательным для оценки ответа на проведенную терапию.
Несмотря на дороговизну, некоторые авторы предлагают включить ПЭТ/КТ в обязательный метод исследования на этапе начальной диагностики при подозрении на ОИРМЖ, так как данный метод позволяет определить локорегионарные и отдаленные метастазы [70]. Оценка местной распространенности процесса позволяет более точно планировать лучевую терапию [201].
Методы изучения молекулярно-биологических характеристик в группах сравнения
При макроскопическом исследовании послеоперационного материала больных ОИРМЖ опухолевая ткань была выявлена в 100%: 87,5 % (п=35) в виде опухолевого узла и 12,5% (п=5) в виде диффузного роста опухоли без четкого формирования узла. Размеры узла варьировали от 0,2 см до 10 см, средний размер узла - 2,8 см. Утолщение кожи описано у 85% (п=34) больных ОИРМЖ.
У больных в контрольной группе размер опухолевого узла был от 0,7 см до 10 см, в среднем - 3,1 см. Дефект кожи при макроскопическом исследовании отмечен у 3,3% (п=4) больных.
При гистологическом исследовании в подавляющем большинстве случаев в обеих группах был выявлен инфильтративный протоковый рак. В контрольной группе встречались редкие формы рака молочной железы. В основной группе на долю инфильтративного протокового рака приходилось 90% (п=36), а в контрольной 75% (п=60). Распределение в группах по гистологическим типам опухолей представлено на рисунке 6. Основная группа
Характеристика степени злокачественности опухолей у больных в группах была представлена следующими показателями: I степень злокачественности в основной группе 0%, в контрольной 2,5% (п=2); Пстепень злокачественности в основной группе 45% (п=18), в контрольной 70% (п=56); Шстепень злокачественности в основной группе 55% (п=22), в контрольной 27,5% (п=22) (рисунок 7).
Пациентам, у которых была проведена индукционная химиотерапия, при микроскопическом исследовании послеоперационного материала проводилась оценка степени лечебного патоморфоза (95% больных в основной группе и 43,75% в контрольной группе). У большинства больных в основной группе - 19 (50%) - зарегистрирована I степень лечебного патоморфоза. Пи III степени патоморфоза в основной группе зарегистрированы у 16 (42,1%) и у 3 (7,8%) больных соответственно. Патоморфоз IV степени не выявлен ни у одной больной ОИРМЖ. Одинаково часто имел место патоморфоз I и II степени у больных в контрольной группе - по 16 (42,1%) больных, III и IV степень патоморфоза была у 2 больных (5,7%) и у Ібольной (2,8%) соответственно.
Согласно классификации опухолей молочных желез ВОЗ от 2012 г. помимо особенной клинической картины ОИРМЖ характеризуется наличием множественных опухолевых эмболов в лимфатических сосудах кожи [128]. В нашем исследовании у больных в основной группе биопсия кожи на этапе установления диагноза не выполнялась ни в одном из случаев. При микроскопическом исследовании послеоперационного материала опухолевые эмболы в лимфатических сосудах кожи описаны у 27,5% (п=11) больных ОИРМЖ, в остальных случаях этот признак не изучался.
Метастатическое поражение регионарных лимфоузлов при гистологическом исследовании было выявлено у 100% больных в группах сравнения.
Нами изучена экспрессия рецепторов стероидных гормонов, HER2 (при уровне экспрессии 2+ и 3+ проводилась оценка амплификации гена HER2/neu) и ki-67 в опухолевой ткани у каждого больного в обеих группах. Методы проведения исследований приведены в разделах 2.4.2 и 2.4.5.
Экспрессию рецепторов стероидных гормонов оценивали, как положительную (РЭ+/РП+; РЭ+/РП-; РЭ-/РП+) и отрицательную (РЭ-РП-). Положительный гормональный статус был определен у 57,5% (п=23) больных основной группы и у 82,5% (п=66) контрольной, а отрицательный у 42,5% (п=17) и 17,5% (п=14) соответственно. Амплификация гена HER2/neu методом FISH выявлена у 55% (п=22) больных ОИРМЖ, в то время как, у больных в контрольной группе частота амплификации была меньше - 17,5 % (п=14).
Процентное количество ki-67 отражало пролиферативную активность опухолей. Показатель более 20% отражал высокую пролиферативную активность. У больных в основной и контрольной группе преобладал высокий уровень пролиферативной активности - 87,5% и 90% соответственно. Минимальное значение ki-67 в основной группе - 1%, а в контрольной - 5%. Максимальное значение ki-67 в основной группе - 60%, а в контрольной - 78%. Более подробная характеристика значений ki-67 представлена на рисунке 8.
Ретроспективно проанализирован операционный материал для каждого случая в обеих группах (образцы опухолевой ткани, фиксированные в 10% растворе формалина и залитые в парафин). Гистологические заключения давались в соответствии с гистологической классификацией опухолей молочной железы ВОЗ от 2012г [128]. В дальнейшем из парафиновых блоков с учетом планируемых методов исследования производилась подготовка материала.
Иммуногистохимическое исследование и флюоресцентная гибридизация in situ выполнялись на материале парафиновых срезов опухолей толщиной 3-5 мкм.
Для проведения полимеразной цепной реакции изготавливались множественные срезы с парафиновых блоков толщиной 10 мкм. Выделение ДНК из срезов с парафиновых блоков проводили в три этапа. На первом этапе проводили депарафинизацию материала О-ксилолом и поэтапную регидратацию этанолом. Вторым этапом проводилось депротеинизация материала при помощи протеиназы и инкубации в термостате в течение 48-72 часов при температуре 56С. На третьем этапе производилось выделение ДНК из депротеинизорованной ткани с помощью набора реагентов DNA Clean&Concentrator -5 (Epigenetics, USA) согласно инструкции.
Анализ соматических наследственных мутаций проводился по ДНК выделенной из крови пациентов, хранившейся в лаборатории цитогенетики и молекулярной биологии ФГБУ РНЦРР.
Анализ экспрессии рецепторов стероидных гормонов, экспрессии HER2, ki-67 в опухолевой ткани Для определения экспрессии рецепторов стероидных гормонов, экспрессии HER2, кі-67в опухолевой ткани срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали на иммуногистостейнере Bond-Max, Leica Microsystems. Визуализация антигенов осуществлялась проявочной системой - Bond Polymer Refine Detection, Leica Microsystems.
Для оценки экспрессии рецепторов стероидных гормонов использовались антитела к рецепторам эстрогена (РА0151, клон 6F11, Leica Microsystems), прогестерона (РА0312, клон 16, Leica Microsystems). Результаты иммуногистохимического исследования оценивали полуколичественным способом по рекомендациям D. Allredetal. в % и в баллах (максимум 8) [50]. Результат 1% ( Зх баллов) считался положительным.
Для определения экспрессии онкобелка HER2/neu использовались моноклональные мышиные антитела c-erbB-2 (А0485, Dako, Дания). Оценка экспрессии онкобелка HER2/neu выполнялась согласно рекомендациям А. Wolff et al. [200]. При проведении исследования определялись 4 типа экспрессии белка: 0 баллов (отрицательный результат), 1+ балл (слабое окрашивание мембраны), 2+ балла (промежуточная степень окрашивания мембраны) и 3+ балла (интенсивное окрашивание мембраны клеток -положительный результат).
Пролиферативная активность подсчитывалась в ядрах клеток инвазивного рака, при помощи оценки экспрессии Ki-67 согласно рекомендациям М. Dowsett et al. [89]. Использовались моноклональные мышиные антителаРА0118, клон ММ1, Leica Microsystems. Подсчет проводили на 1000 клеток на цифровых микрофотографиях с помощью морфометрической программы, с последующим выражением результата в процентах. Индекс мечения маркера 20 % считали проявлением низкой, а 20 % высокой пролиферативной активности.
Возрастные характеристики больных отечно-инфильтративной формой рака молочной железы на момент установления диагноза
Применение ДНК-микрочипов для определения особенностей экспрессии генов позволило ученым выделить молекулярно-биологические подтипы РМЖ отличающиеся не только по биологическим параметрам, но и по прогнозу и ответу на проводимое лечение [158]. Важно отметить, что из-за ограничения доступности использования технологии микрочипирования в клинической практике для определения подтипов РМЖ используется их «суррогатное» определение по иммуногистохимическим маркерам. Выделяют люминальные A (LA) и Б (LB) опухоли с экспрессией рецепторов стероидных гормонов, HER2 позитивные опухоли (HER2+) и неоднородную группу тройного негативного рака (TNBC) без экспрессии стероидных гормонов и HER2, включающую в себя базально-подобный рак и неклассифицированные типы. Самым часто встречающимся и прогностически благоприятным подтипом РМЖ является люминальный. LAHLB ПОДТИПЫ отличаются друг от друга по уровню экспрессии ki-67 (при LAki-67 14%). HER2+ подтип встречается до 20% случаев и характеризуется более низкими показателями выживаемости по сравнению с люминальными HER2- подтипами, следует отметить, что показатели прогноза у этой группы пациентов стали значительно улучшаться с началом применения трастузумаба. TNBC при РМЖ встречается до 20% случаев и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом.
В настоящее время определение молекулярно-биологического подтипа играет важную роль в планировании лечения.
С целью определения закономерностей влияния молекулярно биологических подтипов опухоли при ОИРМЖ на отдаленные результаты лечения мы разделили все случаи в основной и контрольной группах на LA, LB,HER2+ и TNBC подтипы, используя их суррогатное определение. В группе ОИРМЖ более чем в половине случаев встречался HER2+ подтип (57,5%), второе место занимал LB подтип (25%), TNBC подтип был на третьем месте (17,5%). Иная ситуация была в контрольной группе, так превалирующим оказался LB подтип (65%), практически равные позиции занимали HER2+ (17,5%) и TNBC (13,75%) подтипы. Распределение больных в группах в зависимости от молекулярно-биологических подтипов представлено в таблице 15.
По причине отсутствия LA подтипа в основной группе и редкой встречаемостью в контрольной (п=3), он был исключен из дальнейшего анализа выживаемости.
В нашем исследовании в группе ОИРМЖ не выявлено различий показателей ОВ в зависимости от молекулярно-биологического подтипа опухоли (при попарных сравнениях р 0,05). Медиана выживаемости у больных с LB подтипом составляла 5,2 лет, с HER2+ подтипом - 3,6 лет, а с TNBC - 2,4 года. В контрольной группе так же, как и в основной статистически значимых различий в ОВ не выявлено (при попарных сравнениях р 0,05), медиана при LB подтипе - 10,5 лет, при HER2+ подтипе - не достигнута (малое количество наблюдений), при TNBC подтипе - 5,9 лет. Графики ОВ в группах в зависимости от молекулярно-биологического подтипа опухоли представлены на рисунке 21. Общая кумулятивная выживаемость Основная группа
Безрецидивная выживаемость в основной и контрольной группе в зависимости от молекулярно-биологического подтипа опухоли. По результатам проведенного анализа видно, что в группе ОИРМЖ значительно преобладал HER2+ подтип опухоли, что с учетом общепринятых представлений об агрессивности данного подтипа должно было ухудшить показатели выживаемости в рамках группы у этих больных, однако достоверных отличий нами не выявлено. Схожая ситуация в контрольной группе, несмотря на преобладающее количество больных с прогностически благоприятным LB подтипом, их выживаемость в целом не отличалась от больных с другими подтипами. Отсутствие отличий отдаленных результатов лечения в обеих группах по разным молекулярно-биологическим подтипам по всей видимости не случайно и говорит о внутренней гетерогенности последних, в основе которой лежит множество биологических механизмов, которые еще предстоит определить. Таким образом, очевидной является актуальность дальнейшего поиска новых маркеров при РМЖ, которые позволят улучшить эффективность назначаемых химиотерапевтических схем и определят возможности для разработки новых противоопухолевых лекарственных средств.
Влияние возрастных характеристик, ожирения и репродуктивного статуса на показатели выживаемости у больных отечно инфильтративной формой рака молочной железы Как уже неоднократно отмечено молодые больные имеют больший риск заболеть ОИРМЖ. Схожие данные мы имеем и в отношении повышенного ИМТ. Однако, ранее не проводились исследования по изучению влияния молодого возраста больных, повышенного ИМТ, а так же репродуктивного статуса на показатели общей и безрецидивной выживаемости при ОИРМЖ.
Верхняя граница молодого возраста в нашем исследовании была ограничена 50 годами, это граница определена относительно среднего возраста начала менопаузы. В основной группе в возрасте до 50 лет было 42,5% больных, а в контрольной - 32,5%. При анализе ОВ И БРВ не установлено статистически значимых отличий этих показателей у больных моложе и старше 50 лет в основной и контрольной группе. Медиана ОВ больных ОИРМЖ в возрасте до 50 лет составляла 3,3 года, а после 50 лет -3,6 года (р=0,9), в контрольной группе эти показатели составляли 6 и 7 лет соответственно (р=0,9). Медиана БРВ в основной группе у больных до 50 лет составляла 2,2 года, у больных после 50 лет возраст медианы БРВ был такой же, как и у больных до 50 лет (р=0,8). В контрольной группе показатели БРВ были следующие: у больных до 50 лет медиана БРВ не достигнута, у больных после 50 лет медиана БРВ составляла 7,8 лет (р=0,09). В таблице 17 представлены показатели 3-летней и 5-летней выживаемости в зависимости от возрастных характеристик. В виду отсутствия отличий графики выживаемости не представлены.
В группе ОИРМЖ преобладали больные с ожирением (65%), в контрольной группе избыточный ИМТ был у 36,3% больных. Следует отметить, что в основной группе лишь у 4 человек показатели ИМТ находились в пределах нормы, в связи с чем, нами проанализированы показатели ОВ и БРВ у больных с ИМТ 30 и с ИМТ 30, по этим же параметрам производился анализ и в контрольной группе. Медиана ОВ в основной группе у больных с ИМТ 30 составила 3,1 года, а с ИМТ 30 3,6 года (р=0,9). В контрольной группе медиана ОВ больных с ИМТ 30 составила 7 лет, а с ИМТ 30 9,1 лет (р=0,5). У больных ОИРМЖ медиана БРВ с ИМТ 30 была 5,2 лет, а с ИМТ 30 - 7 лет (р=0,9), в контрольной группе медиана БРВ с ИМТ 30 не достигнута, а с ИМТ 30 медиана БРВ составляла 7,8 лет (р=0,9). Таким образом, по результатам статистического анализа нами не установлено влияния избыточного ИМТ на показатели общей и безрецидивной выживаемости у больных ОИРМЖ и неотечными местно-распространенными формами РМЖ (в связи с отсутствием отличий графики выживаемости не представлены).
Менопаузальный статус не влиял на показатели ОВ и БРВ в основной и контрольной группах. В основной группе в менопаузе находились 22 женщины (55%), а в контрольной 46 (57,5%). Медина ОВ у больных основной группы с менопаузой составила 3,6 лет, а у больных репродуктивного возраста - 3,3 года (р=0,9), медианы БРВ составляли 2,2 и 2,1 года соответственно (р=0,5). В контрольной группе медиана ОВ у больных с менопаузой составила 7 лет, без менопаузы - 8,5 лет (0,7). Медиана БРВ у больных в менопаузе для контрольной группы не достигнута, а у больных репродуктивного возраста она составила 7,8 лет (р=0,9). В связи с отсутствием отличий графики выживаемости не представлены.
Собственные результаты молекулярно-генетических исследований
При сравнении молекулярно-биологических характеристик опухолей в группах установлено, что при ОИРМЖ в отличие от других форм местно-распространенного РМЖ значительно чаще встречаются опухоли с высокой степенью злокачественности (р=0,006), отрицательным рецепторным статусом (р=0,006) и положительным HER2neu статусом (р=0,000). По классификации молекулярно-биологических подтипов в группе ОИРМЖ значительно преобладал HER2+ подтип, который составлял 57,5% случаев, в контрольной группе преобладал LB подтип и составлял 65% случаев.
Считается, что рационализация лечения РМЖ зависит от его индивидуализации, которая находится в тесной связи с молекулярно-биологическими факторами прогноза течения заболевания. В нашем исследовании мы предприняли попытку определить достаточно ли использование общепринятых факторов прогноза для терапевтического планирования у больных ОРИМЖ.
Установлено, что при ОИРМЖ и неотечных формах местно-распространенного РМЖ гистологический тип опухоли не влияет на показатели общей и безрецидивной выживаемости, вероятно, полученные результаты связаны с тем, что ОИРМЖ не является отдельной гистологической формой рака молочной железы, и соответственно прогнозы по данной категории являются схожими с прогнозами для неотечных форм РМЖ.
При анализе зависимости клинических исходов от степени злокачественности опухоли статистически значимых различий в группах не выявлено. Однако несмотря на отсутствие статистически значимых различий (р=0,1 для ОВ и р=0,3 для БРВ), в группе ОИРМЖ выявлена тенденция к увеличению ОВ и БРВ у больных с высокой степенью злокачественности опухоли. Медиана OB в случаях с высокой степенью злокачественности составила 5 лет, в то время как в случаях со средней степенью злокачественности она составляла 2,5 года. При анализе БРВ отмечено ее улучшение для высокой степени злокачественности после 2 х летнего срока наблюдения. Вероятно, данная тенденция наметилась в связи с большей эффективностью системной химиотерапии в случаях опухолей с высокой митотической активностью опухолевых клеток.
Единственным маркером, который оказывал статистически значимое влияние на показатели ОВ и БРВ у больных ОИРМЖ являлся рецепторный статус опухоли. В контрольной группе данных закономерностей не выявлено. Показатели прогноза были лучше у больных с рецепторположительным статусом: медиана ОВ при рецепторположительном статусе составила 3,5 года, а при рецепторотрицательном статусе - 2,5 года (р=0,001); медиана БРВ при рецепторположительном статусе составила 2,5 года, при рецепторотрицательном статусе - 1,3 года (р=0,006).
При анализе клинических исходов в зависимости от HER2/neucTaryca не выявлено статистически значимых отличий в показателях ОВ и БРВ в зависимости от HER2/neu статуса опухоли в основной (р=0,5 для ОВ и р=0,8 для БРВ) и контрольной группе (р=0,9 для ОВ и р=0,8 для БРВ). Однако следует отметить, что в группе ОИРМЖ имелась тенденция к увеличению показателей ОВ при HER2/neu «+» статусе опухоли: медиана выживаемости при HER2/neu «+» составляла 3,6 года, а при HER2/neu «-» - 2,4 года. По всей данная тенденция была связана с применением трастузумаба (применялся у 13 больных).
У 91% больных в исследовании был высокий уровень экспрессии ki 67( 20%), В СВЯЗИ С чем нами проведен анализ влияния увеличения значений ki-67 на клинические исходы. Для осуществления поставленной задачи больные в группах разделены на две подгруппы, в зависимости от значения медианы ki-67, которая составляла 30%.По результатам анализа не выявлено влияния увеличения значений кі-67на общую и безрецидинвую выживаемость у больных местно-распространенным РМЖ. Таким образом, высокий уровень пролиферативной активности сам по себе является неблагоприятным прогностическим фактором, однако, увеличение его значений у больных местно-распространенными формами РМЖ, в том числе ОИРМЖ, влияния на прогноз не имеет.
Как известно, определение молекулярно-биологического подтипа опухоли играет важную роль в планировании лечения. В нашем исследовании в группах сравнения не выявлено статистически значимых различий показателей ОВ и БРВ в зависимости от молекулярно-биологического подтипа опухоли, при том, что в группе ОИРМЖ преобладал прогностически неблагоприятный HER2+ подтип, а в контрольной благоприятный LB подтип. Данный результат указывает на молекулярную гетерогенность опухолей при местно-распространенном РМЖ и недостаточность использования суррогатных маркеров для терапевтического планирования.
При анализе зависимости клинических исходов от возрастных характеристик и веса больных в группах сравнения значимых закономерностей не выявлено.
В рамках нашего исследования были изучены возможности выявления специфических молекулярно-биологических маркеров ОИРМЖ. Для определения транслокаций с участием гена ALK в образцах опухолей мы применяли метод флуоресцентной гибридизации in situ. Для поиска соматических мутаций в генах ALK, РІСЗСА, АКТІ и определения наследственных мутаций использовался метод ПЦР с последующим двусторонним секвенированием ПЦР-продукта по Сэнгеру.
В настоящее время активно изучается значение гена ALK при ОИРМЖ. По мере изучения исследователи получают различные данные. Так одни ученые обозначают активацию гена, как общую черту при ОИРМЖ, другие говорят о редкой частоте встречаемости данного события. С учетом имеющихся данных актуальным является вопрос изучения роли активации гена ALK в патогенезе ОИРМЖ. В нашем исследовании изучение частоты транслокаций в гене ALK проведено для 40 случаев ОИРМЖ и для всех 80 случаев в контрольной группе. В группе ОИРМЖ у 5% (п=2) больных была выявлена транслокация EML4-ALK, в контрольной группе ни в одном из случаев перестройки в гене ALK не выявлены(р=0,045). Таким образом, с учетом статистической значимости полученных отличий в группах можно судить о том, что транслокация EML4-ALK является одной из характеристик молекулярного профиля ОИМРЖ. Несмотря на редкость встречающейся транслокации больные с ОИРМЖ при ее наличии, являются кандидатами для проведения молекулярно-направленной терапии ALK ингибиторами. Параллельно с поиском транслокаций в гене ALK нами проводилось изучение частоты встречаемости амплификации данного гена и мутаций в тирозинкиназном домене гена у больных ОИРМЖ и в контрольной группе. Ни в одном из наблюдений в обеих группах данные события нами не обнаружены.
Активация АКТ-каскада является частым механизмом онкогенеза при широком круге злокачественных опухолей, включая рак молочной железы и ассоциирована с изначальной и приобретенной резистентностью к антиэстрогенам и ингибиторам рецепторных тирозикиназ, и с потенциальной чувствительностью к ингибиторам mTOR. Специальных исследований роли АКТ-каскада при ОИРМЖ до сих пор не проводилось. В нашей работе качество выделенной ДНК позволило изучить мутации в генах PIK3CA и АКТІ у 37 больных ОИРМЖ и у 37 больных контрольной группы. У 21% (п=8) больных ОИРМЖ были выявлены мутации в гене РІКЗСА, из них у 62,5% (п=5) была выявлена мутация в 9 экзоне гена (Glu545Lys (с. 1633 G A)) и у 37,5% (п=3) - в 20 экзоне (Hisl047Arg (с. 3140 A G)). В контрольной группе мутации в РІКЗСА выявлены у 27% (п=10), из них у 10% (п=1) мутация локализовалась в 9 экзоне (Glu545Lys (с. 1633 G A)) и у 90% (п=9) в 20 экзоне (в 7 образцах - Hisl047Arg (с. 3140 A G), в 2 образцах Hisl047Leu (с. 3140 С Т)). Из полученных результатов следует, что частота встречаемости мутаций в PIK3CA в группах не имела отличий (р=0,59), однако в группе ОИРМЖ значительно чаще мутация в гене PIK3CA локализовалась в 9 экзоне (р=0,038), а в контрольной группе в 20 экзоне (р=0,023).При анализе выживаемости больных ОИРМЖ нами получены данные о значительном ее ухудшении в данной группе при сравнении с контрольной, вероятно одним из факторов обуславливающих агрессивное течение ОИРМЖ была мутация в 9 экзоне гена PIK3CA. Полученные нами результаты ассоциируются с данными литературы о том, что мутации в 9 экзоне PIK3CA связаны с ранним прогрессированием заболевания и снижением ОВ больных, а мутации в 20 экзоне гена были связаны с благоприятными исходами. К сожалению, в рамках нашего исследования не представляется возможным провести подробный сравнительный анализ выживаемости у больных с мутациями в 9 и 20 экзонах гена PIK3CA из-за небольшого количества наблюдений, однако актуальность продолжения работ в данном направлении нами определена. Результаты поиска мутаций в гене PIK3CA определенно имеют свое значение для расширения показаний к молекулярно-направленной терапии не только у больных ОИРМЖ, но и во всей группе местно-распространенных форм РМЖ.
Поиск мутаций в гене АКТІ производился в 4 экзоне. В группе ОИРМЖ ни в одном из образцов опухолевой ткани мутация в гене АКТІ не выявлена, в контрольной группе мутация Glul7Lys (с. 49 G A) была выявлена для 5,4% образцов (п=2), отличия статистически не значимы (Р=0Д54).