Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Наследственный рак молочной железы 12
1.1. Механизм развития и клинико-морфологические характеристики наследственного РМЖ 12
1.2. Гены предрасположенности к РМЖ 14
1.2.1. BRCA1 и BRCA2 14
1.2.2. CHEK2 15
1.2.3. ТР53 17
1.2.4. PTEN 17
1.2.5. STK11 18
1.2.6. RAD51С 18
1.2.7. CDH1 19
1.2.8. PALB2 (FANCN) 19
1.2.9. ATM 21
1.2.10. BRIP1( FANCJ) 22
1.2.11. NBN 22
1.2.12. BLM 23
1.2.13. MLH1, MSH2 24
1.2.14. MUTYH 25
1.3. Секвенирование «нового поколения» (NGS) как метод диагностики наследственного РМЖ 25
1.3.1. Технологии NGS 26
1.3.2. Применение NGS для молекулярно-генетического обследования больных РМЖ 28
1.4. Применение результатов молекулярно-генетического исследования в клинической практике 32
1.4.1. Профилактика BRCA-ассоциированного РМЖ 32
1.4.2. Лечение BRCA-ассоциированного РМЖ 34
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Алгоритм обследования и характеристика группы 38
2.2. Выделение геномной ДНК 41
2.3. Метод ПЦР в режиме реального времени 42
2.4. Метод секвенирования «нового поколения» (NGS) 42
2.5. Секвенирование по Сенгеру 48
2.6. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты и обсуждение 50
3.1. Анализ мутационного статуса генов предрасположенности к развитию онкологических заболеваний в группе больных РМЖ 50
3.1.1. BRCA-ассоциированный РМЖ 50
3.1.1.1. Анализ спектра и частоты распространенных в популяции мутаций в генах BRCA1/2 в группе больных РМЖ (метод ПЦР) 50
3.1.1.2. Анализ спектра и частоты редких мутаций в генах BRCA1/2 в группе больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания (метод NGS) 55
3.1.2. Анализ спектра и частоты мутаций в гене CHEK2 58
3.1.2.1. Анализ спектра и частоты распространенных в популяции мутаций в гене CHEK2 в группе больных РМЖ (методы ПЦР и NGS) 58
3.1.2.2. Анализ спектра и частоты редких мутаций в гене CHEK2 в группе больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания (метод NGS) 63
3.1.3. Анализ спектра и частоты мутаций в других генах предрасположенности к развитию онкологических заболеваний в группе больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания (метод NGS) 64
3.1.4. Двойная и тройная гетерозиготность по мутациям в генах предрасположенности к развитию РМЖ 70
3.2. Анализ мутационного статуса генов предрасположенности к развитию онкологических заболеваний в группе пациентов с доброкачественными новообразованиями и доброкачественной дисплазией молочной железы 71
3.2.1. Анализ спектра и частоты мутаций в генах BRCA1/2 в обследованной группе больных с доброкачественными новообразованиями и доброкачественной дисплазией молочной железы (методы ПЦР и NGS) 71
3.2.2. Анализ спектра и частоты мутаций в гене CHEK2 в обследованной группе пациентов с доброкачественными новообразованиями и доброкачественной дисплазией молочной железы (методы ПЦР и NGS) 75
3.2.3. Анализ спектра и частоты мутаций в других генах предрасположенности к развитию онкологических заболеваний в группе больных с доброкачественными новообразованиями и доброкачественной дисплазией молочной железы (метод NGS) 79
3.3. Оптимизация алгоритма молекулярно-генетического обследования больных РМЖ для выявления наследственного характера заболевания 81
Заключение 86
Выводы 94
Практические рекомендации 95
Список литературы 97
- Применение NGS для молекулярно-генетического обследования больных РМЖ
- Анализ спектра и частоты распространенных в популяции мутаций в генах BRCA1/2 в группе больных РМЖ (метод ПЦР)
- Анализ спектра и частоты мутаций в других генах предрасположенности к развитию онкологических заболеваний в группе больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания (метод NGS)
- Оптимизация алгоритма молекулярно-генетического обследования больных РМЖ для выявления наследственного характера заболевания
Введение к работе
Актуальность проблемы
На сегодняшний день рак молочной железы (РМЖ) является наиболее частой формой онкологического заболевания среди женского населения. Во всех странах мира, в первую очередь, в экономически развитых странах, начиная с 80-х годов прошлого столетия, наблюдается ежегодный рост заболеваемости РМЖ. В России в 2016 году было выявлено 68,2 тыс. новых случаев заболевания РМЖ (Каприн А.Д. и соавт., 2017), в то время как в 2015 году было зарегистрировано 66,4 тыс. случаев заболевания РМЖ (Каприн А.Д. и соавт., 2016).
Известны и достаточно хорошо изучены этиологические факторы, предрасполагающие к развитию РМЖ, среди которых ведущую роль отводят гормональным и генетическим ( 2014).
По отношению к генетическим факторам выделяют следующие формы РМЖ (Имянитов Е.Н., 2010):
спорадический рак, наиболее часто встречающаяся форма, при которой у обоих родителей заболевшей женщины в двух поколениях отсутствует РМЖ и/или РЯ (рак яичников);
семейный рак, который регистрируют в тех случаях, когда РМЖ и/или РЯ наблюдается у одного или нескольких кровных родственников;
наследственный рак, характеризующийся наличием герминальных мутаций, ответственных за возникновение РМЖ, который составляет 5-10% всех случаев заболевания РМЖ.
«Этиопатогенетический механизм развития наследственного рака молочной железы» обусловлен мутациями в определенных, специфических для РМЖ, генах (Бит-Сава Е.М., 2015). Нарушения в данных генах предопределяют риск развития заболевания у их носителей и, соответственно, предрасположенность к развитию РМЖ. Поэтому, в отличие от спорадических форм РМЖ, прогноз возникновения заболевания у женщин из семей с онкологически отягощенным семейным анамнезом может быть сделан задолго до возникновения заболевания.
BRCA1 и BRCA2 - хорошо известные гены предрасположенности, ассоциированные с
высоким риском развития РМЖ, кодирующие белки, которые играют существенную роль в
поддержании стабильности генома, в частности, в процессах репарации ДНК (Gudmundsdottir
K., Ashworth A., 2006). В многочисленных исследованиях было убедительно
продемонстрировано, что наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 связано с высоким риском развития РМЖ. Для носителей мутаций в гене BRCA1 средние кумулятивные риски развития заболевания в возрасте 70 лет составляют 57-65%, для носителей мутаций в гене BRCA2 - 45-49%. Наличие онкологически отягощенного семейного анамнеза приводит к увеличению рисков до 87% - у носителей мутаций в гене BRCA1, до 84% - у носителей мутаций в гене BRCA2 (Любченко Л.Н. и соавт., 2013).
Примечательно, что только в 20-30% случаев семейного РМЖ выявлены мутации в генах BRCA1 и BRCA2 (Соколенко А.П. и соавт., 2010). Поэтому в настоящее время усилия ученых направлены на идентификацию других генов наследственного рака молочной железы, а также выявление новых клинически значимых вариантов в известных генах предрасположенности к онкологическим заболеваниям.
По крайней мере, небольшая часть генов, ассоциированных с повышенным риском возникновения РМЖ, идентифицирована и проводится их исследование. Это гены, вовлеченные в процесс репарации, регуляцию клеточного цикла, апоптоз, дифференцировку клеток, т.е. отвечающие за поддержание стабильности генома (TP53, STK11, PTEN, ATM, CHEK2, BRIP1, PALB2 и другие).
Диагностика наследственного рака создает принципиально новую ситуацию для
профилактики онкологических заболеваний. В связи с открытием генов предрасположенности к
онкологическим заболеваниям, а также внедрением в практику новых высокопроизводительных
молекулярно-генетических методов, появилась реальная возможность проводить генетическое
тестирование и выделять группы пациентов с высоким риском развития заболевания для
проведения лечебно-профилактических мероприятий, а также выявлять здоровых
родственников – носителей мутантных генов. С другой стороны, диагностика наследственного характера заболевания позволяет повысить эффективность лечения больных благодаря персонифицированному подходу.
Степень разработанности темы
По данным многочисленных исследований установлено, что наследственные формы РМЖ обусловлены в основном мутациями в генах BRCA1, BRCA2 и CHEK2. Наиболее характерные для нашей популяции генетические изменения: 5382insC, 185delAG, 300T>G, 2080delA, 3819delGTAAA, 4153delA, 3875delGTCT (BRCA1); 6174delT (BRCA2); c.1100delC, с.441+1G>A, c.470T>C (CHEK2) были включены в стандартные клинико-диагностические панели, с помощью которых методом ПЦР можно быстро и относительно недорого определять генетические полиморфизмы, ассоциированные с повышенным риском развития онкологического заболевания (Батенева Е.И., 2015).
Однако использование готовых панелей для подтверждения генетического характера заболевания может приводить к некоторому числу ложноотрицательных результатов из-за наличия редких генетических повреждений в генах BRCA1, BRCA2 и CHEK2, а также возможных повреждений в других генах предрасположенности, выявить которые можно только при анализе всей нуклеотидной последовательности кодирующих регионов данных генов. Использование высокопроизводительного метода секвенирования «нового поколения» (NGS) позволяет решить данную задачу, но высокая стоимость исследования не позволяет
использовать его в качестве рутинного метода, заменяющего метод ПЦР в ежедневной молекулярно-генетической диагностике.
Поэтому в настоящее время необходимо разработать алгоритм обследования больных РМЖ в российской популяции, который позволит оптимизировать использование двух данных методов в клинической практике для достижения максимальной эффективности выявления наследственного характера заболевания при минимизации затрат на проведение молекулярно-генетического исследования.
Цель исследования
Повышение эффективности выявления наследственного характера заболевания у больных раком молочной железы с использованием метода секвенирования «нового поколения».
Задачи исследования
-
Проанализировать спектр и частоту наиболее распространенных в российской популяции и редких наследственных мутаций в генах BRCA1/2 у больных РМЖ с помощью методов ПЦР и секвенирования «нового поколения»;
-
Оценить спектр и частоту распространенных в российской популяции и редких наследственных мутаций в гене СНЕК2 у больных РМЖ с помощью методов ПЦР и секвенирования «нового поколения»;
-
Изучить спектр и частоту наследственных мутаций в других генах предрасположенности к онкологическим заболеваниям методом секвенирования «нового поколения» у больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания;
-
Оценить спектр и частоту наследственных мутаций в генах предрасположенности к развитию онкологических заболеваний у пациентов с доброкачественными новообразованиями и доброкачественной дисплазией молочной железы;
-
Оптимизировать алгоритм молекулярно-генетического обследования больных РМЖ для выявления наследственного характера заболевания.
Научная новизна исследования Впервые в России проведено молекулярно-генетическое обследование больных РМЖ и пациентов с доброкачественными новообразованиями молочной железы и доброкачественной дисплазией молочной железы с использованием панели «TruSight Cancer» («Illumina», США), предоставляющей возможность анализировать последовательность 94 генов предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Показана высокая эффективность применения метода секвенирования «нового поколения» для выявления редких наследственных мутаций, связанных с развитием РМЖ.
Впервые при обследовании больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания выявлена высокая частота редких патогенных и вероятно патогенных мутаций в генах BRCA1/2 (14%) и СНЕК2 (1,6%), ранее не описанных в российских исследованиях.
Впервые у больных РМЖ выявлены ранее не описанные в российской популяции патогенные мутации в других генах предрасположенности к онкологическим заболеваниям: c.431_432insA (ATM), c.l72_175delTTGT (PALB2), c.H87G>A (MUTYH), c.l703_1704delTT (ERCC2), c.llOOOG (ERCC3), C.57910T (FANCM), c.4delG (PTCH1) и c.952G>A (MITF).
Практическая и теоретическая значимость исследования
Результаты исследования, полученные методом ПЦР в режиме реального времени с использованием стандартной диагностической панели, позволяющей выявлять наиболее распространенные в популяции мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2, а также методом секвенирования «нового поколения» (NGS), позволили оптимизировать алгоритм молекулярно-генетического обследования больных РМЖ для выявления наследственного характера заболевания.
Внедрение в клиническую практику технологии секвенирования «нового поколения» (NGS) позволило идентифицировать редкие патогенные варианты в генах предрасположенности к онкологическим заболеваниям и, соответственно, повысить эффективность диагностики наследственного характера заболевания. В первую очередь, это касается повышения эффективности выявления BRCA-ассоциированного РМЖ, т.к. на сегодняшний день клинические рекомендации Ассоциации онкологов России по профилактике и лечению наследственного рака молочной железы в основном относятся к носителям мутаций в генах BRCA1 и BRCA2.
Выявление наследственного характера заболевания, в свою очередь, позволяет назначать адекватное лечение больным РМЖ.
Методы и методология научного исследования
Настоящее научное исследование выполнено на базе лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Для обоснования актуальности изучаемой проблемы и цели исследования был проведен теоретический анализ и обобщение данных отечественной и зарубежной литературы.
Работа основана на анализе результатов молекулярно-генетического обследования 3826 больных РМЖ и 1213 пациентов с доброкачественными новообразованиями и
доброкачественной дисплазией молочной железы, проходивших обследование и лечение в ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России с 2008 по 2016 годы.
В исследовании использовались апробированные молекулярно-генетические методы: метод
ПЦР в режиме реального времени, метод секвенирования «нового поколения», метод
секвенирования по Сенгеру, а также ретроспективный анализ клинических данных и
статистические методы обработки.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Внедрение метода NGS в клиническую практику позволяет повысить эффективность выявления наследственного характера заболевания у больных РМЖ;
-
Технология NGS предоставляет возможность выявлять и изучать редкие и новые мутации, связанные с предрасположенностью к развитию РМЖ.
Личный вклад автора
В диссертации представлены результаты исследования, проведенного при
непосредственном участии автора. Непосредственно автором определены цель, задачи и
основные положения, выносимые на защиту, проанализирована отечественная и зарубежная
литература по исследуемой проблеме, собрана часть клинического материала, проведено
молекулярно-генетическое обследование части пациентов методом ПЦР для выявления
распространенных в популяции мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2, проведено молекулярно-
генетическое обследование 193 больных РМЖ и 60 пациентов с доброкачественными
новообразованиями и доброкачественной дисплазией молочной железы методом
секвенирования «нового поколения» с использованием панели, предоставляющей возможность анализировать последовательность 94 генов предрасположенности к онкологическим заболеваниям, обработаны и проанализированы полученные данные, сформулированы выводы и практические рекомендации, написана и оформлена рукопись.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 10 апреля 2017 г. на совместном заседании научно-практической конференции и совета по апробациям кандидатских диссертаций ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России.
Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на следующих российских конгрессах, научно-практических конференциях и форумах: Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014г.), Конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н.В. Васильева (Томск, 2014г.), I Ежегодный конгресс Российского общества онкомаммологов (РООМ) (Сочи, 2014г.), XVIII Российский Онкологический Конгресс (Москва, 2014г.), Мультидисциплинарный Форум РООМ по диагностике и лечению РМЖ в Северо-
Кавказском и Южном Федеральном округе. Пятое мероприятие РООМ (Пятигорск, 2015г.), IV Всероссийская научно-практическая конференция по геномному секвенированию NGS-2016 (Москва, 2016г.), II Петербургский Онкологический Форум «Белые ночи 2016» (Санкт-Петербург, 2016г.), IV Российский Конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2017г.), Конференция «Опухолевые маркеры: фундаментальные и клинические аспекты» (Горно-Алтайск, 2018г.).
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практическую деятельность лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 15 печатных работ, включая 4 статьи, 3 из которых опубликованы в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций, и 11 публикаций в материалах российских научно-практических конференций, конгрессов и форумов.
Объем и структура диссертации
Применение NGS для молекулярно-генетического обследования больных РМЖ
Определение наследственного характера онкологического заболевания является важным условием для назначения адекватного лечения пациентов, а выявление мутаций в данных генах у здоровых людей позволяет оценить риск возникновения заболевания в течение жизни и проводить профилактические мероприятия с целью его ранней диагностики.
Обнаружение герминальных мутаций в высокопенетрантных генах BRCA1 и BRCA2, играющих существенную роль в поддержании стабильности генома [72, 110], имеет огромное значение для выбора индивидуальной схемы лечения больных РМЖ, включающей профилактические операции, использование цитостатиков и PARP-ингибиторов [68, 82, 96, 105]. Однако только в 20-30% случаев семейных РМЖ выявлены мутации в генах BRCA1 и BRCA2 [17]. Поэтому в настоящее время усилия ученых направлены на идентификацию других генов НРМЖ, а также новых генетических вариантов, ассоциированных с повышенным риском развития РМЖ, в уже известных генах предрасположенности. Выявление изменений в высокопенетрантных и среднепенетрантных генах, ассоциированных с данной онкопатологией, имеет большое значение для оценки риска возникновения рецидива или онкологической патологии с другой локализацией.
В настоящее время для анализа генов, ассоциированных с наследственными онкологическими заболеваниями, широко используется метод генетического тестирования по Сенгеру, который считается «золотым» стандартом для выявления генетических нарушений [161]. Однако данный метод удобен только для поиска известных, наиболее распространенных мутаций, и не подходит для секвенирования большого числа генов целиком из-за своей низкой производительности и высокой стоимости данного исследования. Секвенирование «нового поколения» позволяет обнаружить редкие генетические варианты и протестировать одновременно большое число генов предрасположенности к развитию онкологических заболеваний на наличие в них клинически значимых мутаций в короткие сроки, в отличие от традиционных молекулярно-генетических методов. Поэтому в настоящее время метод NGS все чаще используется для выявления наследственного характера заболевания, а также поиска новых биомаркеров.
В исследовании Kurian и соавт. с использованием таргетной панели, включающей 42 гена предрасположенности к развитию онкологических заболеваний, была обследована группа из 198 больных РМЖ. В группе больных (141), характеризующейся отсутствием мутаций в генах BRCA1/2, были найдены 16 клинически значимых мутаций в генах: ATM, BLM, CDH1, CDKN2A, MLH1, MUTYH, NBN, PRSS1 и SLX4. 11 вариантов предварительно встречались в литературе, а 5 – были идентифицированы впервые. Стоит отметить, что 80% носителей мутаций имели семейный онкологический анамнез [88]. Tung и соавт., используя панель, состоящую из 25 генов предрасположенности, провели обследование группы, состоящей из 1781 больного РМЖ. Мутации были обнаружены в 16 генах (в основном, в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, ATM, и PALB2). У 9,3% больных были выявлены мутации в генах BRCA1/2, 3,9% больных имели мутацию в другом гене, ассоциированном с повышенным риском развития РМЖ, и у 0,3% больных были обнаружены клинически значимые варианты в других генах предрасположенности. Причем, у 7 больных были идентифицированы мутации в генах, ассоциированных с синдромом Линча [157].
Исследование Maxwell и соавт. было проведено с помощью панели, включающей 22 гена предрасположенности, в группе, состоящей из 278 больных РМЖ с ранним возрастом манифестации заболевания (до 40 лет), характеризующихся отсутствием мутаций генах BRCA1/2. У 31 больного (11%) был найден, по крайней мере, один патогенный или вероятно патогенный вариант. У 7 больных (2,5%) были выявлены мутации в генах TP53 (4), CDKN2A (1), MSH2 (1) и MUTYH (двойная гетерозигота), у 24 (8,6%) – патогенные или вероятно патогенные варианты в генах CHEK2 и ATM [100].
Lin и соавт. разработали панель, состоящую из 68 генов предрасположенности, и протестировали 133 больных РМЖ с ранним возрастом манифестации заболевания или семейным онкологическим анамнезом на наличие наследственных мутаций. У 23% больных были выявлены клинически значимые варианты: у 15% - в генах BRCA1/2, у 8% - в генах RAD50, TP53, ATM, BRIP1, FANCI, MSH2, MUTYH, и RAD51C. Больные РМЖ, характеризующиеся трижды негативным подтипом опухоли, имели более высокую частоту мутаций (45.5%, p=0.025) [92].
Lhota и соавт. представили исследование с использованием 581-генной панели для обследования 325 больных РМЖ, предварительно отобранных по признаку отсутствия мутаций в генах BRCA1/2 и PALB2. У 105 больных (32%) были выявлены 127 клинически значимых вариантов. Причем у 19 больных были обнаружены по несколько мутаций. 46 патогенных вариантов в 25 генах, отвечающих за репарацию, были выявлены у 41 больного (12%), включая 16 вариантов в генах анемии Фанкони. Наиболее часто встречалась мутация c.1096_1099dupATTA в гене FANCL, ассоциированная, как было показано, с повышенным риском развития РМЖ. 81 клинически значимый вариант был идентифицирован в 48 генах, не связанных с репарацией, у 74 больных (23%), включая 16 больных с мутацией в генах метаболизма эстрогена, которые могут быть новыми генами-кандидатами, отвечающими за предрасположенность к развитию РМЖ [91].
Couch и соавт. провели исследование с помощью 17-генной панели в группе из 1824 больных РМЖ, имеющих трижды негативный молекулярный подтип опухоли и характеризующихся отсутствием семейного онкологического анамнеза. Патогенные варианты были найдены у 14,6% больных. 11,2% выявленных вариантов составили мутации в генах BRCA1/2, 3,4% - варианты в других 15 генах предрасположенности (в основном в генах, вовлеченных в гомологичную рекомбинацию: PALB2 (1.2%), BARD1, RAD51D, RAD51C, и BRIP1 (от 0.3% до 0.5%)). Больные РМЖ – носители мутаций характеризовались более ранним возрастом манифестации заболевания (р .001) [51].
В исследовании Buys и соавт. c использованием 25-генной панели приняли участие 35409 больных РМЖ. Клинически значимые варианты были обнаружены у 9,3% тестируемых, причем 51,5% данных генетических вариантов найдены в генах CHEK2 (11.7%), ATM (9.7%) и PALB2 (9.3%). Группа с трижды негативным фенотипом опухоли (4797 больных) характеризовалась статистически значимым повышением частоты патогенных вариантов, которые были идентифицированы в генах BRCA1, PALB2, BARD1, BRIP1, RAD51C. Следует отметить, что частота мутаций была выше в группе больных с возрастом манифестации заболевания до 40 лет, ниже - в группе старше 59 лет и относительно постоянна (8.5%-9.0%) – в группе, занимающей промежуточное положение [37].
Российское исследование Соколенко А.П. и соавт. было проведено с использованием панели, включающей 21 ген предрасположенности к развитию РМЖ, в группе из 95 больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания, у которых отсутствовали мутации в генах BRCA1/2, а также распространенные в российской популяции мутации в генах CHEK2, NBN и ATM. В результате проведенного исследования были обнаружены мутации в генах TP53 (R282W) и WRN (R1406X). Однако связь мутации в гене WRN с развитием РМЖ пока не доказана, поэтому требуется проведение дополнительных исследований [146].
Таким образом, использование NGS для генетического тестирования НРМЖ позволяет идентифицировать новые гены предрасположенности к развитию РМЖ, а также новые генетические варианты, ассоциированные с повышенным риском развития данного онкологического заболевания.
Анализ спектра и частоты распространенных в популяции мутаций в генах BRCA1/2 в группе больных РМЖ (метод ПЦР)
В связи с наличием характерных для российской популяции мутаций в генах BRCA1/2 и диагностических панелей для их определения, методом ПЦР было проведено молекулярно-генетическое исследование в группе из 3826 больных РМЖ для определения распространенных в российской популяции мутаций в генах BRCA1/2. В результате данного исследования выявлены 132 носителя данных мутаций, что составило 3,5%. Среди всей обследованной группы 717 человек имели КПНЗ. Частота мутаций в гене BRCA1 в данной группе оказалась в 5 раз выше - 17,6% (95% СI: 4,0–6,4; р=310(-32)). При этом в гене BRCA2 мутаций не было обнаружено.
Спектр и частота распространенных в популяции мутаций в генах BRCA1/2 в обследованной группе больных РМЖ приведены в таблице 3 и на рисунке 6.
В спектре выявленных изменений в гене BRCA1 у больных РМЖ преобладала мутация 5382insC. Её частота составила 2,5% среди всей обследованной группы и 12,6% - в группе больных с КПНЗ. Доля данного варианта среди выявленных мутаций в группе больных BRCA-ассоциированным РМЖ составила 73%, что согласуется с результатами многочисленных российских исследований, показывающих высокую частоту мутации 5382insC у больных РМЖ [1, 4, 5, 14, 16, 153]. Например, в исследовании Батеневой Е.И. и соавт. частота мутации 5382insC в гене BRCA1 в группе больных РМЖ составила 4%, а доля данного варианта среди выявленных мутаций в группе больных BRCA-ассоциированным РМЖ - 69% [1]. В исследовании Терещенко И.В. и соавт. частота мутации 5382insC в группе пациентов с КПНЗ составила 12%, а ее частота в спектре выявленных в гене BRCA1 мутаций - 75% [153]. В исследовании Соколенко А.П. и соавт. частота данного варианта у пациентов с КПНЗ составила 9,6%, а доля данного варианта среди выявленных мутаций в группе больных BRCA-ассоциированным РМЖ достигла 85% [16].
На втором месте по частоте встречаемости оказались мутации 185delAG, 300T G и 2080delA, которые были обнаружены в группе больных BRCA-ассоциированным РМЖ с частотой 7,6% , 6% и 6% соответственно. Реже наблюдались мутации 3819delGTAAA и 4153delA. Их частота в спектре выявленных мутаций составила 4,5% и 3% соответственно. Данные мутации были описаны ранее, более чем в одном исследовании [1, 5, 78, 95]. В исследовании Батеневой Е.И. и соавт. частота генетических вариантов 185delAG, 300T G, 2080delA, 3819delGTAAA и 4153delA в спектре выявленных в генах BRCA1/2 мутаций составила 1,6%, 6%, 3%, 3% и 12,5% соответственно [1].
Мутации 3875delGTCT в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2 не были выявлены у больных РМЖ в данном исследовании, однако они были описаны в ранее проведенных российских исследованиях [1, 2, 16, 78] и включены в диагностическую панель [2].
Учитывая имеющиеся сведения об особенностях BRCA-ассоциированного РМЖ, был проведен анализ некоторых клинических и морфологических характеристик пациентов – носителей мутаций в гене BRCA1. Характеристика больных BRCA-ассоциированным РМЖ приведена в таблице 4.
Среди 132 больных BRCA-ассоциированным РМЖ: у 59% больных злокачественное заболевание было диагностировано в молодом возрасте (до 50 лет), 65% пациентов имели онкологически отягощенный семейный анамнез, у 27% - наблюдались первично-множественные злокачественные новообразования (РМЖ/РМЖ, РМЖ/РЯ), 29% - характеризовались трижды негативным фенотипом опухоли, у 89% - был диагностирован инфильтративно-протоковый РМЖ.
По результатам клинических данных и данных анкетирования 126 человек из обследованной группы (95,5%) имели КПНЗ: 33 пациента (25%) характеризовались наличием одного из КПНЗ, 93 пациента (70,5%) – сочетанием двух и более признаков (таблица 5).
Только 6 больных, имеющих BRCA-ассоциированный РМЖ (4,5%), не имели КПНЗ. У 5 из них (3,8%) была выявлена мутация 5382insC, у одного (0,8%) – мутация 185delAG. Данный факт может быть объяснен либо плохой осведомленностью пациентов о наличии родственников с онкологическими заболеваниями, либо возникновением данных мутаций de novo.
Таким образом, проведенное молекулярно-биологическое исследование позволяет констатировать, что частота распространенных в российской популяции мутаций 5382insC, 4153delA, 300T G, 2080delA, 185delAG и 3819delGTAAA в гене BRCA1 в обследованной группе больных РМЖ составила 3,5%, а в группе, отобранной по наличию у больных КПНЗ, оказалась в 5 раз выше – 17,6% (95% СI: 4,0–6,4; р=310(-32)). При этом в спектре выявленных мутаций преобладал один генетический вариант - 5382insC. Доля данного варианта среди выявленных мутаций составила 73%. В гене BRCA2 ни у одного из обследованных больных мутаций не выявлено.
Анализ спектра и частоты мутаций в других генах предрасположенности к развитию онкологических заболеваний в группе больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания (метод NGS)
Помимо генов BRCA1/2 и CHEK2, в настоящее время известны другие гены, повреждение которых может быть связано с развитием онкологических заболеваний. Наличие у больных РМЖ КПНЗ, но отсутствие мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2, может свидетельствовать о наличии повреждений в других генах предрасположенности.
Для анализа спектра и частоты мутаций в других генах предрасположенности к развитию онкологических заболеваний в группе из 193 больных РМЖ с КПНЗ было проведено молекулярно-генетическое исследование методом NGS. У 15 больных РМЖ (7,8%) были выявлены гетерозиготные патогенные варианты в генах предрасположенности: ATM, PALB2, BLM, MUTYH, ERCC2, ERCC3, FANCM, PTCH1 и MITF. Спектр и частота, а также характеристика выявленных вариантов приведены в таблице 14 и на рисунке 8.
Наибольшее количество мутаций наблюдалось у обследованных больных в генах ATM, PALB2 и MUTYH. Частота мутаций в данных генах у больных РМЖ с КПНЗ составила 2,6%, 1,1% и 1,1%, а доля мутаций в данных генах в спектре выявленных мутаций – 33,3%, 13,3% и 13,3% соответственно (рисунок 8).
У 4 больных РМЖ с КПНЗ (2,1%) была выявлена нонсенс-мутация с.5932G T в гене АТМ. Анализ результатов исследований, проведенных в России, Белоруссии и Польше, подтвердил связь данного генетического варианта с развитием РМЖ и повышением риска развития РМЖ в 5,6 раза, по сравнению с общепопуляционным риском [34]. Вариант c.431_432insA в гене АТМ, выявленный у одного пациента, был ранее обнаружен в польской популяции [152].
Наличие вариантов c.509_510delGA в гене PALB2 и c.1642C T в гене BLM в российской популяции и их связь с повышенным риском развития РМЖ также были подтверждены в ранее проведенных исследованиях [117, 144].
Связь мутации c.172_175delTTGT в гене PALB2 с повышенным риском развития РМЖ была показана в чешской и польской популяциях [54, 79].
Исследование Rennert и соавт., проведенное в группе больных РМЖ еврейского происхождения, показало повышенный риск развития РМЖ у носителей мутации c.1187G A в гене MUTYH (OR=1.86; 95% CI: 1.02-3.39; p=0,039) [133].
Исследование Rump и соавт. показало возможную связь мутации с.1703_1704delTT в гене ERCC2 с повышенным риском развития РМЖ [138], однако требуется проведение дополнительных исследований.
Peterlongo и cоавт. провели исследование в группах, состоящих из 8635 больных РМЖ с онкологически отягощенным семейным анамнезом и 6625 здоровых доноров, и выявили связь между наличием мутации c.5791C T в гене FANCM и повышенным риском развития РМЖ (OR=3.93; 95% CI: 1.28– 12.11; р=0.017) [121].
Связь остальных вариантов с повышенным риском развития РМЖ пока не установлена, и требуется проведение дополнительных исследований, но отсутствие мутаций в других генах, ассоциированных с повышенным риском развития РМЖ, позволяет предположить, что данные варианты могут быть ассоциированы с развитием заболевания.
У 3 из 15 больных РМЖ – носителей мутаций c.5932G T в гене АТМ, c.509_510delGA в гене PALB2 и c.1100C G в гене ERCC3 также были выявлены мутации в генах BRCA1 (c.5224C T, c.4165_4166delAG) и CHEK2 (c.444+1G A) (таблица 15).
Таким образом, мутации в генах ATM, PALB2, BLM, MUTYH, ERCC2, FANCM, PTCH1 и MITF могут быть ассоциированы с развитием заболевания у 12 (6%) больных РМЖ с КПНЗ.
Кроме патогенных вариантов, были также проанализированы варианты с неизвестным клиническим значением в генах предрасположенности к развитию РМЖ. В обследованной группе у 31 больного РМЖ (16%) были выявлены 38 гетерозиготных миссенс-вариантов с неизвестным клиническим значением в генах: RAD51C, CDH1, MLH1, MSH2, ATM, BRIP1, PALB2, BLM, MUTYH (таблица 16).
Все варианты были выявлены по одному, за исключением мутации c.11T C в гене BLM, которая была обнаружена у двух пациентов.
11 (35%) из 31 больного РМЖ – носителей вариантов с неизвестным клиническим значением в генах предрасположенности к развитию РМЖ имели по несколько вариантов в генах предрасположенности к развитию РМЖ (таблица 17).
У 8 больных (25,8%), помимо вариантов с неизвестным клиническим значением, были выявлены патогенные варианты в генах BRCA1, BRCA2 и CHEK2 (таблица 17).
У 3 больных РМЖ (9,7%) были обнаружены по несколько вариантов, а у 20 (64,5%) – по одному варианту с неизвестным клиническим значением в генах RAD51C, CDH1, MLH1, MSH2, ATM, BRIP1, PALB2, BLM, MUTYH.
Обнаруженные варианты имели низкую частоту встречаемости в популяции ( 0,2%, ExAC). Использование программ предсказания патогенности вариантов («CADD», «PolyPhen», «Sift») позволило исключить связь части вариантов с повышенным риском развития заболевания: c.1127A G (CDH1), c.626A G (MLH1), c.862T C (BLM), c.1218A G (BLM). Остальные варианты с неизвестным клиническим значением в генах RAD51C, CDH1, MLH1, MSH2, ATM, BRIP1, PALB2, BLM, MUTYH, по-видимому, могут быть ассоциированы с развитием заболевания у 19 больных РМЖ с КПНЗ (10%). Однако полученные результаты требуют дополнительных исследований. Следует отметить, что 4 мутации из данных вариантов: c.8191G A (ATM), c.1370T C (BRIP1), c.2206G A (CDH1), c.48G C (MSH2) обнаружены впервые (отсутствует информация о данных вариантах в доступных генетических базах данных).
Таким образом, у 7,8% больных РМЖ с КПНЗ выявлены патогенные мутации в генах предрасположенности: ATM, PALB2, BLM, MUTYH, ERCC2, ERCC3, FANCM, PTCH1 и MITF.
Оптимизация алгоритма молекулярно-генетического обследования больных РМЖ для выявления наследственного характера заболевания
В настоящее время в России не существует единого утвержденного алгоритма обследования больных РМЖ для выявления наследственного характера заболевания. Большинство лабораторий используют стандартные клинико-диагностические панели, с помощью которых методом ПЦР можно быстро и относительно недорого выявлять наиболее распространенные в российской популяции мутации в генах предрасположенности BRCA1, BRCA2 и CHEK2 [2].
Однако использование готовых панелей для подтверждения наследственного характера заболевания может приводить к некоторому числу ложноотрицательных результатов из-за наличия редких генетических повреждений, выявить которые можно только при анализе всей нуклеотидной последовательности кодирующих регионов генов предрасположенности [13]. Использование высокопроизводительного метода секвенирования «нового поколения» предоставляет возможность решить данную задачу, но высокая стоимость данного исследования не позволяет использовать его в качестве рутинного метода, заменяющего метод ПЦР в ежедневной молекулярно-генетической диагностике.
Поэтому в настоящее время необходимо разработать такой алгоритм обследования больных РМЖ в российской популяции, который позволит оптимизировать использование двух данных методов в клинической практике для достижения максимальной эффективности выявления наследственного характера заболевания при минимизации затрат на проведение молекулярно-генетического исследования.
С 2008 года в ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России проводится молекулярно-генетическое обследование больных РМЖ, которое включает в себя:
1) Анкетирование больных (изучение семейного онкологического анамнеза);
2) ДНК-тестирование методом ПЦР в режиме реального времени на наличие распространенных в российской популяции наследственных мутаций в генах предрасположенности к развитию РМЖ: BRCA1 (5382insC, 4153delA, 300T G, 2080delA, 185delAG, 3819delGTAAA, 3875delGTCT), BRCA2 (6174delT) и CHEK2 (c.1100delC, с.441+1G A, c.470T C);
3) Обязательную верификацию выявленных мутаций методом секвенирования по Сенгеру;
4) Медико-генетическое консультирование больных с выявленными мутациями. На основании данных, полученных в результате проведенного молекулярно-генетического обследования 3826 больных РМЖ, в алгоритм обследования было решено внести следующие обоснованные изменения:
Учитывая высокую частоту встречаемости мутации 5382insC в гене BRCA1 и мутаций c.llOOdelC, с.441+1G A в гене СНЕК2, а также отсутствие связи между наличием у пациентов распространенных в популяции мутаций в гене СНЕК2 и КПНЗ, молекулярно-генетическое исследование с целью их выявления целесообразно проводить всем больным РМЖ;
Учитывая широкий спектр редких мутаций в генах BRCA1/2, выявленных методом NGS, у больных РМЖ с КПНЗ, необходимо проводить секвенирование всей кодирующей части данных генов пациентам, у которых не обнаружена наиболее распространенная в российской популяции мутация 5382insC в гене BRCA1;
Наличие широкого спектра патогенных и вероятно патогенных вариантов в других генах предрасположенности к развитию онкологических заболеваний, а также их высокая частота встречаемости (в том числе одновременно нескольких мутаций) у больных РМЖ с КПНЗ, свидетельствуют о целесообразности секвенирования данных генов, в первую очередь, в случае отсутствия мутаций в генах BRCA1/2.
Принимая во внимание вышеизложенное, оптимизирован алгоритм молекулярно-генетического обследования больных РМЖ для выявления наследственного характера заболевания (рис. 10):
Проведение молекулярно-генетического исследования всем больным РМЖ с целью выявления только трех распространенных в популяции вариантов: мутации 5382insC в гене BRCA1 и мутаций c.llOOdelC, с.441+Ш А в гене СНЕК2 методом ПЦР в режиме реального времени;
При отсутствии у больных РМЖ мутации 5382insC в гене BRCA1, но наличии у них КПНЗ, целесообразно проведение молекулярно генетического исследования методом NGS с использованием панели, позволяющей секвенировать всю кодирующую часть генов BRCA1/2;
При отсутствии у больных РМЖ с КПНЗ мутаций в генах BRCA1/2, целесообразно проведение молекулярно-генетического исследования методом NGS с использованием панели, позволяющей секвенировать все гены предрасположенности к развитию данного заболевания;
Обязательная верификация выявленных мутаций методом секвенирования по Сенгеру;
Медико-генетическое консультирование больных с выявленными мутациями;
В случае выявления мутаций в генах предрасположенности к развитию РМЖ, проведение молекулярно-генетического обследования родственников (при достижении совершеннолетия) для выявления аналогичных мутаций методом секвенирования по Сенгеру.