Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные аспекты патогенеза рака желудка (обзор литературы). 10
1.1. Эпидемиология и диагностика рака желудка 10
1.2. Молекулярно-генетические аспекты рака желудка 11
1.3. Изменение копийности генов при раке желудка, механизмы и ассоциации с метастазированием 13
1.4. Регионарное метастазирование и его потенциальные молекулярные механизмы 25
Глава 2. Материал и методы исследования. 33
2.1. Характеристика групп больных 33
2.2. Критерии отбора пациентов и методы диагностики 43
2.3. Иммуногистохимические методы исследования 43
2.4. Генетические методы исследования 45
2.5. Методы статистической обработки результатов 49
2.5.1. Основные статистические показатели и методы расчета 49
2.5.2. Относительный риск развития рака желудка и его методика расчета 49
Глава 3. Изменение копийности 16-ти генетических локусов у больных с аденокарциномой желудка 51
Глава 4. Исследование экспрессии молекулярно биологических маркеров (Р53, KI-67, BCL2, C-ERBB-2 (HER2/NEU)) в опухоли желудка с поражением и без поражения регионарных лимфоузлов 65
Глава 5. Оценка выявляемости рака желудка в Ростовском онкологическом институте в период с 2013 по 2016 гг. 79
Глава 6. Способ прогнозирования развития метастазов у пациентов с аденокарциномой желудка на основе ком бинированного молекулярно-генетического (CNV генов NFKB и HER2) и иммуногистохимического (экспрессия белков KI-67 и HER2) подхода 91
Заключение 99
Выводы 110
Практические рекомендации 112
Список сокращений 113
Список литературы 114
- Изменение копийности генов при раке желудка, механизмы и ассоциации с метастазированием
- Изменение копийности 16-ти генетических локусов у больных с аденокарциномой желудка
- Оценка выявляемости рака желудка в Ростовском онкологическом институте в период с 2013 по 2016 гг.
- Способ прогнозирования развития метастазов у пациентов с аденокарциномой желудка на основе ком бинированного молекулярно-генетического (CNV генов NFKB и HER2) и иммуногистохимического (экспрессия белков KI-67 и HER2) подхода
Изменение копийности генов при раке желудка, механизмы и ассоциации с метастазированием
Начиная с 2004 года в многочисленных исследованиях были представлены данные о наличии множества субмикроскопических вариаций числа копий сегментов ДНК – класс известный как структурные вариации (Tuzun E. et al., 2005). Внутри этого класса наибольшей компонентой являются вариации числа копий генов (CNV), которые включают в себя несбалансированные перестройки, увеличивающие или уменьшающие содержание ДНК. На сегодняшний день термином CNV обозначают фрагменты размером, больше, чем 50 б.п.о., тогда как более мелкие элементы относят к вставкам или делециям (Zarrei M. et al., 2015).
Спектр фенотипических эффектов CNV довольно широк – от адаптивных признаков до эмбриональной летальности. Фенотипические эффекты CNV разделяют на адаптивные (CNV в гене, кодирующем альфа-амилазу характеризует возможности адаптации к изменению потребления крахмала в различных экологических условиях) и неадаптивные (например, аутизм, шизофрения, болезнь Крона, ревматоидный артрит, диабет 1-го типа, ожирение и многочисленные заболевания развития) (Mccarroll S.A., Altshuler D.M., 2007).
Изменение числа копий генов (CNV) может быть классифицировано на две основные группы: короткие (порядка 50 б.п.о.) и более длинные повторы. Длинные повторы включают повторы целых генов. Эта классификация, основанная на размере повтора, является наиболее очевидной, так как размер является важным фактором при изучении механизмов, которые его вызвали (Hastings P.J. et al., 2009).
Есть два основных типа молекулярных механизмов для формирования CNV: на основе гомологичной и не негомологичной рекомбинации (Hastings P.J. et al., 2009).
Одной из наиболее широко признанных теорий образования CNV, а также делеций и инверсий является теория неаллельной гомологичной рекомбинации. Этот механизм предполагает, что во время мейотической рекомбинации, гомологичные пары хромосом образуют двухконечные двухцепочечные разрывы, приводящие к формированию обычной структуры Холлидея. Однако, в процессе формирования структуры Холлидея, происходят двухцепочечные разрывы со смещением, и кроссинговер происходит в неаллельной позиции на той же хромосоме. После распада структуры Холлидея неравный кроссинговер осуществит перенос генетического материала между двумя гомологичными хромосомами, и в результате часть ДНК на обеих хромосомах повторится.
Другая разновидность механизма на основе гомологичной рекомбинации, которая может привести к CNV, индуцированными репликацией повреждений ДНК. Когда в геномной ДНК происходит двухцепочечный разрыв, клетка активирует сигнальные пути, которые обеспечивают его восстановление. Ошибки во время восстановления разрыва, подобно неаллельной гомологичной рекомбинации, могут приводить к увеличению числа копий определенного участка генома. Во время восстановления двухцепочечного разрыва поврежденный конец может переместиться на гомологичную хромосому вместо того, чтобы вернуться в исходную. Как и в механизме неаллельной гомологичной рекомбинации, дополнительная копия конкретного региона переносится на другую хромосому, что приводит к дублированию (Bauters M. et al., 2008).
Анализ литературы позволяет сделать заключение о том, что роль CNV в качестве фактора малигнизации тканей желудка была обнаружена в начале 2000-х годов. Так, T. Gnther с соавт. (2000) изучили и показали, что амплификация гена MDM2 при раке желудка приводит к увеличению экспрессии белка MDM2 и понижении экспрессии белка p53. Ген MDM2 – негативный регулятором функции белка р53, он локализован на хромосоме 12. Путь MDM2/P53 является важной составной частью канцерогенеза.
Публикации последних лет показывают, что CNV являются следующим уровнем в полном понимании молекулярного контекста развития опухолевого процесса, включая метастазирование (Andrews J. et al., 2010).
Амлификации генов HER2, CCNE1, MYC, KRAS и EGFR обнаружены в 9, 5, 2, 1 и 1% случаев метастатического рака желудка соответственно (Kim S. et al., 2014).
В работе О.И. Кита с соавт. (2015) показано, что точная характеристика числа копий генов, ответственных за апоптоз, онкогенез, пролиферацию и окислительное фосфорилирование в опухолевых и здоровых тканях желудка пациентов определяет возможность создания предиктивных маркеров малигнизации тканей. Было выявлено, что делеция гена-супрессора р53 и одновременная амплификация противо-апоптотического гена BCL2 характерна для перстневидноклеточного рака. Амплификация гена транскрипционного регулятора MKI67 и делеция генов факторов OCT4 и SOX2 характерна для аденокарцином стадий G1-2. При аденокарциноме стадии G3 обнаруживается делеция 12 генов, включая OCT4, SOX2 и BCL2.
В дополнение к мутациям генов CNV играют важную роль в онкогенезе многих видов рака, таких как рак желудка, рак яичников, печеночно-клеточный рак, колоректальный рак, рак мочевого пузыря и так далее. Накопление CNV во время канцерогенеза желудка может быть результатом отбора, с помощью которого трансформированные клетки получают эволюционное преимущество. Показано, что копии генов-эффекторов апоптоза часто теряются во время развития рака, по сравнению с частой амплификации генов, связанных с пролиферацией (Liang L., Fang J-Y., Xu J., 2015). Недавние исследования выявили многочисленные увеличения (амплификации) и уменьшения (потери) в копийности генов у пациентов с раком желудка, причем амплификации более распространены, чем потери копий. Так же определены участки хромосом, где наблюдаются амплификации – 3p22, 4q25, 8q24, 11p13 и 20q13, и потери копий генов – 1p36 и 9p21, связанных с раком (CTNNB1, MYC, CDKN2A, top2a и так далее) (Deng N. et al., 2012).
CNV являются важными факторами влияния на экспрессию генов, регулирующих деятельность различных онкогенных или опухоль-подавляющих путей. Это может объяснить клиническую значимость многих вариаций числа копий генов при раке желудка. Показано, что у пациентов раком желудка с метастазами в лимфатических узлах имеется заметно больше CNV, чем в случаях без метастазов. Кроме того, в ряде исследований установлено, что частые амплификации наблюдаются на хромосомах 1q, 5p, 7,8, 13 и 20, а потери копий генов наблюдаются на хромосомах 1p, 3p, 4, 5q, 9P, 17р, 18q, 19p, 21 и 22. Хотя большое количество CNV областей было идентифицировано при раке желудка, эта область по-прежнему требует дальнейшего исследования, для определения и других затронутых генов, играющих важные роли в развитии рака желудка (Liang L., Fang J-Y., Xu J., 2015).
CNV ДНК являются значимыми факторами для экспрессии генов, которые в свою очередь могут влиять на деятельность различных онкогенных или опухоль-супрессорных путей (рисунок 1.1).
Ниже рассмотрим информацию об известных CNV генах при раке желудка (таблица 1.1).
Ген PIK3CA, расположенный на хромосоме 3q26.3, часто амплифицирован при раке желудка. Важно отметить, что избыточная экспрессия PIK3CA в результате амплификации гена увеличивает активность PI3-киназы и уровень фосфори-лирования Akt, что способствует пролиферации аберрантных клеток и непосредственно связанно с онкогенезом (Shi J., Yao D., Liu W. et al., 2012). Кроме того, амплификация PIK3CA значительно влияет на общий прогноз при раке желудка, независимо от ранней или поздней стадии опухоли.
Изменение копийности 16-ти генетических локусов у больных с аденокарциномой желудка
В настоящей работе было проведено сравнительное исследование изменения числа копий генов в первичных опухолях желудка без метастазов в лимфатических узлах и с наличием метастазов в них. Изменения копийности выявляли для 15-ти ядерных генов, которые являются участниками ключевых сигнальных путей, регулирующих выживание, рост клетки, метастазирование и устойчивость к химиотерапии (APC, AURKA, CCND1, C-MYC, GKN1, IRX1, HER2, MET, MDM2, NFKB, P53, OCT1, POU5F1B, S6K2 и PIK3CA), и некодирующего локуса HV2 ми-тохондриальной ДНК.
Именно потеря копийности последнего, наиболее часто встречается при новообразованиях различной локализации. Нормализацию полученных результатов количественной RT–qPCR в качестве референсных использовали генетические локусы GAPDH и ACTB.
В исследованной выборке определялись данные по относительной копийно-сти 16-ти генетических локусов для всех пациентов. В таблице 3.1 приведены средние значения относительной копийности в двух исследованных группах аденокарцином желудка.
Согласно рассчитанным показателям случаи аберрантных RCQ не повлияли на средние по группам, значительно не отклонившись от значения «1». Исключения составили локус HV2, копийность которого в опухоли уменьшалась в сравнении с условно нормальной тканью, и онкогены POU5F1B, OCT1, для которых отмечена тенденция увеличения копийности гена (таблица 3.1).
Среднее значение RCQ амплифицированных локусов в группе T3-4N0M0 составило 1,06±0,83 на одного пациента, что меньше того же показателя в группе T3-4N1-3M0 = 2,14±2,2.
В целом, у 42 образцов опухолей желудка (70%) выявлена потеря и/или амплификация хотя бы по одному локусу (таблица 3.1).
Для иллюстрации изменения показателя CNV в двух группах T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0 ниже приведены диаграммы средних значений RCQ и его варьирования по каждому исследованному локусу (рисунок 3.1). В целом прослеживается тенденция большего варьирования дозы большинства локусов в группе с поражением регионарных лимфатических узлов.
Характер распределения значений RCQ на диаграммах 8-ми онкогенов (AURKA, C-MYC, HER2, GKN1, MET, OCT1, POU5F1B, S6K2) и фактора транскрипции NFKB демонстрирует значительное отклонение от «1» вверх в T3-4N1-3M0 группе, что соответствует амплификации данных локусов в опухоли. И, наоборот, при первичной распространенности потеря копийности отражается отклонением вниз RCQ-значений от «1» для супрессоров опухолей APC и P53.
На рисунке 3.2 продемонстрировано, что аберрантное изменение RCQ выявлено для 14-ти исследованных генов. Случаев достоверного изменения копий-ности гена не было определено для АРС и GKN1. Потеря копийности зафиксирована для двух генов, кодирующих опухолевые супрессоры (IRX1 и P53), и в большинстве случаев аберрантного изменения RCQ некодирующего локуса мтДНК. Для 14-ти онкогенов была характерна амплификация, за исключением одного образца опухоли с метастазами в регионарные лимфатические узлы, которая проявила себя потерей копийности локуса CCND1, кодирующего белок цик-лин D1, и локуса NFKB, кодирующего транскрипционный фактор.
В 20-ти (34%) образцах первичных опухолей желудка, выявлена потеря копийности некодирующего локуса HV2 митохондриальной ДНК, а в трх случаях локус HV2 был амплифицирован по сравнению с нормальной тканью желудка. Условно генетические локусы, которые использовались при выполнении данной работы, делятся на группу, редко встречающихся в выборке (менее 10%), такие как, – MDM2, P35, IRX1, MET, AURKA, S6K2, PIK3CA, и на группу «мажорных» маркеров, таких как, – NFKB, C-MYC, HER2, CCND1, POU5F1B, HV2, OCT1.
При сравнении двух выделенных групп аденокарцином случаи аберрантных RCQ чаще встречали в образцах опухолей с метастазами в лимфоузлы (рисунок 3.3). Характер распределения частот изменений копийности в двух группах также был разным.
Отметим, что изменения в семи из 16-ти локусов были выявлены только в группе T3-4N1-3M0 – это утрата копийности двух опухолевых супрессоров P53, IRX1; а также амплификации четырх онкогенов AURKA, MDM2, MET, S6K2; амплификации или потери транскрипционного фактора NFKB (рисунок 3.3, таблица 3.1).
Данные корреляционного анализа выявили прямые статистически достоверные ассоциации между амплификацией четырех онкогенов C-MYC, HER2, NFKB, POU5F1B и метастазированием в регионарные лимфатические узлы (р=0,026; 0,009; 0,011; 0,009, соответственно), а также между амплификацией указанных онкогенов и дифференцировкой опухоли (р=0,042; 0,014; 0,023; 0,016, соответственно).
В группе с метастазами в регионарные лимфатические узлы статистически достоверно коррелировала амплификация генов POU5F1B и C-MYC (R=0,809, р 0,01), которые локализуются рядом на 8q24 хромосоме.
В таблице 3.2. приведено распределение случаев аберрантного изменения относительной копийности по локусам в зависимости от ряда клинико-патологических показателей.
В исследованной выборке изменение копийности гена CCND1 отмечено только для мужчин, однако описанная тенденция влияния пола на частоту указанного аберрантного изменения не достигла статистической значимости (р=0,053).
Согласно полученным данным (см. таблицу 3.1), выявлена тенденция амплификации двух локусов POU5F1B и AURKA в опухолях с низкой степенью дифференцировки G3 по сравнению с опухолями средней степени дифференци-ровки G2-3 (p=0,070 и p=0,074, соответственно).
Два генетических локуса NFKB и POU5F1B статистически достоверно чаще были амплифицированы в группе с метастазами в регионарных лимфоузлах (2=10,6 и 2=6,7, соответственно, р 0,01). В группе с метастазами в регионар ные лимфатические узлы частота амплификации NFKB составила 30%, POU5F1B – 34%, а в группе без метастазов амплификация POU5F1B идентифи цирована только в 6% опухолей, а изменений RCQ локуса NFKB не было зафик сировано. Отмечена потенциальная информативность для идентификации группы с регионарным метастазированием следующих маркеров: амплифици рованный в 17% случаев HER2 (2=3,27; p=0,071) и редко встречающихся P53, MDM2 (2=3,16; p=0,076) и IRX1, AURKA (2=4,29; p=0,057).
Ранее обсуждалось уменьшение числа копий мтДНК, определяемое по относительной копийности локуса HV2, в образцах рака желудка с различными гистологическими типами, относительно нормальных клеток и при снижении дифференцировки опухолевых клеток (Кит О.И. и соавт., 2015). Тенденция уменьшения числа копий митохондриальных генов, подобна известному эффекту Варбурга – малигнизированные клетки переходят в режим преимущественного использования гликолиза (Scatena R., 2012), отмечена и в настоящем исследовании, но данный маркер не идентифицировал опухоли с метастазами в регионарных лимфоузлах. Частота уменьшения числа копий локуса HV2 митохондриаль-ной ДНК в группе без метастазов в регионарных лимфатических узлах составила 39% против 34% в группе с метастазами в них, при этом в последней имели место два случая амплификации локуса HV2. Полученные данные свидетельствуют о повышении копийности митохондриальной ДНК у пациентов с метастазами в регионарных лиматических узлах, что объясняется переходом клетки в аэробный режим, чтобы обеспечить их распространения из первичного очага в другие органы (Scatena R., 2012).
Оценка выявляемости рака желудка в Ростовском онкологическом институте в период с 2013 по 2016 гг.
В 2015 г. в Российской Федерации впервые в жизни выявлен 589 341 случай злокачественных новообразований (в том числе 270 046 и 319 335 у пациентов мужского и женского пола соответственно). Прирост данного показателя по сравнению с 2014 г. составил 4,0% (Каприн А.Д., Старинский В.В., 2016), а по сравнению с 2013 г. – 5,8% (1,8% за счет Крымского ФО).
Рак желудка является одной из ведущих локализаций, занимая 6 место в структуре злокачественных новообразований – 6,2% в 2015 г. против 8 места в 2014 г. – 4,2%. Распространенность рака желудка на 100 тыс. населения составила в 2013 г. – 91,4, в 2014 г. – 95,2, в 2015 г. – 95,3 (Каприн А.Д., Старинский В.В., 2016). В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужского населения России рак желудка занимает 4 место, в структуре женского населения – 5 место. По данным 2015 г. в возрастной группе 30–59 лет рак желудка занимает 6 место (5,2%), а в возрасте 60 лет и старше – 5 место (7,2%).
Очевидно, что в период с 2013 по 2015 гг. заболеваемость раком желудка по России остается достаточно стабильной (таблица 5.1, 5.2).
В структуре заболеваемости населения Ростовской области раком желудка сложились определенные тенденции. Это связано с прогрессивным снижением заболеваемости мужчин данной патологией. «Грубый» относительный показатель заболеваемости снизился с 27,15 в 2013 г. до уровня 23,15 в 2015 г. «Стандартизованный» относительный показатель заболеваемости снизился с 17,74 в 2013 г. до уровня 14,64 в 2015 г. (таблица 5.3).
Однако относительно значений по Южному федеральному округу показатели заболеваемости мужчин Ростовской области остаются повышенными (таблица 5.4).
Заболеваемость женщин раком желудка в Ростовской области остается относительно стабильной в период 2013–2015 гг. (таблица 5.5), а по Южному федеральному округу показатели прогрессивно снижаются (таблица 5.6).
Проведя анализ стандартизованных показателей заболеваемости раком желудка по Южному Федеральному округу (к которому относится Ростовская область), можно говорить о среднем уровне заболеваемости по сравнению с Центральным и Северо-Западным округам, относящимся к территориям с высоким уровнем заболеваемости.
В ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России с 2013 по 2016 гг. был прооперирован 981 больной раком желудка основных морфологических типов, из них: аденокарцинома – 593 больных, муцинозная аденокарцинома – 60 больных, недифференцированный рак – 102 больных и перстневидно-клеточный рак – 226 больных.
Распределение больных по возрасту представлено в таблице 5.7. Наибольшее количество больных было в диапазоне возраста 60–69 лет – 34,4%, далее следуют диапазоны 50–59 лет – 29% и 70–79 лет – 22,5%. Женщин было 37,5%, мужчин 62,5% (таблица 5.8). Больных раком желудка с метастазами за отчетный период было 274: женщин 126, мужчин – 148.
Наибольшее количество больных раком желудка с метастазами было при недифференцированном раке – 31,4% и перстневидно-клеточном раке – 31,4%, далее следовал муцинозный рак – 28,3% и аденокарцинома – 26,5%. Данные по годам представлены в таблице 5.9
Факторы риска развития рака желудка
Факторы, которые способствуют развитию рака желудка, достаточно многообразны. Главную группу причин составляют особенности питания и окружающей среды. В большинстве западных стран снижение заболеваемости раком желудка связывают с улучшением условий жизни, соблюдением норм пищевой культуры, своевременным лечением хронического гастрита, внедрением новых методов ранней диагностики (Хирургические болезни, 2002).
В России снижение заболеваемости раком желудка ряд авторов также связывают с повышением социально-экономического состояния населения, что отразилось на оптимизации алиментарного фактора, а также, возможно, привело к снижению НВ-инфицированности (Заридзе Д.Г., 2001; Чиссов В.И. и соавт., 2011).
Однако в снижении заболеваемости сыграли роль не только этиологические факторы, но также причины, которые пока учитываются недостаточно.
В клинической онкологии широкое распространение получила концепция развития рака различной локализации основанная на факторах и группах риска. Углубленному исследованию подлежали люди с повышенным риском онкологической заболеваемости, определяемому по разработанным критериям отбора, составляющих так называемые «группы риска». К этим группам относят люди, среди которых воздействия установленных для каждой локализации факторов повышает риск возникновения рака определенного типа, чем в общей популяции. Фундаментальными факторами риска, которые увеличивают заболеваемость различными злокачественными новообразованиями, являются: загрязнение окружающей среды, генетические, эндокринные, возрастные, профессиональные факторы и их сочетание, табакокурение, алкоголизм, алиментарные предпочтения, фоновые заболевания и др. При этом клинические симптомы па-тогномоничные для опухоли, к указанным факторам риска не имеют никакого отношения (Бохман Я.В., 1985).
Для поиска факторов риска, основными подходами считаются изучение этиопатогенетических особенностей заболевания, эпидемиологический анализ, ретроспективное изучение медицинской документации онкологических больных.
Способ прогнозирования развития метастазов у пациентов с аденокарциномой желудка на основе ком бинированного молекулярно-генетического (CNV генов NFKB и HER2) и иммуногистохимического (экспрессия белков KI-67 и HER2) подхода
Рак желудка занимает одно из ведущих мест в общей структуре онкологических заболеваний в России (Каприн А.Д. и соавт., 2017). Аденокарцинома желудка составляет 95% от общего числа злокачественных новообразований данного органа (Dicken B.J. et al., 2005), а метастазы выявляются у 90% больных, при этом выживаемость составляет 65% на ранней стадии заболевания и менее 15% в случае поздней диагностики онкологического процесса (Takuji G. et al., 2000). Поэтому разработка способа прогнозирования развития метастазов у пациентов с аденокарциномой желудка на основе комбинированного молекулярно генетического и иммуногистохимического подхода является актуальной задачей.
Изменение копийности генов (Copy Number Variation или CNV) – один из основных механизмов контроля опухолевой клеткой экспрессии генов, которые являются ключевыми для выживания и малигнизации. CNV представляют собой критические генетические события, которые способствуют развитию и прогрес-сированию злокачественных новообразований у человека (Кит О.И. и соавт., 2015).
С-erbB-2 (HER2/neu) – обладает тирозинкиназной активностью и является представителем семейства гомологичных трансмембранных рецепторов эпи-дермального фактора роста. Белок с-erbB-2, не имеет собственного лиганда, но тем не менее взаимодействуя с другими рецепторами усиливает функционирование всей системы (Harari D. et al., 2015). При изучении аденокарциномы пищевода отмечается отрицательный прогностический эффект при избыточной экспрессии HER2 (McCormick Matthews L.H. et al., 2015).
Область исследования экспрессии HER2 в последнее время значительно расширилась, охватив такие нозологии как рак молочной железы, рак желудка и рак пищевода. В настоящее время проводится проспективное клиническое исследование. Первичные результаты свидетельствуют о том, что чувствительность и специфичность для диагностики аденокарциномы пищевода составляют 88,0 и 100,0%, соответственно, при одновременном гистохимическом определении HER2, c-myc, и анеуплоидии (Tan C., Qian X., Guan Z. et al., 2016). Единого мнения о прогностической ценности гиперэкспрессии белка HER2 при РЖ пока нет (Song Y., 2010). Подавляющее большинство исследований показывают, что избыточная экспрессия c-erbB-2 ассоциирована с неблагоприятным прогнозом заболевания и может служить прогностическим показателем для инвазивных характеристик опухоли и метастазирования в лимфатические узлы (Zhang X.L. et al., 2009).
Особое значение в прогнозировании поведения опухоли придают ее проли-феративной активности. Наиболее распространенным маркером пролиферации является регуляторный белок Ki-67. Несмотря на общее использование Ki-67 для индексации клеточной пролиферации, его прогностическая значимость при плоскоклеточном раке пищевода остается неубедительной. В трех исследования, включавших в общей сложности 192 пациента, наблюдался незначительный прогностический эффект (McCormick Matthews L.H. et al., 2015). Напротив, исследование, проведенное C. Sittel et al. (2000), показало, что высокая экспрессия Ki-67 является неблагоприятным фактором в прогнозе течения и общей безрецидивной выживаемости.
Транскрипционный фактор NFB (ядерный фактор «каппа-би») контролирует экспрессию генов апоптоза, клеточного цикла и иммунного ответа. Нарушение регуляции NFB вызывает аутоиммунные заболевания, воспаление, а также развитие рака. Так как одним из важных свойств NFB является его способность защищать клетку от апоптоза, гены его субъединиц относят к протоонкогенам. (Staudt L.M., 2010).
Поэтому в качестве маркеров для прогнозирования вероятности развития метастазов в лимфоузлы у пациентов с диагнозом аденокарцинома желудка адекватно комбинированное использование показателей относительной копийности генов NFKB и HER2 и иммуногистохимической экспрессии белков Ki-67 и HER2. Анализ патентных источников показал наличие близких по тематике способов:
1) «Способ прогнозирования продолжительности жизни онкологических больных после радикальных операций» (Заявка: 94005926/14, 10.02.1994): на основе определения онкологических индексов - измерения антропометрических данных и характеристик опухоли, показателей общего и биохимического анализов крови.
2) «Способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка» (Заявка: 2010132604/15, 03.08.2010): на основе иммуногистохимического исследования, маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркеров апоптоза р53, bcl-2 у больных раком желудка.
Описанные способы используют в анализе методы, принципиально отличающиеся от нашего, обладающие меньшей чувствительностью или специфичностью, чем предлагаемый нами, сочетающий комбинацию молекулярно-генетического и иммуногистохимического подходов.
Разработанный нами способ является экономически оправданным, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР+ИГХ), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами (парафиновыми блоками), регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 8 часов.
Сущность заявляемого способа заключается в том, что геномную ДНК экстрагируют из образцов тканей желудка и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для генов NFKB и HER2, и В2М, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (RCQ) по формуле 2"ACt, где Ct=(Ct (исследуемого гена) - Ct (В2М)), нормализуя относительно RCQ здоровой ткани желудка. Параллельно проводится иммуногистохимическое исследование с помощью моноклональных антител к Ki-67 и HER2. Затем сравнивают полученные значения RCQ с прогностическими значениями копийности, и при значениях RCQ M 0,8±0,02 и RCQHER2 1,1±0,08 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка KI67игх 35,6±6,1 и негативной экспрессией HER2игх (-) прогнозируют отсутствие метастазов (чувствительность 75%), а при значениях RCQM 0,9±0,01 и RCQHi?2 2,0±0,1 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка KI67игх 54,2±4,9 и позитивной экспрессией HER2игх (+++) прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 70%).
Заявленный анализ основан на определении количества копий генов NFKB и HER2 относительно референсного локуса В2М (-2 микроглобин) в опухолевой ткани желудка, и последующем сравнении полученных значений с интервалом копийности RCQ ткв и RCQ HER2, характерным для развития метастазов или их отсутствия, а также на иммуногистохимическом определении экспрессии белков Ki-67 и HER2 и сравнении полученных значений с показателями ИГХ (Ki-67 и HER2), характерными для развития метастазов или их отсутствия.
Заявленный способ включает следующие приёмы:
выделение тотальной ДНК из тканевых проб или из парафиновых блоков с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;
определение относительной копийности генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной ДНК;
анализ первичных данных с помощью программного продукта ам-плификатора;
расчт относительной копийности гена (RCQ) на основании соотношения сигналов, которые продуцируются амплификатами изучаемой и референс-ной последовательностей,
сравнение RCQ пробы с прогностическими значениями копийности RCQ стандарт, определенными для больных раком желудка с метастазами или без метастазов в лимфоузлах.
иммуногистохимическое исследование с помощью моноклональных антител к Ki-67 и HER2.
сравнение полученных значений с показателями ИГХ (Ki-67 и HER2) характерными для развития метастазов или их отсутствия
Заявляемый способ осуществляется следующим образом
На первом этапе отбираются образцы опухолевых тканей из операционного или биопсийного материала. Для транспортировки в лабораторию и хранения образцы замораживаются в жидком азоте.
Фрагменты ткани измельчаются скальпелем и/или ножницами, затем растираются в фарфоровых ступках в присутствии лизирующего SDS-содержащего буфера. К лизатам добавляется протеиназа К и инкубируется при t=56С в течение одного часа.