Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Основные представления об эпидемиологии, диагностике и лечении рака яичников 10
1.2. Компоненты системы инсулиноподобных факторов роста как факторы прогноза и мишени молекулярно-направленной терапии рака яичников 14
1.3. Заключение 30
Глава II. Материалы и методы 31
2.1. Характеристика больных новообразованиями яичников 31
2.1.1. Характеристика больных доброкачественными новообразованиями яичников 31
2.1.2. Характеристика больных пограничными опухолями яичников 33
2.1.3. Характеристика больных злокачественными опухолями яичников 35
2.2. Биохимические исследования 40
2.2.1. Получение и обработка материала 40
2.2.2. Иммуноферментные исследования 40
2.3. Статистический анализ 43
Глава 3. Результаты и их обсуждение 45
3.1. Содержание инсулиноподобных факторов роста и ИФР-связывающих
белков в опухолях больных различными новообразованиями яичников 45
3.1.1. Сравнение содержания ИФР и ИФРСБ в доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолях яичников 45
3.1.2. Взаимосвязь экспрессии ИФР и ИФРСБ с клинико-морфологическими особенностями рака яичников
3.1.2.1. Взаимосвязь с возрастом и состоянием репродуктивной функции пациенток 48
3.1.2.2. Взаимосвязь со стадией заболевания (FIGO) и отдельными показателями распространенности рака яичников 50
3.1.2.3. Взаимосвязь с гистологическим строением и степенью дифференцировки рака яичников 56
3.1.3. Заключение 58
3.2. Содержание инсулиноподобных факторов роста и ИФР-связывающих белков в сыворотке крови больных новообразованиями яичников 58
3.2.1. Сравнение содержания ИФР и ИФРСБ в сыворотке крови больных доброкачественными, пограничными и злокачественными опухолями яичников и контрольной группы 58
3.2.2. Взаимосвязь показателей содержания ИФР и ИФР-связывающих белков в сыворотке крови больных различными новообразованиями яичников 61
3.2.3. Анализ диагностической значимости определения содержания ИФР и ИФР-связывающих белков в сыворотке крови больных новообразованиями яичников
3.2.3.1. Анализ чувствительности при пороговых уровнях, соответствующих 95% доверительному интервалу 63
3.2.3.2. Выбор оптимальных пороговых уровней на основе построения кривых ROC 66
3.2.3.3. Оценка диагностической значимости комплекса тестов (ИФР-I, ИФРСБ-2 и ИФРСБ-1) при различных новообразованиях яичников и опухолях других локализаций 69
3.2.3.4. Многофакторный анализ диагностической значимости исследования компонентов системы ИФР в сыворотке
крови больных новообразованиями яичников 73
3.2.4. Взаимосвязь содержания инсулиноподобных факторов роста и ИФР-связывающих белков в сыворотке крови с клинико морфологическими особенностями рака яичников 76
3.2.4.1. Взаимосвязь с возрастом и состоянием
репродуктивной функции пациенток 77
3.2.4.2. Взаимосвязь со стадией заболевания (FIGO) 79
3.2.4.3. Взаимосвязь с основными показателями распространенности рака яичников 82
3.2.4.4. Взаимосвязь с гистологическим строением и степенью дифференцировки рака яичников 88
3.2.4.5. Взаимосвязь концентраций исследуемых маркеров в сыворотке крови с уровнем СА-125 90
3.2.5. Заключение 91
3.3. Содержание ИФР и ИФРСБ в асцитической жидкости 92
3.4. Выживаемость больных раком яичников в зависимости от содержания ИФР и ИФРСБ в сыворотке крови и опухолях 94
3.4.1. Взаимосвязь общей выживаемости с уровнем ИФР и ИФРСБ в сыворотке крови 95
3.4.2. Взаимосвязь общей выживаемости больных раком яичников с содержанием ИФР и ИФРСБ в опухолях 102
3.4.3. Многофакторный анализ 105
Глава 4. Заключение 107
Выводы 117
Список основных сокращений 119
Список литературы 120
- Компоненты системы инсулиноподобных факторов роста как факторы прогноза и мишени молекулярно-направленной терапии рака яичников
- Характеристика больных злокачественными опухолями яичников
- Взаимосвязь экспрессии ИФР и ИФРСБ с клинико-морфологическими особенностями рака яичников
- Взаимосвязь концентраций исследуемых маркеров в сыворотке крови с уровнем СА-125
Компоненты системы инсулиноподобных факторов роста как факторы прогноза и мишени молекулярно-направленной терапии рака яичников
Рак яичников (РЯ) – одно из наиболее распространенных и неблагоприятно протекающих заболеваний женщин, лидирующее по числу смертельных случаев среди новообразований женских половых органов. Злокачественные опухоли яичников составляют 35% в структуре онкологической заболеваемости женщин, стабильно занимая третье место после рака тела и шейки матки [5].
Средняя 5-летняя выживаемость больных раком яичников составляет 40-50% [53, 63, 98]. В Европе 1, 3, 5-летняя выживаемость составляет 66%, 45% и 37% соответственно [29], при этом 5-летняя выживаемость заметно снижается с возрастом, составляя около 70% у молодых ( 45 лет) и порядка 20% у пожилых (45-99 лет) пациенток [98].
Большую часть (90-95%) всех новообразований яичников составляют эпителиальные опухоли, которые включают в себя доброкачественные, пограничные и злокачественные. В структуре эпителиальных злокачественных опухолей яичников 60-72% приходится на долю серозных раков, на муцинозные и эндометрио-идные – примерно по 10%, светлоклеточные опухоли составляют 2-4%, переход-ноклеточные – 0,1-1,5%, недифференцированные раки – 0,5-1%. Неэпителиальные опухоли встречаются достаточно редко: опухоли стромы полового тяжа составляют примерно 8% от всех первичных опухолей яичников, а на долю герминоген-ных опухолей приходится 2-3% [6, 7].
Необычайная мозаичность микроскопической структуры новообразований яичников, многообразие их сочетаний, нечеткие границы между опухолями разной степени дифференцировки существенно усложняют диагностический процесс.
На начальных этапах заболевания рак яичников не имеет патогномоничных клинических симптомов. Боли возникают уже при значительных размерах опухолей, и даже при наличии диссеминации процесса по брюшной полости клиника заболевания имеет «стертый» характер, выражающийся в «дискомфорте» со сто 11 роны желудочно-кишечного тракта, увеличении живота в объеме за счет асцита и новообразования, диспепсии, похудании, одышке при наличии метастатического плеврита. Почти у 70% больных РЯ к моменту установления диагноза имеется III или IV стадия заболевания, тогда как у пациенток с неэпителиальными опухолями яичников (стромальноклеточными, герминогенными) в 70% случаев определяется – I стадия заболевания. В отличие от эпителиальных опухолей яичников гермино-генные опухоли имеют солидное строение, поэтому болевые ощущения возникают на более ранних стадиях развития опухоли из-за натяжения подвешивающей связки яичника или её перекрута.
Большинство гранулезоклеточных опухолей продуцируют эстрогены, что обуславливает яркую клиническую картину: у женщин репродуктивного возраста отмечается нарушения менструального цикла: гиперполименорея, аменорея, аменорея с последующими ациклическими кровянистыми выделениями [7].
Опухоли, развивающиеся из стромы полового тяжа, также часто являются гормонопродуцирующими, и симптомы заболевания могут проявиться в виде гиперпродукции эстрогенов или андрогенов [14].
В диагностике опухолей яичников используют следующие методы обследования: бимануальное гинекологическое исследование, ультразвуковую томографию органов малого таза и брюшной полости (УЗИ), компьютерную томографию (КТ) и магнитно-резонансную томографию (МРТ) органов брюшной полости и малого таза, позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), рентгенографию легких, определение уровня опухолевых маркеров, цитологическое исследование асцитической жидкости, а также лапароскопию. Для дифференциальной диагностики первичных опухолей яичников и метастатических опухолей желудочно-кишечного тракта, а также молочной железы применяют колоноскопию, гастроскопию и маммографию.
У больных с асцитом о характере заболевания можно судить по данным цитологического исследования пунктата асцитической жидкости. Рентгенография грудной клетки является обязательным компонентом обследования при подозрении на опухоль яичников, так как позволяет диагностировать возможное метаста-зирование в легкие и наличие плеврита. Одним из наиболее интересных и перспективных направлений в диагностике и мониторинге злокачественных опухолей является определение опухолевых маркеров. Несмотря на кажущееся обилие опухолевых маркеров, практически единственным надежным тестом при раке яичников, причем в основном при его серозной форме, является определение СА-125. Повышение этого маркера отмечено у 85% первичных больных [8, 113].
Данный опухолевый маркер представляет собой гликопротеиновый антиген, вырабатываемый клетками серозных злокачественных опухолей яичников и определяемый с помощью моноклональных антител. Впервые он был описан в 1981 г. Bast и соавт. [23]. СА-125 не является строго специфичным только для рака яичника, он может быть повышен при других локализациях опухолей серозно-папиллярного строения, а также при циррозе печени, остром панкреатите, эн-дометриозе, миоме матки, беременности. Только у 50-60% больных с I стадией рака яичников выявляется повышение уровня СА-125 [90]. Чем выше стадия заболевания, тем выше средние показатели СА-125. Определение уровня СА-125 является стандартом в обследовании женщин при обнаружении опухолевых масс в малом тазу.
Около 20% злокачественных эпителиальных опухолей яичников не экспрес-сируют или незначительно экспрессируют СА-125, поэтому использование комбинации СА-125 с другими опухолевыми маркерами повышают специфичность и чувствительность теста [22, 89, 103].
Повышение уровня СА-125 может возникать задолго до манифестации заболевания, что делает данную методику многообещающей в скрининге рака яичников. Однако возможность получения ложноположительных результатов среди здорового контингента обследуемых не позволяет использовать СА-125, как единственный опухолевый маркер для скрининговых программ с целью раннего выявления рака яичников. Намного большее значение приобретает определение уровня СА-125 в динамике лечения рака яичников и в дальнейшем мониторинге за больными для выявления рецидивов заболевания.
Характеристика больных злокачественными опухолями яичников
Содержание исследуемых белков определяли в экстрактах опухолей яичников, сыворотке крови, полученной по стандартной методике до операции, асцити-ческой жидкости, полученной после центрифугирования асцита со скоростью 3000 об/мин, 4С в течение 15 мин (центрифуга РС-6, Россия). Сыворотку и асци-тическую жидкость разливали по 300-400 мкл в 3-4 пластиковые пробирки и хранили при -70С до проведения анализа.
Образцы опухолей для исследования брали во время операции: кусочки тканей (200-500 мг) доставляли на льду в лабораторию и хранили при -70С до начала обработки. Перед гомогенизацией ткань тщательно очищали от участков жира и некроза, взвешивали, а затем измельчали ножницами и растирали в жидком азоте.
Для проведения имму но ферментного анализа гомогенаты лизировали в соотношении 1:3 в буфере следующего состава: 20 мМ Трис-НСl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ - глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Полученные лизаты центрифугировали в течение 30 мин со скоростью 20000 об/мин, 4С (центрифуга Optima TLX, Beckman, США). Надосадочную жидкость (ядер-но-цитоплазматический экстракт) разделяли на аликвоты по 300-400 мкл и хранили при -70С до проведения иммуноферментного анализа.
Определение проводили с помощью стандартных наборов для прямого им-муноферментного анализа (табл. 2.11) в соответствии с инструкциями производителей. Т абли ца 2 .1 1 – Наборы реактивов для иммуноферментного анализа, использованные в работе № Показатель Название набора Производитель 1 Белок 1 типа, связывающий инсулиноподобный фактор роста (ИФРСБ-1) «IGFBP-1- ELISA» Mediagnost, Германия 2 Белок 2 типа, связывающий инсулиноподобный фактор роста (ИФРСБ-2) «IGFBP-2- ELISA» Mediagnost, Германия 3 Белок 3 типа, связывающий инсулиноподобный фактор роста (ИФРСБ-3) «IGFBP-3- ELISA» Mediagnost, Германия 4 Инсулиноподобный фактор роста I типа (ИФР-I) «IGF-I-ELISA» Mediagnost, Германия 5 Инсулиноподобный фактор роста II типа (ИФР-II) «IGF-II-ELISA» Mediagnost, Германия Принцип методов: Все использованные наборы реагентов представляют собой классические тест-системы «сэндвичевого» типа для прямого иммуноферментного определения концентрации исследуемых белков. Определение содержания исследуемых белков На первом этапе реакции происходит связывание определяемого белка со специфическими антителами, адсорбированными на поверхности лунок микропланшет. Экстракты опухолей добавляли в плашки без разведения, за исключением исследования ИФРСБ-2, где проводили 3-кратное разведение. Асцитическую жидкость разводили так же, как сыворотку крови. Перед внесением в лунки образцы разводили буферами, поставляемыми в составе соответствующих наборов, следующим образом: Т абли ца 2 .1 2 – Разведение сыворотки крови Исследуемые белки Разведение сыворотки
После первой инкубации и отмывки лунок моющим раствором (раствор готовился двадцатикратным разведение концентрированного промывочного буфера (Wash Buffer – WB) добавляли второе специфическое антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, которая в дальнейшем будет осуществлять цветную реакцию, необходимую для детекции.
После повторной инкубации и отмывки плашек добавляли цветной реагент – стабилизированный тетраметилбензидин с перекисью водорода. Инкубировали пробы в темноте в течение 30 мин и останавливали реакцию, добавляя стоп-реагент (2 н. H2SO4). Измеряли оптическую плотность при 450 нм с коррекцией при 540 нм на автоматическом анализаторе для микропланшет BEP 2000, используя двух- и четырехпараметрические методы построения кривых для обработки данных.
Выбор статистических оценок уровней биохимических маркеров, определенных в сыворотке крови и ткани опухоли, осуществляли после сравнения с распределением Гаусса по методу Колмогорова-Смирнова. Поскольку в большинстве случаев распределение исследованных показателей отличалось от нормального, то в качестве центральной меры применяли медиану, в качестве мер разброса указывали квартили и пределы колебаний. При сопоставлении показателей использовали непараметрические критерии: Манна-Уитни при сравнении двух независимых подгрупп, медианный тест или тест Краскелла-Уоллиса при сравнении нескольких подгрупп. При анализе взаимосвязей между различными показателями применяли тест корреляции рангов Спирмена, указывали коэффициент корреляции (R) и его достоверность. Различия и корреляции считали значимыми при р 0,05. Выживаемость больных оценивали методом Каплана-Мейера (при сравнении кривых использовали F-тест Кокса), использовали также регрессионную многофакторную модель Кокса. Проведен также многофакторный дискриминантный анализ с построением «дерева принятия решений».
Если не указано другое, то во всех таблицах представлены показатели медианы и верхнего и нижнего квартилей. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программных пакетов «Statistica 7.0» (StatSoft Inc) и SPSS.
Взаимосвязь экспрессии ИФР и ИФРСБ с клинико-морфологическими особенностями рака яичников
В практическом плане важен вопрос о том, в какой мере изменение продукции регуляторных белков в опухолевой ткани отражается на их концентрации в периферической крови, т.к. при наличии корреляционных связей между этими показателями появляется возможность относительно неинвазивной оценки состояния и активности исследуемой сигнальной системы в опухоли, что может быть важно для назначения молекулярно-направленной (таргетной) терапии. Кроме того, компоненты системы ИФР представляют собой потенциальные диагностические и/или прогностические серологические маркеры рака яичников.
Мы определили содержание всех исследуемых маркеров в сыворотке крови больных различными новообразованиями яичников, полученной до операции, а также в сыворотке крови практически здоровых женщин группы контроля (табл. 3.11). : все различия статистически незначимы (p 0,05). Обнаружено высокодостоверное снижение медианного уровня ИФР-I в сыворотке крови больных раком яичников как относительно контроля, так и относительно показателей больных доброкачественными и пограничными опухолями яичников.
Уровни ИФР-II, ИФРСБ-1 и ИФРСБ-2 в сыворотке крови больных раком яичников были достоверно выше, чем в контрольной группе, при этом уровни ИФРСБ-1 и ИФРСБ-2 у больных раком были также достоверно выше, чем у больных доброкачественными и пограничными опухолями. Для ИФРСБ-3 никаких достоверных различий и значимых тенденций не обнаружено. Представленные в литературе данные об изменении уровней ИФР и/или ИФРСБ в сыворотке крови больных раком яичников достаточно противоречивы, однако, в целом, выявленные нами нарушения совпадают с данными других исследователей (см. табл. 1.3).
Таким образом, выявлено четыре потенциальных серологических маркера, заслуживающих дополнительного анализа. По результатам первичного анализа, степень их значимости можно расположить следующим образом: ИФРСБ-2 ИФРСБ-1 ИФР-II ИФР-I. Такая оценка основана на том, что уровень ИФРСБ-2 в сыворотке крови больных раком отличается не только от контроля, но и от показателей больных доброкачественными и пограничными опухолями, ИФРСБ-1 – только от контроля и группы больных доброкачественными новообразованиями, ИФР-II – только от показателей контроля. Потенциальная значимость ИФР-I для диагностики и последующего мониторинга рака яичников вообще ограничена тем, что его уровень в сыворотке крови больных раком яичников не повышается, а снижается. Следовательно, изменения уровня этого маркера в сыворотке крови не связаны с его продукцией опухолевыми клетками, а отражают общие изменения метаболизма на фоне такого тяжелого заболевания, как рак яичников.
Тем не менее, далее мы подробно проанализируем диагностическую чувствительность и специфичность всех выявленных потенциальных маркеров. 3.2.2. Взаимосвязь показателей содержания ИФР и ИФР-связывающих белков в сыворотке крови больных различными новообразованиями яичников Мы проанализировали корреляционные взаимосвязи исследованных компонентов системы ИФР в сыворотке крови женщин контрольной группы, а также больных различными новообразованиями яичников (табл. 3.12).
Как следует из таблицы 3.12, единственная достоверная положительная взаимосвязь в группе контроля наблюдается между сывороточными уровнями ИФР-II и ИФРСБ-3. В группе больных доброкачественными опухолями никаких достоверных корреляционных связей между показателями сыворотки крови не обнаружено. В то же время у больных пограничными опухолями и раком яичников выявлены высоко достоверные отрицательные корреляции между уровнями ИФР-I и ИФРСБ-1, а также ИФР-I и ИФРСБ-2, а также положительная взаимосвязь между уровнями ИФРСБ-1 и ИФРСБ-2. Дополнительно, только в группе больных раком выявлены более слабые, но достоверные отрицательные корреляции между уровнями ИФР-II и ИФРСБ-2, ИФР-II и ИФРСБ-3, а также положительная – между уровнями ИФР-I и ИФРСБ-3.
Таким образом, характер взаимосвязей между сыворотчными уровнями ИФР и ИФРСБ существенно меняется на фоне развития различных новообразований яичников, и взаимосвязь различных компонентов системы ИФР в злокачественных новообразованиях значительно усиливается.
Как уже отмечено, одной из важных задач при исследовании уровня биологических маркеров в сыворотке онкологических больных является оценка того, в какой степени показатели периферической крови отражают уровни экспрессии соответствующих белков в опухолевой ткани. Для решения этого вопроса мы проанализировали корреляционные взаимосвязи исследуемых показателей во всей группе и у больных различными новообразованиями яичников. Достоверной корреляции сывороточной и внутриопухолевой концентрации ни для одного из маркеров не обнаружено, это свидетельствует в пользу неопухолевого происхождения большей части соответствующих белков, циркулирующих в периферической крови.
Взаимосвязь концентраций исследуемых маркеров в сыворотке крови с уровнем СА-125
Действительно, достоверных различий уровней изученных маркеров в сыворотке крови не обнаружено, однако можно отметить некоторые интересные тенденции (табл. 3.27). Так, при муцинозных раках не отмечено выраженных изменений ни для одного из диагностически значимых маркеров: уровни ИФР-I, ИФРСБ-1 и даже ИФРСБ-2 практически соответствовали показателям группы контроля. Повышение сывороточного уровня ИФРСБ-2 у больных серозными аденокарциномами было менее выражено, чем у больных эндометриоидным или «смешанным» раком. Наконец, для злокачественных опухолей яичников неэпителиального типа был характерен высокий уровень ИФР-I, ИФР-II, относительно небольшое повышение уровней ИФРСБ-2 и ИФРСБ-1 и заметно повышенный уровень ИФРСБ-3 в сыворотке крови пациенток. Достоверной взаимосвязи сывороточных концентраций исследованных маркеров со степенью дифференцировки рака яичников не обнаружено. Можно отметить лишь повышение уровней ИФРСБ-1 и ИФРСБ-2 в сыворотке крови больных с низкодифференцрованными опухолями, по сравнению с пациентками с высокодифференцированным раком яичников.
Классическим маркером рака яичников является гликопротеидный эпитоп высокомолекулярного муцина – СА-125. Он используется в дифференциальной диагностике рака яичников у женщин при наличии образований, выявленных с помощью УЗИ, и мониторинге и оценке эффективности его лечения. Диагностическая чувствительность СА-125 для рака яичников колеблется от 42 до 99% в зависимости от стадии (при III–IV стадии близка к 100%).
Мы сопоставили показатели концентрации исследуемых представителей семейства ИФР и ИФРСБ в сыворотке крови и опухолях больных новообразованиями яичников с уровнем СА-125 (табл. 3.30).
Во всех группах выявлена отрицательная взаимосвязь сывороточных концентраций СА-125 и ИФР-І, однако, уровня статистической значимости она достигает только у больных раком яичников, хотя и является у них более слабой, чем у больных доброкачественными опухолями (R= -0,3 и -0,66, соответственно). У больных доброкачественными опухолями наблюдается также достоверная и сильная обратная корреляция между уровнями СА-125 и ИФРСБ-3 и выраженная положительная корреляция между уровнями СА-125 и ИФРСБ-2, не достигающая уровня статистической значимости. В то же время уровень ИФРСБ-2 в сыворотке крови больных раком яичников достоверно положительно взаимосвязан с уровнем СА-125, что еще раз подтверждает потенциальную диагностическую значимость этого маркера.
Анализ содержания ИФР и ключевых ИФРСБ в сыворотке крови больных различными новообразованиями яичников показал, что наиболее перспективным маркером для дифференциальной диагностики рака яичников является ИФРСБ-2: его диагностическая чувствительность составляет более 85% уже на самых ранних стадиях заболевания при специфичности около 80%. Значимым маркером рака яичников оказался также ИФРСБ-1, хотя его чувствительность и специфичность ниже, чем у ИФРСБ-2. При раке яичников отмечено также диагностически значимое снижение уровня ИФР-І в сыворотке крови пациенток. Необходимо отметить, что ИФРСБ-1 и, в особенности, ИФР-І проявляют диагностическую чувствительность только при достаточно распространенном процессе. Разработан также диагностический алгоритм, включающий на первом этапе комплекс из 4-х маркеров (дополнительно к трем вышеперечисленным - ИФР-П), позволяющий повысить общую точность выявления рака яичников и прогнозировать индивидуальную вероятность наличия рака яичников у каждой обследованной пациентки.
Как уже отмечалось, одной из важнейших особенностей рака яичников, отличающих его от многих других злокачественных новообразований, является высокая частота образования асцита. Экспериментально доказано, что различные представители семейства ИФР в комплексе с факторами роста, ангиогенными факторами, белками клеточной поверхности могут активно участвовать в процессах, ведущих к образованию асцита [36, 78]. Выше мы проанализировали взаимосвязь между наличием и объемом асцита, присутствием в нем или в смывах брюшной полости опухолевых клеток и содержанием ИФР и ИФРСБ в первичных опухолях и сыворотке крови первичных больных раком яичников.
Кроме того, нам удалось определить содержание исследуемых маркеров (за исключением ИФРСБ-2) в асцитической жидкости 14 больных, у одной из которых опухоль была расценена как пограничная (табл. 3.31). Концентрации всех исследованных маркеров в асцитической жидкости были сопоставимы с показателями сыворотки крови.