Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Колоректальный рак. Современное состояние проблемы 11
1.1.1. Этиология и факторы риска колоректального рака 11
1.1.2. Молекулярный патогенез при колоректальном раке 13
1.2. Свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты 27
1.2.1. Биологические свойства свободно-циркулирующих нуклеиновых кислот 29
1.2.2. Диагностическая значимость определения концентрации сцДНК в плазме крови 32
1.2.3. Свободно-циркулирующая опухолевая ДНК 35
1.2.4. Методы детекции генетических изменений в сцДНК плазмы крови 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Общая характеристика обследованной группы 46
2.2. Объект исследования 47
2.3. Методы исследования 51
2.3.1. Выделение ДНК 51
2.3.2. Методы анализа мутационного статуса генов. 52
2.3.2.1. Метод мутационно-специфической ПЦР в режиме “реального времени” 52
2.3.2.2. Метод усиленной аллель-специфическая ПЦР в режиме “реального времени” 54
2.3.2.3. Метод секвенирования нового поколения (NGS) 55
2.3.2.4. Метод прямого секвенирования по Сэнгеру 56
2.3.3. Статистический анализ 57
Глава 3. Результаты и обсуждения молекулярно генетического исследования 58
3.1. Молекулярно-генетический профиль тканей опухоли 58
3.2. Анализ частоты и спектра мутаций в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака, проведенный методом NGS в образцах опухолевой ткани 64
3.2.1. Комбинация мутаций в опухолевой ткани больных КРР 90
3.3. Молекулярно-генетический анализ свободно-циркулирующей опухолевой ДНК 94
3.3.1. Анализ сцДНК методом усиленной аллель-специфической ПЦР в режиме “реального времени” 95
3.3.2. Анализ сцДНК методом NGS 104
3.4. Возможности и ограничения использования сцДНК плазмы крови 109
Заключение 113
Выводы 120
Практические рекомендации 121
Список литературы 122
- Молекулярный патогенез при колоректальном раке
- Молекулярно-генетический профиль тканей опухоли
- Анализ частоты и спектра мутаций в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака, проведенный методом NGS в образцах опухолевой ткани
- Анализ сцДНК методом усиленной аллель-специфической ПЦР в режиме “реального времени”
Введение к работе
Актуальность проблемы
Онкологические заболевания являются одной из наиболее распространенных причин смертности людей по всему миру, в том числе и в России. За последнее десятилетие, несмотря на значительные успехи клинической онкологии, смертность от онкологических заболеваний увеличивается [Каприн А.Д. и соавт, 2017]. Современная статистика злокачественных новообразований в России показывает, что ежегодно в России от рака умирает около 300 тысяч человек [Каприн А.Д. и соавт, 2017].
К настоящему времени достигнуты значительные успехи в профилактике, диагностике и лечении многих видов онкологических заболеваний. Важной составляющей повседневного лечения онкологических больных становятся молекулярно-генетические исследования. Наиболее примечательным результатом исследований последних лет в области клинической онкологии стало открытие мутаций, повышающих чувствительность к противоопухолевым препаратам, и воздействие на которые с помощью новых селективных противоопухолевых препаратов может остановить процесс пролиферации и прогрессию опухолевого роста.
Чтобы назначить препарат, направленный на клеточную мишень, важно иметь информацию о состоянии этой мишени, т.е. оценить необходимость назначения лекарственной терапии. Это делает актуальным разработку новых чувствительных молекулярно-биологических маркеров, которые будут учитывать индивидуальные особенности организма больного и опухоли.
В повседневной практике молекулярно-генетические исследования для определения чувствительности опухоли к таргетным препаратам, как правило, проводятся на ДНК, выделенной из опухолевых клеток операционного или биопсийного материала.
Свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты (сцНК) известны уже более 40 лет, однако за последнее десятилетие интерес к ним значительно возрос. Появилось много работ, посвященных теме анализа сцДНК плазмы крови у онкологических больных [Cheng F. et al., 2016; Tu M. et al., 2016]. Разнообразные молекулярно-генетические нарушения, возникающие в процессе канцерогенеза в ткани опухоли, могут быть выявлены не только в самой опухолевой ткани, но и в плазме или сыворотке крови при анализе сцНК, которые выполняют в данном случае роль онкомаркеров [Chae Y.K. et al, 2016;, Gonzlez-Masi J. A. et al., 2013]. При этом так называемая "жидкостная биопсия", основанная на исследовании выделенной из плазмы крови сцДНК для обнаружения генетических маркеров, может стать ценным инструментом исследования для диагностики, мониторинга и прогноза онкологических заболеваний [Fleischhacker M., Schmidt B., 2007; Ma M. et al., 2015].
Учитывая вышеизложенное, мы предположили, что продолжение исследований, направленных на изучение молекулярно-генетических нарушений, которые необходимы для поиска и разработки новых опухолевых онкомаркеров, а также методов их детекции, являются актуальными и перспективными.
Степень разработанности темы исследования
Фундаментальные исследования в области молекулярных механизмов патогенеза КРР привели к тому, что спектр специфически направленных лекарственных средств (таргетных препаратов) постоянно расширяется. Несмотря на существование множества различных маркеров, определяющих малигнизацию и опухолевую прогрессию, на сегодняшний день всего лишь несколько опухолевых биомаркеров изучены достаточно для того, чтобы применять их в клинической практике. Для эффективной оптимизации и индивидуализации лечения разнообразных онкологических заболеваний, в том числе и КРР, требуются новые молекулярно-генетические маркеры.
Научные публикации последних лет свидетельствуют о том, что анализ молекулярно-генетических маркеров проводится, в основном, на материале опухолевой ткани. Но при работе с ней есть серьезные препятствия, связанные с получением материала, его обработкой, а также с молекулярной гетерогенностью опухоли [Васильева И.Н., Беспалов В.Г., 2013]. Имеются данные, что молекулярно-генетические нарушения могут быть выявлены не только в опухолевой ткани, но и в плазме или сыворотке крови при анализе свободно-циркулирующей ДНК, что позволяет преодолеть ограничения, имеющиеся при работе с операционным или биопсийным материалом [Имянитов Е.Н., 2005, Зборовская И.Б., 2014].
Цель исследования. Изучить возможности использования ДНК опухоли и свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови для идентификации мутаций в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака.
Задачи исследования:
1. Провести молекулярно-генетическое исследование генов RAS-каскада, приоритетных
для индивидуализации лекарственной терапии, в ткани опухоли при колоректальном раке;
2. Изучить частоту и спектр мутаций в генах, участвующих в патогенезе
колоректального рака, в ткани опухоли с использованием метода высокопроизводительного
секвенирования (NGS);
3. Изучить возможности метода усиленной аллель-специфической ПЦР для анализа
мутаций в генах RAS-каскада в образцах свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови у
больных колоректальным раком;
4. Изучить частоту и спектр мутаций в генах, участвующих в патогенезе
колоректального рака, в свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови с использованием
метода высокопроизводительного секвенирования (NGS);
5. Оценить возможности и ограничения применения свободно-циркулирующей ДНК
плазмы крови для идентификации мутаций у больных колоректальным раком.
Научная новизна
На достаточно большом клиническом материале (355 больных) показано, что частота мутаций в генах RAS-каскада у больных КРР составляет 48,6%, при этом чаще всего выявляются мутации в гене KRAS, частота которых составила 40,6%. Самые распространенные мутации в гене KRAS – G12D (39,7%), G13D (22,6%) и G12V (17%), которая характерна для наиболее агрессивных опухолей.
Впервые в России методом NGS проанализировано 46 образцов опухолевой ткани и выявлены основные молекулярно-генетические нарушения, характерные для патогенеза КРР. Определена диагностическая и прогностическая значимость анализа мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе КРР.
Впервые проведен сравнительный анализ сцДНК плазмы крови методом NGS и методом усиленной аллель-специфической ПЦР в реальном времени, разработанным специально для анализа биологических образцов, содержащих небольшое количество мутантной ДНК. Показано, что по чувствительности и информативности метод аллель-специфической ПЦР уступает методу NGS, но является более доступным для применения в клинической лабораторной практике.
Показано, что онкоспецифические изменения в циркулирующей крови до и после проводимого лечения коррелируют со степенью агрессивности опухоли и свидетельствуют о возможном метастазировании, а также позволяют оценивать эффективность терапии и вносить необходимые коррективы в случае развития резистентности к проводимому лечению.
Теоретическая и практическая значимость работы
Исследование мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе КРР позволило выявить основные генетические изменения, которые могут быть использованы для разработки онкоспецифических маркеров, позволяющих индивидуализировать лечение злокачественного новообразования.
Анализ мутационного статуса генов RAS-каскада позволяет определять не только показания к таргетной терапии для пациентов с метастатическим КРР, но и индивидуализировать лечебную тактику у пациентов с выявленными мутациями на ранней стадии заболевания.
Исследование сцДНК плазмы крови методами NGS и аллель-специфической ПЦР в реальном времени продемонстрировало реальные перспективы применения «жидкостной биопсии» для диагностики и прогноза онкологических заболеваний.
Полученные данные позволяют рекомендовать для практического применения анализ сцДНК плазмы крови в качестве прогностического теста при индивидуальном мониторинге заболевания, а также в качестве дополнительного метода диагностики онкологических заболеваний в тех случаях, когда процедура биопсии по какой-либо причине трудновыполнима или может вызвать осложнения.
Методология и методы научного исследования
Настоящее научное исследование выполнено на базе лаборатории молекулярной
биологии и цитогенетики федерального государственного бюджетного учреждения
“Российский научный центр рентгенорадиологии” МЗ РФ. Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Для обоснования актуальности изучаемой проблемы и цели исследования был проведен теоретический анализ и обобщение данных отечественной и зарубежной литературы. В работе применяли молекулярно-генетические методы исследования: метод мутационно-специфической ПЦР в режиме “реального времени”, метод усиленной аллель-специфической ПЦР в режиме “реального времени”, метод секвенирования нового поколения (NGS), метод прямого секвенирования по Сенгеру, а также ретроспективный анализ клинических данных и статистический анализ.
Положения, выносимые на защиту
-
Исследование мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе колоректального рака, позволяет проводить отбор, анализ и интерпретацию опухолевых маркеров, позволяющих индивидуализировать лечение злокачественного новообразования.
-
Анализ сцДНК плазмы крови является перспективным прогностическим методом, позволяющим проводить индивидуальный мониторинг заболевания.
Личный вклад автора
Изложенные в диссертационной работе материалы исследования получены при личном участии автора. В ходе работы над диссертацией соискателем были сформулированы цель, основные задачи исследования, проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме; самостоятельно проведен сбор части клинических данных и биологического материала. Автором было проведено молекулярно-генетическое исследование части образцов ДНК опухолевой ткани методом ПЦР в режиме “реального времени” и секвенирования по Сенгеру, анализ 46 образцов опухолевой ткани методом NGS и секвенирования по Сенгеру и 81 образца сцДНК плазмы крови методом NGS и ПЦР в режиме
“реального времени”. Автором была проведена статистическая обработка и анализ результатов исследования, обобщение данных. Соискатель самостоятельно сформулировал положения, выводы работы, а также практические рекомендации.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации
Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийской конференции молодых ученых-онкологов “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии”, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева, Томск, апрель 2014 г.; на конкурсе молодых онкологов на VIII съезде онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии, Казань, сентябрь 2014 г.; на II Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, Москва, декабрь 2016 г., на конференции “Геномное секвенирование и редактирование”, Москва, май 2018 г., на конференции “Опухолевые маркеры: фундаментальные и клинические аспекты”, посвященной памяти советского и российского ученого Гарри Израйлевича Абелева, Республика Алтай, г. Горно-Алтайск, июнь 2018.
Апробация работы состоялась на совместном заседании научно-практической конференции и совета по апробациям кандидатских диссертаций ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России 13 ноября 2017 года.
Публикации
Автором по теме диссертации опубликовано 10 работ, среди которых 4 статьи, 3 из которых опубликованы в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК, 6 тезисов на различных научно-практических конференциях, конгрессах, съездах, симпозиумах.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 170 источников (11 отечественных и 159 зарубежных). Материал диссертации иллюстрирован 6 рисунками и 30 таблицами.
Молекулярный патогенез при колоректальном раке
Масштабные фундаментальные исследования последних десятилетий привели к существенному прогрессу в области понимания биологии КРР. Были идентифицированы молекулярные механизмы, которые приводят к трансформации и прогрессированию КРР.
Существует несколько принципиально различных вариантов молекулярного патогенеза КРР, включающих как генетические, так и эпигенетические механизмы. Считается, что первоначальные генетические изменения начинаются еще в ткани аденомы и накапливаются в ней по мере ее превращения в карциному [15]. При этом возникает нестабильность генома, которая инициирует канцерогенез и способствует прогрессии опухолевого процесса.
Общепризнаны три различных пути развития геномной нестабильности при КРР: хромосомная нестабильность (chromosomal instability, CIN), микросателлитная нестабильность (miсrosatellite instability, MSI) и гиперметилирование CpG-островков (метиляторный фенотип, CpG island methylator phenotype, CIMP) [15, 119].
Полагают, хромосомная нестабильность является общей чертой большинства опухолей человека, таких как раки молочной железы, яичника, предстательной железы, желудка, а также более чем для 85% случаев КРР. На молекулярном уровне хромосомная нестабильность характеризуется аллельным дисбалансом и проявляется в виде множественных делеций, амплификаций и перестроек больших участков хромосом [61]. Однако механизмы возникновения хромосомной нестабильности пока изучены недостаточно. Она наблюдается в аденомах еще до перехода в откровенно злокачественную форму новообразования и, по-видимому, является распространенным явлением даже в очень небольших опухолях, возникая уже на ранних этапах колоректального канцерогенеза [15]. Остается также открытым вопрос, является ли хромосомная нестабильность движущей силой злокачественной трансформации аденомы в карциному или же она возникает во время этого процесса и является его следствием.
Помимо хромосомной нестабильности, патогенез КРР характеризуется наличием микросателлитной нестабильности.
"Микросателлиты" – это короткие тандемно повторяющиеся последовательности (длина повтора от одного до шести нуклеотидов), которые разбросаны по всему геному. Микросателлитная изменчивость проявляется либо за счет уменьшения, либо за счет увеличения количества повторов [12]. Некоторые опухоли имеют повышенный уровень мутирования микросателлитов в результате нарушения процесса репарации ДНК, вызванного изменениями в системе MMR (“мисс-мэтч репарация”), ферменты которой действуют как дополнительная система для сохранения геномной целостности [15]. Данное явление получило название микросателлитной нестабильности (microsatellite instability, MSI). Инактивация ферментов системы MMR может происходить либо путем аберрантного метилирования промоторных CpG-островов гена MLH1, либо за счет точечных мутаций в любом члене семейства MMR. О высокой микросателлитной нестабильности говорят в случае нестабильности 30% и более маркеров [110].
Биологическая функция микросателлитов до сих пор не до конца ясна, но они часто используются в качестве генетических маркеров в различных областях биологии и медицины [46].
Микросателлитная нестабильность является отличительной чертой синдрома Линча и наблюдается более чем у 95% этих пациентов, в отличие от 15 20% случаев ее при спорадическом КРР [55]. Опухоли с микросателлитной нестабильностью обычно характеризуются отсутствием хромосомной нестабильности, нормальный кариотип в них как правило сохранен [161]. Еще один путь развития геномной нестабильности и, следовательно, третий тип патогенеза КРР, который стали выделять в последнее время, – избыточное метилирование CpG-островков (эпигенетическая нестабильность). При эпигенетической нестабильности регуляция экспрессии ДНК происходит без изменения нуклеотидной последовательности. Обозначение CpG означает цитозин (C), за которым следует гуанин (G), с промежуточной фосфодиэфирной (р) связью между ними. В данной паре цитозин демонстрирует более высокую чувствительность к метилированию. Большим количеством CpG пар характеризуются промоторные (регуляторные) области генов. Аберрантное метилирование промоторных областей генов является столь же существенным фактором, как и инактивация генов-супрессоров посредством мутаций в ДНК [15, 79].
В нормальных клетках CpG-островки обычно находятся в неметилированном состоянии. В отсутствие метилирования ген экспрессируется нормально. При метилировании промоторной области транскрипция гена подавляется (т.е. отключается). “Молчание” гена-супрессора опухоли может быть результатом гиперметилирования промотора, включающего как копии гена супрессора опухоли, так и комбинацию потери одного аллеля посредством делеции или мутации в сочетании с молчанием другого аллеля посредством гиперметилирования промотора [15]. Положительный метиляторный фенотип часто связан с микросателлитной нестабильностью, так как нарушение метилирования зачастую приводит к инактивации гена системы MMR – MLH1.
Как показали многочисленные исследования, аберрантное метилирование гена MLH1 встречается в 80% случаев спорадических КРР с микросателлитной нестабильностью [79, 137, 164]. Наличие значимого статуса гиперметилирования обычно определяют, если присутствует метилирование не менее трех локусов для панели, включающей пять генетических локусов: hMLH1, P16, MINT1, MINT2 и MINT31 ген-ассоциированных CpG-островков [19]. Эпигенетическая нестабильность также может проявляться в тотальном гиперметилировании экзонных и интронных участков генов.
Важным фактором в патогенезе КРР является накопление широкого спектра мутаций (точечные мутации, делеции, инсерции, амплификации) в специфических генах – онкогенах и генах-супрессорах. Данные изменения влияют на регуляцию сигнальных путей, контролирующих ключевые клеточные процессы, приводя к канцерогенезу. Наиболее изученными сигнальными путями, которые участвуют в процессе малигнизации тканей при КРР, являются WNT (APC/Wnt/-catenin), EGFR (EGFR/RAS/RAF/MAPK), PI3K (PI3K/AKT/mTOR) и TGF- пути [160]. Эти сигнальные пути представляют собой разветвленные цепочки передачи активирующих стимулов, начинающихся с распознавания факторов роста соответствующими рецепторами и заканчивающиеся запуском экспрессии комплекса генов, отвечающих за такие важные процессы, как клеточная пролиферация, дифференцировка, апоптоз, ангиогенз и инвазия. Патогенез КРР включает как активацию онкогенов, так и инактивацию супрессорных генов.
Сигнальный путь Wnt (APC/Wnt/-catenin) является одним из важнейших сигнальных путей в клетке и играет огромную роль в развитие как наследственного, так и спорадического КРР. Мутации в этом каскаде связаны с развитием, в первую очередь, рака толстой кишки, а также гепатокарцином и лейкемий. Особый интерес представляет роль данного сигнального пути в поддержании опухоль-инициирующих клеток и метастазировании.
Важную роль в канцерогенезе КРР играет ген АРС, являющийся одним из компонентов сигнального пути Wnt. Ген-супрессор опухоли АРС обычно блокирует переход клеточного цикла от фазы G1 к S и участвует в процессах клеточной адгезии. Путь передачи сигналов Wnt поддерживает нативные стволовые клетки в их недифференцированном состоянии в основании кишечных криптов, что способствует не только выживанию нормальных стволовых клеток, но также и выживанию раковых стволовых клеток. Ген-супрессор АРС мутирует примерно в 30-70% случаев спорадических аденом и аденокарцином, при этом мутации в этом гене часто ассоциированы с семейным аденоматозным полипозом. Большинство (98%) мутаций АРС представляют собой либо сдвиг рамки считывания, либо нонсенс-мутации, приводящие к синтезу укороченного белка [15, 23, 36].
fi-Катенин является основным звеном в сигнальном пути Wnt. Немутантный ген АРС вызывает протеосомную деградацию -катенина и, следовательно, функционирует как отрицательный регулятор сигнального пути Wnt. Устойчивые уровни внутриклеточного -катенина, локализованного в ядре клетки, приводят к длительной активации пути Wnt в клетках рака прямой кишки с мутантным геном АРС [15, 103]. Ген /З-катенина также часто мутирует в клетках КРР. В случаях спорадического КРР с геном АРС дикого типа было описано, что гиперметилирование промотора гена АРС или точечная мутация в структуре гена -катенина объясняют устойчивую активацию сигнального пути Wnt [103].
Молекулярно-генетический профиль тканей опухоли
В период с 2010 по 2016 гг. проведено молекулярно-генетическое исследование генов RAS-каскада – KRAS, NRAS и BRAF в опухолевой ткани 355 больных с КРР методом мутационно-специфической ПЦР. Результаты исследования представлены в таблице 5. Мутации были выявлены у 171 больного КРР (48,6%). При этом у 144 человек из 171 были обнаружены мутации в гене KRAS, у 22 – в гене BRAF и у 5 – в гене NRAS.
В нашем исследовании мутации в гене KRAS были выявлены у 144 человек, что составило 40,6 % (таблица 5). Полученные нами данные о частоте мутаций в гене KRAS соответствуют данным, представленным в литературе и свидетельствующим о том, что при КРР мутации в данном гене встречаются примерно в 40%-50% случаев [23].
Всего было обнаружено 146 мутаций (таблица 6). У одного пациента в образце опухолевой ткани было выявлено 2 мутации в гене KRAS – замена глицина на аланин и глицина на серин в 12-м кодоне, у второго пациента были выявлены мутации одновременно в гене KRAS (замена глицина на аланин в 12-м кодоне) и гене NRAS (Q61K).
Как известно, одним из ключевых событий в патогенезе КРР является пролиферация эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника, которая сопровождается гиперэкспрессией рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Более чем в 60% опухолей при КРР наблюдается гиперэкспрессия рецептора EGFR. Ген KRAS является одним из наиболее важных онкогенов при КРР, участвующих в активации сигнального пути EGFR (RAS/RAF/MAPК), тесно связанный с пролиферацией опухолевых клеток. Доказано, что активация гена КRAS за счет мутации приводит к потере эффекта ингибирования EGFR моноклональными антителами. Лечение современными таргетными препаратами основано на ингибировании рецептора EGFR антителами к нему. Согласно клиническим рекомендациям, все пациенты с метастатическим КРР, которым планируется терапия таргетными препаратами, направленными против EGFR, должны проходить тестирование на выявление мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS [ASCO, 2008]. Мутации в гене KRAS ассоциированы с отсутствием положительного эффекта при анти-EGFR-терапии или даже с ухудшением состояния пациента, в то время как при отсутствии мутаций в гене KRAS замедляется прогрессия заболевания и увеличивается общая продолжительность жизни больного [108]. Мутации в гене KRAS в основном представлены точечными заменами в 12-м и 13-м кодонах 2го экзона [16, 23]. Самые распространённые мутации гена KRAS в ткани опухоли при КРР являются замены глицина на аспарагиновую кислоту (G12D и G13D). В нашем исследовании они составили 39,7% и 22,6%, соответственно, от общего числа мутаций при данной локализации. Наиболее значимым является онкогенный потенциал в 12 кодоне, в котором замена G12V характерна для наиболее агрессивных опухолей. В нашем исследовании эта мутация выявлена у 25 пациентов (17% случаев среди пациентов с мутацией в гене KRAS).
Есть предположения, что предиктивное значение мутаций в гене KRAS неодинаковое, однако подтвердить это можно будет только по результатам крупных проспективных исследований [120, 150]. В исследовании 2012 года было показано, что пациенты с мутацией в кодоне G13D экзона 2 показывали ответ на моноклональные антитела к EGFR. Ответ является не столь устойчивым, как у пациентов с диким типом гена KRAS, но все же пациенты демонстрировали лучшую общую выживаемость и выживаемость без прогрессирования [150]. На сегодняшний день применять дифференцированный подход при выявлении разных мутаций представляется преждевременным.
Анализ мутационного статуса гена KRAS важно проводить не только на поздних стадиях заболевания, но и на ранних стадиях, так как он является маркером агрессивного фенотипа опухоли [33]. Выявление мутаций у пациентов на ранних стадиях заболевания, учитывая неблагоприятный прогноз, позволяет корректировать проводимую терапию, применяя альтернативные более агрессивные методы лечения.
В нашем исследовании 76% больных с выявленными мутациями в гене KRAS имели III и IV стадии заболевания, а 24% обследованных – I и II стадию заболевания.
Идентификация мутаций в гене KRAS для проведения таргетной терапии может проводиться как в образцах первичной опухоли пациента, так и в отдаленных метастазах той же опухоли, если, например, по каким-либо причинам недоступен материал из первичной опухоли. Как показали исследования, приобретенные мутации сохраняются в течение всего процесса канцерогенеза, что подтверждается почти полным совпадением мутационных спектров при анализе гена KRAS в ткани первичной опухоли и метастазах [7, 15, 53].
В нашем исследовании из 355 больных у 14 человек была возможность проанализировать мутационный статус генов KRAS, BRAF, NRAS в ДНК, выделенной не только из первичной опухоли, но и полученной из метастаза опухоли. Мутации в гене KRAS были выявлены в 5 образцах первичной опухоли и в соответствующих им образцах метастазов. В одном образце первичной опухоли была обнаружена мутация в гене BRAF, которая подтвердилась также и в метастазе. В 8 образцах первичной опухоли мутации не были выявлены, при этом анализ соответствующих образцов метастаза опухоли показал аналогичные результаты (таблица 7). Совпадение опухоли и ее метастаза в нашем исследовании по мутационному статусу генов RAS-каскада подтверждает литературные данные.
При обследовании 355 больных КРР мутация в 15-м экзоне гена BRAF была выявлена у 22 человек, что составило 6,2% (таблица 5). Изменение в гене BRAF представлено единственным вариантом – заменой валина на глутаминовую кислоту в 600 кодоне (V600E). Это самая распространенная мутация в 15-м экзоне гена BRAF при КРР.
Ген BRAF, вовлеченный в сигнальный каскад EGFR, также оказывает влияние на процессы деления, выживания, миграции и дифференцировки клеток.
Активирующие мутации в гене BRAF встречаются в 10-15% случаев КРР и являются взаимоисключающими с мутациями в гене KRAS. Наиболее распространенной мутацией является активирующая точечная замена валина на глутаминовую кислоту в 600-м кодоне – V600E, которая, по данным ряда авторов, может встречаться примерно у 10% больных КРР [7, 15]. Детекция мутантного гена BRAF также очень важна при назначении таргетной терапиии, т.к. определяет устойчивость опухоли к анти-EGFR терапии и чувствительность к ингибиторам RAF. Кроме того, наличие мутации в гене BRAF ассоциируется с неблагоприятным прогнозом – с более агрессивным типом опухоли, высокой верятностью метастазирования, худшей выживаемостью и более ранним прогрессированием заболевания, что позволяет использовать мутантный статус данного гена в качестве прогностического маркера [156].
Анализ частоты и спектра мутаций в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака, проведенный методом NGS в образцах опухолевой ткани
Важным фактором в патогенезе колоректального рака является накопление широкого спектра мутаций в специфических генах. Точеные мутации, делеции, инсерции и амплификация изменяют функции данных генов и кодируемых ими белков. Это приводит к нарушению регуляции сигнальных путей, контролирующих ключевые процессы клетки, а, следовательно, и процессы канцерогенеза.
46 образцов опухолевых тканей было проанализировано методом секвенирования нового поколения (NGS) для выявления новых возможных онкоспецифических маркеров, которые могли бы быть использованы как дополнительные маркеры диагностики, эффективности лечения и прогноза течения заболевания.
Для пробоподготовки библиотек использовали наборы GeneRead DNASeq Targeted Panel v2 Human Colorectal Cancer (“Qiagen”, США). Для всех образцов ДНК опухолевой ткани глубина прочтения ампликонов составляла не менее х100. Все варианты, описанные в данном исследовании, были с частотой прочтения равной или большей 10% от всех прочтений конкретного участка. Все соматические варианты, найденные в образцах ДНК ткани опухоли, были подтверждены методом прямого секвенирования по Сенгеру.
Предварительно все образцы ткани опухоли были проанализированы методом ПЦР в режиме “реального времени” на наличие мутаций в генах RAS-каскада. В 42 образцах опухоли были выявлены мутации в гене KRAS, а в 4 – мутации в гене BRAF.
Результаты исследования ДНК опухолевой ткани методом NGS представлены в таблице 8. У 41 пациентов из обследуемой группы были выявлены мутации в гене KRAS. Самыми распространёнными мутациями при КРР являются замена глицина на аспарагиновую кислоту в 12м и 13м кодонах 2го экзона гена KRAS. Они составили соответственно 39,1% и 19,6% от общего числа мутаций при данной локализации. У одного пациента мутация в гене KRAS, обнаруженная до этого методом ПЦР, не была выявлена при анализе методом NGS. Полученные данные можно объяснить молекулярной гетерогенностью опухоли, учитывая, что для проведения анализа методом NGS, ДНК из ткани опухоли выделяли повторно из другого участка опухоли.
У 4 пациентов из 46 была выявлена мутация V600E в гене BRAF.
Кроме генов KRAS, BRAF и NRAS были проанализированы еще 17 генов, участвующих в молекулярном патогенезе КРР, а именно: АР С, ТР53, SMAD2, SMAD4, FBXW7, PIK3CA, CTNNB1, TCF7L2, MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, ATM, TGF-BR2, АКТІ, DCC, DMD. Всего было выявлено 128 соматических вариантов. Данные представлены в таблице 8.
Самое большое количество соматических мутаций выявлено в генах АРС (56% пациентов) и ТР53 (50% пациентов). Реже встретились мутации в генах FBXW7 (15% пациентов), BRAF (9% пациентов) и SMAD4 (9% пациентов). Мутации в генах SMAD2, DMD и PIK3CA встретились в 6,5% случаев. По две-три мутации (4%) было обнаружено в генах ATM, CTNNB1, DCC и TCF7L2 и одна мутация (2%) - в гене MLH1.
В генах NRAS, MSH2, MSH3, MSH6, TGF-BR2 и АКТІ мутации не выявлены.
Известно, что при спорадическом КРР, помимо генов RAS-каскада (KRAS, BRAF, NRAS), часто встречаются мутации в генах АРС (до 70% случаев), PIK3CA (до 32% случаев), ТР53 (до 60% случаев) [88, 144]. Ген PIK3CA несет драйверные мутации, которые влияют на молекулярный патогенез в сочетании с мутациями в генах KRAS, BRAF, NRAS. Имеются сведения о наличии при КРР инактивирующих мутаций в генах PTEN, FBXW7 и /3-катенин [7]. Гены, кодирующие пострецепторные белковые структуры, такие как SMAD (SMAD2, SMAD3, SMAD4), также могут нести в себе соматические мутации в 3-9% случаев колоректального рака [47]. Инактивирующие мутации, которые ассоциируются со злокачественной трансформацией аденомы, обнаружены также с достаточно высокой частотой (до 30% случаев) при КРР в гене, кодирующем рецептор TGF BR2 [7]. Такие гены как SMAD2, SMAD4, TP53, FBXW7 являются маркерами прогноза.
Все варианты, выявленные в нашем исследовании, являются миссенс-мутациями. Мутация p.R361H является одной из наиболее часто встречающихся при КРР и является вероятно онкогенной. Мутация p.P356R присутствует в базах данных COSMIC и cBioPortal, где она описана как патогенная и вариант с неизвестным функциональным и клиническим значением в патогенезе, соответственно. Мутация p.D537G присутствует в базах данных по онкологическим соматическим мутациям – COSMIC и cBioPortal (for cancer genomics). Клиническое и функциональное значение данного варианта для онкогенеза не подтверждено. Однако в базах есть мутация p.D537Y, изменения при которой происходят в той же точке последовательности, что и при p.D537G. Известно, что мутация p.D537Y является онкогенной, таким образом, и мутация p.D537G может считаться вероятно онкогенной.
Мутация p.D537V также присутствует в базах данных, но без указания точного значения для канцерогенеза. При этом она была выявлена у больных с диагонозом “колоректальный рак” и “рак поджелудочной железы” (cBioPortal).
Ген SMAD4 является прогностическим маркером. Утрата гена SMAD4, обычно по механизму аллельного дисбаланса, продемонстрированная в экспериментах in vivo, ассоциируется с формированием аденом и прогрессией аденокарцином.
Имеются данные, что пониженные уровни экспрессии как белка, так и гена SMAD4, связаны с плохим клиническим прогнозом, а также с плохим ответом на терапию 5-фторурацилом, что свидетельствует о его возможной роли в качестве опухолевого супрессора [7].
Возможно, ген SMAD4 имеет также потенциальное значение для прогнозирования ответа пациента на таргетную терапию. В исследовании 2015 года, в котором анализировали ответ пациентов с КРР на анти-EGFR-терапию, было проведено мультигенное секвенирование 65 образцов ткани [92]. В гене SMAD4 было обнаружено 4 мутации у пациентов, не ответивших на таргентную терапию, и одна мутация у пациента с частичным ответом, однако различия между группами пациентов, ответивших на терапию и оставшихся резистентными к анти-EGFR-терапии были недостоверные. Однако, когда все гены, несущие мутации (включая KRAS), были объединены, то различия оказались статистически значимыми (11% против 46%).
Спорадические мутации в гене SMAD4, по данным разных исследований, которые, к сожалению, не многочисленны, присутствуют в 2,1-20% случаев КРР [131]. Мутации в данном гене обычно являются поздним событием в патогенезе КРР и происходят в сочетании с другими нарушениями [131].
В работе Fleming и соавт. был проанализирован спектр мутаций в генах SMAD2, SMAD3 и SMAD4 при КРР, и в 8,6% (64 из 744) случаев выявлены мутации в гене SMAD4, которые ассоциированы с муцинозной формой гистологии опухоли. При этом не была выявлена корреляция со стадией заболевания, возрастом и полом пациентов [47].
При обследовании 734 пациентов КРР у 90 были выявлены мутации в гене SMAD4, что составило 12%. Показано, что мутации в этом гене ассоциированы с раком толстой кишки больше, чем с раком прямой кишки. Также была выявлена корреляция между наличием мутации в гене SMAD4 и более коротким сроком выживаемости, чем у пациентов с диким типом гена SMAD4. При этом мутации в гене SMAD4 чаще встречались у пациентов женского пола [114].
В нашем исследовании три из четырех найденных мутаций в гене SMAD4 были выявлены у женщин с локализацией опухоли в ободочной кишке, одна – у мужчины с опухолью прямой кишки.
Анализ сцДНК методом усиленной аллель-специфической ПЦР в режиме “реального времени”
Молекулярно-генетическое исследование сцДНК плазмы крови, полученной до операции (46 образцов), показало, что у 24 пациентов (52 %) в циркулирующей опухолевой ДНК присутствуют мутации в экзоне 2 гена KRAS или экзоне 15 гена BRAF, а в цоДНК других 22 пациентов их нет. Результаты представлены в таблице 24. Мы проанализировали распределение пациентов в зависимости от стадии заболевания и установили, что в группе больных с мутациями в генах RAS-каскада большинство (15 человек, 63 %) имели III или IV стадию, а в группе больных без мутаций в цоДНК большинство (10 человек, 45%) имели I стадию заболевания.
В таблице 24 также приведены значения концентрации сцДНК и относительного содержания мутантной цоДНК в плазме крови участников исследования. У пациентов с онкоспецифическими мутациями в генах RAS-каскада, выявленных изучаемым методом, содержание сцДНК было выше независимо от стадии заболевания (особенно заметной была разница между подгруппами больных с IV стадией), но различия оказались статистически незначимыми ввиду высокой вариабельности показателя. А вот относительное содержание мутантной цоДНК у пациентов этой группы было достоверно выше, чем аналогичный показатель в группах больных, у которых мутации не были обнаружены (p 0,05). В этих группах больных содержание мутантной цоДНК было ниже порога чувствительности метода, применяемого в данной работе, который составляет 0,1%.
Проведенное исследование сцДНК до операции позволило проанализировать возможную связь результатов молекулярно-генетического анализа с прогнозом заболевания, а также с возможным развитием метастазов и появлением рецидивов.
В течение всего срока наблюдения, который составил 27 месяцев, в группе больных с выявленными мутациями в сцДНК до операции (24 человека) в 79% случаев (19 человек) было отмечено прогрессирование заболевания, причем 15 (63%) человек умерли. Только 5 больных, у которых выявлены мутации при анализе сцДНК плазмы крови, были живы на протяжении всего периода наблюдения. В группе больных, у которых не были выявлены мутации до операции (22 человека), 17 (77%) человек были живы в течение всего периода наблюдения. В этой группе зарегистрировано 5 случаев прогрессирования заболевания, причем все больные впоследствии умерли. Результаты представлены в таблице 25. Здесь же приведены значения концентрации сцДНК плазмы крови и относительного содержания мутантной цоДНК. Концентрация сцДНК и содержание мутантной цоДНК статистически значимо выше в группе больных с выявленными мутациями, у которых отмечено прогрессирование заболевания, по сравнению с больными, у которых мутации не были выявлены. В группе больных без мутаций (17 человек), у которых не отмечено прогрессирование заболевания, содержание сцДНК было небольшое, что, по-видимому, не позволило выявить мутации, учитывая также и более низкое содержание мутантной цоДНК
Для 35 из 46 больных, включенных в исследование, сцДНК плазмы крови была проанализирована не только до операции, но и на пятый день после хирургического лечения. Мутации были выявлены в 17 образцах (49%) из 35. В группе больных с выявленными мутациями у 13 человек (76%) зарегистрировано прогрессирование заболевания. 9 человек из этой группы (53%) имели IV стадию заболевания, из них у 5 человек было проведено нерадикальное хирургическое лечение. По-видимому, по факту наличия или отсутствия мутаций при анализе сцДНК плазмы крови можно судить о степени радикальности проведенной хирургической операции, предполагая, что у больных с выявленными мутациями и, соответственно, высоким содержанием мутантной цоДНК, очаги опухоли и метастазов удалены не полностью или имеются метастазы, которые не были диагностированы. Данные представлены в таблице 26, где также приведены значения концентрации сцДНК и относительные значения мутантной цоДНК.
В группе больных, у которых не были выявлены мутации в генах RAS-каскада при анализе сцДНК (18 больных) – 14 человек (78%) живы, а у четырех отмечено прогрессирование заболевания. В этой группе 7 человек имели I стадию заболевания, 5 – II стадию, 5 – III стадию и всего 1 человек имел IV стадию заболевания.
Как известно, при развитии онкологических заболеваний содержание сцДНК в крови повышается и при этом не зависит от локализации опухоли [2]. Имеются данные о связи содержания сцДНК в крови с клиническим течением онкологического заболевания [10]. Причем более высокое по сравнению с нормой содержание сцДНК в крови часто наблюдается уже на ранних стадиях опухолевого процесса, а также может резко возрастать при метастазировании [1].
При этом концентрация сцДНК может сильно различаться у разных пациентов [68]. Это неудивительно, если учесть, что сцДНК может появляться в крови не только в результате гибели клеток опухоли и окружающих ее тканей, но и при естественном разрушении клеток крови. Вклад в общее содержание сцДНК в крови может вносить также секреция опухолевыми клетками фрагментов нуклеиновых кислот, в том числе амплифицированных. Известно, что амплификация отдельных участков генов – достаточно частое событие при опухолевой патологии. В результате общее количество сцДНК у больных с онкологическими заболеваниями сильно варьирует от пациента к пациенту, что не позволяет использовать концентрацию сцДНК в качестве маркера.
Косвенно судить о количестве циркулирующей опухолевой ДНК можно, анализируя определенные онкоассоциированные мутации. При этом важно учитывать, что содержание мутантной цоДНК может значительно отличаться от общего содержания цоДНК: быть ниже за счет гетерогенности новообразования [8]. По этой причине не всегда, особенно на ранних стадиях заболевания, удается определить присутствие цоДНК в плазме крови. В свою очередь, это может приводить к ложноотрицательным результатам и, соответственно, снижать чувствительность метода, используемого для анализа сцДНК. Это подтверждают данные нашего исследования, в котором нам не удалось выявить мутации в генах RAS-каскада у пациентов на ранних стадиях заболевания.
В работе, посвященной исследованию цоДНК плазмы крови 44 пациентов с немелкоклеточным раком легких и 35 пациентов с КРР, продемонстрированы возможности методов NGS и цифровой ПЦР при анализе сцДНК [12]. Генетические изменения (мутации в гене EGFR) в сцДНК, аналогичные выявленным при анализе опухолевой ткани, методом NGS были обнаружены у 77,3% больных с немелкоклеточным раком легких и у двух больных, у которых в опухолевой ткани стандартным методом ПЦР был выявлен дикий тип EGFR. Метод цифровой ПЦР подтвердил наличие мутаций у этих двух больных как в первичной опухоли, так и в плазме крови. В этом же исследовании в 100% случаев (6/6) методом NGS в плазме крови были подтверждены мутации в гене KRAS, выявленные стандартным методом ПЦР у пациентов, обследованных до хирургического лечения. В то же время, у прооперированных пациентов методом NGS только в 46,2% случаев (6/13) были обнаружены мутации при анализе сцДНК плазмы крови. Авторы полагают, что метод NGS обладает высокой чувствительностью для анализа мутаций плазмы крови. Однако его чувствительность зависит от присутствия в организме опухолевого очага и гетерогенности драйверных мутаций.