Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Кожа, как нейроэндокринный орган, поддерживающий гомеостаз и осуществляющий координацию систем организма (обзор литературы) 17
1.1 Структура и функции кожи 17
1.2 Кожа как нейроэндокринный орган 20
1.2.1 Меланоциты и меланогенез 20
1.2.2 Кожа и биогенные амины 22
1.3 Кожа и основные регуляторные оси – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая, тиреоидная и гонадная (ГГН, ГГТ и ГГГ) 23
1.4 Патология кожи. Меланома – злокачественная опухоль нейроэктодермального происхождения 29
1.4.1 Эпидемиология и факторы риска развития меланомы кожи 29
1.4.2 Роль окислительного стресса в норме, канцерогенезе и злокачественном росте 32
1.4.3 Роль гормонального фактора в канцерогенезе и росте меланомы кожи 36
1.5 Роль факторов роста в патогенезе злокачественных опухолей 43
1.6 Роль биогенных аминов и нейромедиаторов при меланоме кожи 49
1.7 Роль системы плазмин/плазминоген в патогенезе злокачественного роста 54
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1 Исследование основных показателей роста перевивной меланомы В16/F10 в зависимости от половой принадлежности животных 66
2.2 Изменение весовых коэффициентов внутренних органов самок и самцов мышей линии С57ВL/6 в динамике роста меланомы В16 68
Глава 3. Влияние опухолевого роста перевивной меланомы В16/F10 на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую, тиреоидную и гонадную оси, а также их аналоги в коже у самцов мышей 76
3.1. Влияние роста перевивной меланомы В16/F10 на гипоталамо гипофизарно-надпочечниковую ось и ее аналог в коже у самцов мышей 77
3.2 Гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная ось в динамике роста меланомы у самцов мышей 80
3.3 Динамика изменений в локальной и центральной гипоталамо-гипофизарно-гонаднойоси у самцов мышей с перевивной меланомой 85
Глава 4. Влияние опухолевого роста перевивной меланомы В16/F10 на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую, тиреоидную и гонадную оси, а также их кожные аналоги у самок - мышей линии C57BL/6 102
4.1 Влияние роста меланомы на ГГН ось и ее локальный аналог в коже у самок мышей в динамике роста перевивной меланомы В16/F10 102
4.1.1 Изменения в содержании регуляторных гормонов гипоталамуса и гипофиза у самок мышей в динамике роста меланомы В16/F10 102
4.1.2 Кожа как аналог ГГН оси у самок мышей в динамике роста меланомы в16/F10 104
4.2 Функциональная активность ГГТ оси у самок мышей в динамике роста меланомы В16/F10 106
4.2.1 Центральные механизмы регуляции ГГТ оси 106
4.2.2 Функциональная активность щитовидной железы у самок мышей в динамике роста меланомы В16/F10 108
4.2.3 Кожа, как эффекторное звено ГГТ оси у самок мышей 109
4.3 Динамика изменений в гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси у самок мышей с перевивной меланомой 112
4.3.1 Центральная регуляция ГГГ оси у самок мышей в динамике роста меланомы В16/F10 112
4.3.2 Содержание половых стероидов и регуляторных гормонов в крови у самок в динамике роста меланомы В16/F10 114
4.3.3 Функциональная активность яичников и надпочечников у самок мышей в динамике роста меланомы В16/F10 116
4.3.4 Кожа, как конечное звено ГГГ оси у самок мышей в динамике роста меланомы В16/F10 118
Глава 5. Сходство и различия в функционировании ГГН, ГГТ и ГГГ осей и их аналогов в коже в динамике роста меланомы В16/F10 у самцов и самок мышей 132
5.1 Сравнительный анализ гормонального статуса у интактных мышей линии C57Bl/6 в зависимости от пола 133
5.2 Сравнительный анализ изменений функциональной активности основных регуляторных осей – ГГН, ГГТ и ГГГ, а также их аналогов в коже в зависимости от пола животного в динамике роста меланомы В16/F10 138
5.2.1 Сравнительный анализ изменения активности ГГН оси 138
5.2.2 Сравнительный анализ изменений в функциональной активности ГГТ оси в динамике роста меланомы В16/F10 с учетом половой принадлежности животных 142
5.2.3 Влияние препарата «Стелланин» на рост и развитие меланомы В16/F10 у мышей обоего пола 145
5.2.4 Сравнительный анализ изменений в ГГГ оси при росте меланомы в зависимости от пола экспериментальных животных 148
5.2.5 Сравнительный анализ локального аналога ГГГ оси в динамике роста меланомы 153
Глава 6. Содержание биогенных аминов в мозге и кожи у мышей с перевивной меланомой В16/F10 161
6.1 Изменение нейромедиаторов в коре головного мозга у самцов в динамике роста меланомы В16/F10 162
6.2 Изменение нейромедиаторов в коже, опухоли и перифокальной зоне у самцов мышей на разных этапах эксперимента с перевивной меланомой В16/F10 165
6.3 Изменение нейромедиаторного баланса в головном мозге у самок мышей с перевивной меланомой В16/F10 171
6.4 Изменение локального содержания биогенных аминов у самок с перевивной меланомой В16/F10 172
6.5 Сравнительный анализ нейромедиаторной системы мозга и кожи в зависимости от половой принадлежности животных в динамике роста перевивной меланомы В16/F10 176
6.6 Сравнительный анализ локального содержания нейротрансмиттеров у мышей с перевивной меланомой В16/F10 в зависимости от пола 180
Глава 7. Содержание факторов роста и их рецепторов в интактной и патологически измененной коже самцов мышей в динамике роста меланомы В16/F10 191
7.1 Изменение уровня факторов роста в коже, опухоли и ее перифокальной зоне у самцов мышей в динамике роста меланомы В16/F10 191
7.2 Содержание факторов роста и их рецепторов в интактной и патологически измененной коже самок мышей в динамике роста злокачественной меланомы 197
7.3 Общие и отличительные характеристики содержания факторов роста и их рецепторов в интактной и патологически измененной коже самцов и самок мышей в динамике роста злокачественной меланомы 201
Глава 8. Активация фибринолитической системы у мышей в динамике роста перевивной меланомой В16/F10 с учетом половой принадлежности 218
8.1 Результаты исследования системы фибринолиза у самок – мышей с перевивной меланомой В16/F10 219
8.2 Результаты исследования системы фибринолиза у самцов – мышей с перевивной меланомой В16/F10 227
8.3 Сравнительный анализ изменения в системе плазмин/плазминоген кожи в динамике роста перевивной меланомы В16/F10 в зависимости от пола животных 237
Глава 9 Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита в коже, опухоли, перифокальной зоне у самок и самцов мышей в динамике роста меланомы В16/F10 245
9.1 Изменение ферментативной активности первичных антиоксидантов в коже, опухоли и перифокальной зоне у самцов с перевивной меланомой В16/F10 в динамике роста опухоли 246
9.2 Изменение уровня витаминов в коже, опухоли и перифокальной зоне у самцов мышей в динамике роста меланомы В16/F10 249
9.3 Содержание первичных продуктов ПОЛ – диеновых коньюгатов (ДК) и вторичных – малонового диальдегида (МДА) в коже опухоли и п/зоне у самцов в динамике роста меланомы 251
9.4 Изменение ферментативной активности первичных антиоксидантов в коже, опухоли и перифокальной зоне у самок с перевивной меланомой В16/F10 в динамике роста опухоли 253
9.5 Изменение уровня витаминов в коже, опухоли и перифокальной зоне у самок мышей в динамике роста меланомы В16/F10 256
9.6 Содержание первичных продуктов ПОЛ –ДК и вторичных – МДА в коже опухоли и п/зоне у самок в динамике роста меланомы 257
9.7 Сравнительный анализ изменений АОЗ у самцов и самок с перевивной меланомой В16/F10 259
Глава 10 Возможность использования результатов эксперимента в клинике 272
10.1 Исследование уровня половых гормонов в меланоме и окружающих ее тканях у больных меланомой кожи 272
10.2 Тканевая система активации плазминогена у больных меланомой кожи 279
10.3 Система факторов неоангиогенеза в ткани меланомы кожи, ее перифокальной зоны и по линии резекции 285
10.4 Показатели факторов роста в периферической крови у больных меланомой кожи 292
10.5 Разработка способа прогнозирования развития метастазов у больных меланомой кожи 295
Заключение 303
Выводы 334
Практические рекомендации 339
Список сокращений 340
Список литературы 342
- Кожа и основные регуляторные оси – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая, тиреоидная и гонадная (ГГН, ГГТ и ГГГ)
- Динамика изменений в локальной и центральной гипоталамо-гипофизарно-гонаднойоси у самцов мышей с перевивной меланомой
- Сравнительный анализ локального аналога ГГГ оси в динамике роста меланомы
- Разработка способа прогнозирования развития метастазов у больных меланомой кожи
Кожа и основные регуляторные оси – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая, тиреоидная и гонадная (ГГН, ГГТ и ГГГ)
Важными координаторами реакции организма на внешние и внутренние воздействия являются три оси организма – гипоталамо-гипофизарно надпочечниковая (ГГН), гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная (ГГТ) и гипоталамо-гипофизарно-гонадная (ГГГ) (Bjelobaba I. et al., 2015).
Рядом исследователей установлены в коже аналоги основных регуляторных осей организма – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой, гипоталамо-гипофизарно-гонадной и гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной (van Beek N. et al., 2008; Ito N. et al., 2010; Slominski A., Wortsman J., 2004; 2015), посредством которых осуществляется регуляция местных реакций на стресс, как с вовлечением центральных регуляторных структур, так и независимо от них (Slominski A., 2012). Это возможно благодаря способности клеток кожи не только продуцировать гипоталамические рилизинг гормоны: тиреолиберин (Slominski A., Wortsman J., 2002), кортиколиберин и гонадолиберин (Kono M., Nagata H. 2001; Ito N. et al., 2010; Zbytek B., WortsmanJ., 2006), гипофизарные тропные гормоны: проопиомеланокортин (ПОМК), который в дальнейшем образует АКТГ, пептиды меланоцитстимулирующего гормона (МСГ), -эндорфины (Ito N. et al., 2010; Skobowiat C., Dowdy J.C., 2011), тиреотропин (Bodo E., Kany B., 2010), окситоцин (Deing V. et al., 2013), гормон роста (Slominski A. et al., 2000) и пролактин (Foitzik K. et al., 2009; Langan E.A. et al., 2010; 2018), но и осуществлять взаимодействия следуя классическим иерархическим соподчинениям, аналогичным основным регуляторным осям. Клетки кожи способны синтезировать и метаболизировать кортикостероиды, половые гормоны, их предшественники, а также тиреоидные гормоны щитовидной железы (Slominski A. et al., 2013; 2014).
Установлено, что как в надпочечниках, так и в коже активность синтеза кортизола находится под влиянием АКТГ-гипофиза и кортикотропного-рилизинг гормона гипоталамуса (Slominski A. 2000; Ito N. et al., 2010). В клетках меланоцитов кроме АКТГ и КТ-рилизинга синтез кортизола активировался прогестероном (Slominski A., 2005). Все это позволяет говорить о кожных эквивалентах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (ГГН), гипоталамо-гипофизарно-гонадной (ГГГ) (Slominski A. et al., 2007), гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси (ГГТ) (van Beek N. et al., 2008).
Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая регуляторная ось запускается различными стрессовыми факторами, которые активируют выработку кортиолиберина в паравентрикулярном ядре (Pearson-Murphy B.E et al., 2007; Ronan P.J. et al., 2011; Stopa L.R.S. et al., 2019). Глюкокортикоиды оказывают очень разнообразное влияние от метаболизма через сердечно-сосудистое воздействие до костного метаболизма, затрагивая даже центральную нервную систему (Zelena D. et al., 2015). В гипофизе кортиколиберин связывается с рецепторами типа 1 (CRF1) (Poopalasundaram S. et al., 2016; Slominski A. et al., 2017), увеличивая продукцию и секрецию проопиомеланокортиновых (POMC) пептидов, то есть ACTH, MSH и -эндорфин (Gray M. et al., 2010; Kino T. et al., 2012). В коре надпочечников АКТГ, взаимодействуя с рецепторами, стимулирует выработку и секрецию кортикостероидов (Locatelli V. et al., 2010). Они противодействуют воздействию стрессоров за счет мобилизации энергетических резервов, буферизации повреждений тканей и подавления иммунной системы (Zelena D. et al., 2015; Stopa L.R. S. et al., 2019). Кроме того, кортикостероиды через механизмы обратной связи ингибируют ГГН ось посредством подавления продукции кортиколиберина и POMC (Slominski A. et al., 2012).Появляются новые данные, свидетельствующие о нарушении саморегуляции оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники при воспалении как важных и тесно связанных компонентов патофизиологии связанных с стрессом и депрессией (Markov D.D. et al., 2017).
В ходе многочисленных исследований в коже млекопитающих обнаружены все элементы оси ГГН, то есть кортиколиберин, POMC, АКТГ, МСГ, глюкокортикоидные рецепторы и гены, кодирующие стероидогенные ферменты, которые способны аналогичным основной регуляторной ГГН оси образом отвечать на внешние и внутренние стрессорные воздействия (Skobowiat C. et al., 2011; Slominski A. et al., 2014; 2017). Предоставлены доказательства того, что кожа экспрессирует кортиколиберин и POMC-производные -эндорфин, АКТГ и -MSH, с соответствующими рецепторами, а также ключевые ферменты синтеза кортикостероидов, что приводит к кожной продукции кортикостерона и кортизола (Slominski A. et al., 2007; Arck P.C. et al., 2006; Tobin D.J., 2006). Существуют данные, указывающие на то, что кортиколиберин может стимулировать выработку кортизола в клетках кожи с помощью продуктов расщепления POMC (Slominski A. et al., 2007; Ito N. et al., 2010). Накоплены доказательства того, что система реакции на кожный стресс следует функциональной иерархии центральной ГГН оси с ее прямыми локальными фенотипическими последствиями и системными последствиями (Slominski A. et al., 2017). При этом установлено, что локальный аналог ГГН оси способен активировать центральную ГГН ось с ее прямыми гомеостатическими, метаболическими и фенотипическими ответами. Так, системные реакции организма на УФ излучение, инициируемые в коже, включают одновременно активацию сенсорных рецепторов и местную продукцию гормонов. Эти сигналы доставляются либо по восходящим нервным путям в мозг, либо из кровообращения непосредственно в гипофиз. Конечным результатом является высвобождение АКТГ и РОМС. Возможны даже альтернативные пути, когда гормональные факторы, минуя гипофиз, непосредственно из крови воздействуют на надпочечники, стимулируя выделение кортизола/кортикостерона (Jiang X. et al., 2009; Slominski A. et al., 2012).
Экспрессия молекулярных элементов оси ГГТ (гены для тиреолиберина и его рецепторов, дейодиназы 2 и 3, тиреоглобулин и переносчик йодида натрия) в коже человека и функциональные рецепторы тиреолиберина и тиреотропина в кератиноцитах меланоцитах были впервые показаны Slominski и соавт. (Slominski A. et al., 2002). Последующие исследования продемонстрировали экспрессию рецепторов тиреолиберина и тиреотропина в различных типах клеток кожи, включая кератиноциты, меланоциты, фибробласты и волосяные фолликулы (van Beek N et al., 2008; Bodo E. et al., 2010), что послужило основанием для концепции кожного аналога регуляторной оси ГГТ, которая показала бы сходство и различия с центральной осью ГГТ (van Beek N. et al., 2008; Bodo E. et al., 2010). Взаимодействие T3 с его рецепторами (TR и TR) влияет на дифференцировку эпидермиса и повышает его чувствительность к факторам роста (Slominski A. etal., 2000), а также регулирует пролиферацию, дифференцировку и иммунную активность клеток кожи (Contreras-Jurado C. et al., 2011). Тиреоидные гормоны, действующие через свои рецепторы, могут ингибировать воспаление кожи (Contreras-Jurado C. et al., 2011). Тироксин стимулирует пролиферацию кератиноцитов волосяного фолликула, а трийодтиронин ингибирует их апоптоз (van Beek N. et al., 2008). Гормоны щитовидной железы могут также воздействовать на стволовые клетки волосяного фолликула, поскольку было обнаружено, что T3 и T4 вызывают дифференцировку и апоптоз и ингибируют клональный рост эпителиальных стволовых клеток волосяного фолликула (Tiede S. et al., 2010). Активность дейодиназ обеспечивает кожную конверсию Т4 в Т3, что играет роль в регуляции пролиферации кератиноцитов и дермальных фибробластов in vitro и in vivo (Safer J.D. et al., 2009). ТТГ, действующий через рецептор TSH-R1, увеличивает выработку цАМФ кератиноцитами человека, клетками меланомы человека и хомяка (Slominski A. et al., 2002) и активирует пролиферацию эпидермальных кератиноцитов и дермальных фибробластов (Bodo E. et al., 2010). Связь между кожными аналогами регуляторной ГГТ оси с центральными координационными центрами оказывает влияние на системный гомеостаз.
Кожа человека экспрессирует гены, кодирующие ферменты, участвующие в последовательном метаболизме холестерина в прегненолон и кортикостероиды, включая цитохромы P450scc, P450c17 и P450c21, а также гены MC2-R (рецептор для АКТГ) (Slominski A. et al., 2012). В клетках кожи была установлены функциональная активность этих ферментов (Slominski A. et al., 2004), а также тот факт, что кожный стероидогенез начинается с холестерина (Thiboutot D. et al., 2003; Slominski A. et al., 2004; 2007). Кожа является важным органом, превращающим дегидроэпиандростерон (DHEA) и DHEA-сульфат (DHEA-S) или андростендион, которые преимущественно происходят из системного кровообращения, в активные половые гормоны (Zouboulis C.C. et al., 2007; Slominski A. et al., 2008). Локально синтезирующиеся половые гормоны способны модифицировать фенотип и функцию кожи посредством взаимодействий с соответствующими рецепторами андрогена и эстрогена (Zouboulis C.C. et al., 2007). Мужчины и женщины отличаются метаболизмом и реакцией на андрогены и эстрогены (Chen W. et al., 2002). Известно, что эстрогены ускоряют заживление ран, облегчая течение воспалительных заболеваний, увеличивают толщину эпидермиса и защищают кожуот фотостарения (Thornton M.J., 2013). Клеточные эффекты эстрогенов опосредуются рецепторами эстрогенов (ER), ER и ER, которые принадлежат к надсемейству рецепторов ядерных стероидных гормонов (Hall G., Phillips T.J., 2005). Как правило, уровни кожного ER, выше у женщин по сравнению с мужчинами (Hall G., Phillips T.J., 2005).
Кожная экспрессия элементов основных регуляторных осей ГГН, ГГТ и ГГГ неслучайна, она организована в функциональные регуляторные петли, специфичные для типа клеток, со структурной иерархией, аналогичной центральным осям (Slominski A. et al., 2007). Элементы кожных регуляторных осей могут противодействовать кожным патологиям, таким как воспалительные и аутоиммунные нарушения, а также гиперпролиферативные и диспластические процессы, для защиты и восстановления гомеостаза кожи (Slominski A. et al., 2007). Подтверждено эволюционное сохранение сходной ГГН-подобной организации на центральном и периферийном уровнях (Arck P.C. et al., 2006; Slominski A. et al. 2007; 2008).
Динамика изменений в локальной и центральной гипоталамо-гипофизарно-гонаднойоси у самцов мышей с перевивной меланомой
Учитывая существенные половые различия в протекании заболевания злокачественной меланомой, особый интерес представляет изучение именно ГГГ оси организма.
Сначала провели исследование содержания гонадолиберина в гипоталамусе и ЛГ и ФСГ в гипофизе (таблица 3.7). Оказалось, что уровень ЛГ-рилизинга в гипоталамусе снизился более чем в 2 раза, начиная с первой недели, и оставался таким на протяжении всего эксперимента, повышаясь только непосредственно перед гибелью животных, но оставаясь ниже нормы в 1,5 раза. В гипофизе, напротив, в первые 2 недели выявлен максимальный рост ЛГ: в среднем в 3 раза, затем, через 3 недели в 1,9 раза и в 1,4 раза – через 4 недели. Рост ФСГ отмечен только в первую – в 1,5 раз и в последнюю недели – в 2,4 раза, с некоторым уменьшением в сроки на 2 – до нормального уровня и в 3 недели – в 1,6 раз ниже нормы.
Коэффициент соотношения ЛГ/ФСГ в гипофизе на протяжении всего эксперимента был выше нормы: в 2,1 раза через 1 неделю, более чем в 3 раза через 2-3 недели, но к концу эксперимента снизился в 1,8 раза. Очевидно, что уже в начале эксперимента оказалась нарушенной гипоталамо-гипофизарная ось регуляции стероидогенеза, а регуляция локального образования половых гормонов в ткани опухоли кроме автономного пути, стимулировалась непосредственно гипофизом за счет высокого содержания тропных гормонов, с превалированием ЛГ.
У самцов в динамике роста меланомы уровень СТГ-рилизинга в гипоталамусе превышал норму через 1 и 4 недели эксперимента в 1,4 раза, в период 2-3 недели содержание этого регуляторного пептида не отличалось от нормы (таблица 3.8).
Положительные корреляционные связи СТГ-рилизинга гипоталамуса и СТГ в гипофизе соблюдались только в 1-2 недели эксперимента, затем резко изменилась направленность корреляционных связей и рост СТГ гипофиза не сопровождался повышением соответствующего либерина гипоталамуса, а, напротив, на фоне роста СТГ-рилизинга произошло снижение тропного гормона роста.
Дофамин является одним из важнейших ингибирующих регуляторных факторов гипофизарной продукции пролактина. Содержание дофамина в мозге было снижено на всех этапах эксперимента, хотя и колебалось в сторону увеличения – уменьшения в зависимости от сроков исследования. Через 1 неделю концентрация дофамина была ниже нормы в 2 раза, затем повысилась и была ниже нормы только в 1,3 раза, затем опять снизилась более чем в 6 раз, оказавшись ниже нормы в 8,2 раза и у мышей, доживших с меланомой до 4 недель, нормализовалась. При этом не установлены корреляционные связи между содержанием дофамина в мозге и выработкой пролактина гипофизом: уровень пролактина повысился через 3-4 недели в 1,8 раза и в 2,3 раза соответственно, не отличаясь от нормы на начальных этапах эксперимента – через 1-2 недели.
Исследование содержания тропных гормонов гипофиза в крови у самцов в динамике роста меланомы показало снижение концентрации ФСГ через 1-3 недели после перевивки, а ЛГ через 2-3 недели. При этом коэффициент соотношения ЛГ/ФСГ в крови на протяжении всего эксперимента превышал норму в среднем в 1,6 раза (таблица 3.9).
Уровень пролактина в крови превышал норму через 1 неделю в 1,4 раза, через 2 недели в 1,9 раза, затем через 3 недели упал до нормальных показателей и через 4 недели, опять возрос в 1,4 раза. В семенниках, как в одном из конечных, наряду с кожей, эффекторных звеньев ГГГ оси, обнаружено падение уровня холестерина начиная со второй недели в 1,4 раза, приводящее к его истощению к концу эксперимента – в 3 раза ниже нормы. Уже через 1 неделю эксперимента в гонадах выявлено снижение в 13 раз уровня 17ОНР, с максимальным падением, более чем в 22 раза – через 2 недели после перевивки. При этом не установлены достоверные изменения в синтезе прогестерона и ДГЭА-S семенниками на всех этапах исследования (таблица 3.10). Содержание прогестерона в крови через 1 неделю оказалось сниженным в 1,9 раза, но через 2 недели нормализовалось и затем возросло в среднем в 1,5 раза. Что касается эстрогенов (таблица 3.9), то у самцов мышей в динамике роста меланомы В16/F10 в семенниках выявлено снижение концентрации Е2 и Е1 в среднем в 1,4 раза и в 1,5 раз соответственно, Е3 в 2,1 раза – через неделю после перевивки и более чем в 3 раза в последующие сроки, что вероятно связано с выбросом гормонов в кровь, так как уровень Е1и Е2 в крови на всех этапах оказался повышенным (таблица 3.10). Кроме того, в крови установлено изменение баланса соотношения метаболитов эстрогенов на всех этапах эксперимента в сторону преобладания генотоксичного 16ОНЕ.
В то же время уровень общей формы тестостерона в семенниках у мышей не отличался от нормы, содержание свободной формы тестостерона снизилось – в 1,6-2,9 раз с 1 по 4 недели (таблица 3.10). На протяжении эксперимента уровень свободного тестостерона не возвратился к нормальным показателям, минимальные значения установлены через 1 неделю после перевивки – снижение в 2,9 раза, максимальные – через 2 недели – в 1,6 раза ниже нормы.
Как показали исследования, содержание свободной формы тестостерона не коррелировало с уровнем ССГ, концентрация которого в семенниках снизилась в 1,4 раза только через 1 неделю, затем возвратилась к норме. При этом выброс тестостерона в кровь резко снизился, в результате чего концентрация гормона оказалась ниже нормы в среднем в 5,6 раза. Следует отметить, что нами не установлено изменение уровня прогестерона и ДГЭА-S в ткани семенников на протяжении всего эксперимента, тем не менее, содержание метаболических предшественников синтеза стероидных гормонов снизилось - в 1,4 раза, начиная с 1-й недели 17ОНР и холестерина со второй недели.
Уровень вторичного мессенджера цАМФ в семенниках мышей с перевитой меланомой оказался ниже нормы на протяжении всего эксперимента: в 2,6 раза – через 1 неделю, в 1,7 раза через 2 недели, в 4,2 раза – через 3 недели и в 1,5 раза – к концу эксперимента.
Известно, что промежуточным звеном образования половых стероидов являются надпочечники (таблица 3.11).
В настоящем исследовании установлено повышение уровня холестерина в 2,5 раза только во вторую неделю исследования, в остальные сроки уровень предшественника стероидов в надпочечниках не отличался от нормы, за исключением этапа через 4 недели, когда концентрация холестерина оказалась снижена почти в 4 раза. Также не выявлены в надпочечниках изменения концентраций ДГЭА-S. Вместе с тем, начиная с первой недели, установлен рост содержания прогестерона с максимальным уровнем, в 2,5 раза превышающим норму, во 2-ю неделю. Кроме того повысился уровень 17-ОНР в 1,7 раза – в первую неделю, в 2,2 раза – во вторую с последующим снижением – в 2,7 раз ниже нормы к концу эксперимента. В эксперименте было установлено резкое снижение – более чем в 13 раз содержания цАМФ в надпочечниках самцов через 1 неделю после перевивки меланомы. И хотя далее уровень цАМФ повысился в 6,8 раза, по сравнению с предыдущим этапом исследования, концентрация вторичного мессенджера в надпочечниках оставалась ниже нормы в среднем в 2 раза до конца эксперимента. Вероятно, холестерин, 17ОНР и прогестерон, как предшественники для синтеза стероидных гормонов, до 3-й недели эксперимента, то есть до начала гибели животных, содержались в надпочечниках в достаточном количестве, однако их расход не шел по пути производства стероидов гонадами. Есть вероятность расхода стероидов на синтез кортизола, производство которого у самцов в надпочечниках было резко увеличено.
Далее нас интересовало изменение стероидогенеза в органе, непосредственно затронутом меланомой – то есть в коже и затем в развивающейся на ней опухоли (таблица 3.12).
Сравнительный анализ локального аналога ГГГ оси в динамике роста меланомы
В норме у интактных самок уровень ЛГ был в 1,7 раза выше, чем у самцов, а ФСГ достоверных отличий не имел. В результате коэффициент соотношения ЛГ/ФСГ у самок оказался в 2 раза выше, чем у самцов. В динамике роста меланомы в непораженной коже у самок уровень ЛГ снизился, у самцов не отличался от нормы (таблица 5.21).
Содержание ФСГ в коже у самок и самцов снизилось через 1 и 4 недели, однако через 2-3 недели у самок концентрация ФСГ в коже не отличалась от нормальных показателей, а у самцов выявлен ее рост через 2 недели. В результате коэффициент соотношения ЛГ/ФСГ у самок уменьшался, а у самцов увеличивался через 1 и 4 недели, а уменьшался только через 2 недели.
Опухоль у самок и самцов содержала повышенные концентрации ЛГ на протяжении всего эксперимента, однако уровень ФСГ оказался высоким только у самок и у самцов через 4 недели эксперимента (таблица 5.22). В результате коэффициент соотношения ЛГ/ФСГ в опухоли у самок оказался в пределах нормы, а у самцов повысился на этапах через 2 и 3 недели.
Основные половые различия в содержании ЛГ и ФСГ касались перифокальной зоны (таблица 5.23). У самок уровень ЛГ был либо снижен – через 2 недели, либо не отличался от нормы, а ФСГ превышал норму через 3-4 недели. У самцов данные показатели были выше нормы на протяжении всего эксперимента. В результате коэффициент соотношения ЛГ/ФСГ в перифокальной зоне у самок был ниже нормы, а у самцов превышал норму, за исключением 3-й недели.
У интактных животных половые различия в содержании эстрогенов были не столь значительны, как в отношении андрогенов: уровень эстрона в коже самок был в 1,3 раза выше, а эстриола в 1,9 раза ниже, чем у самцов. Содержание тестостерона в коже у самок оказалось в 4,2 раза ниже, а свТ в 86,8 раза ниже, чем у интактных самцов.
В динамике роста меланомы в непораженной коже у самцов установлено снижение содержания эстрадиола и небольшой прирост эстрона начиная с 3 недели. В тоже время у самок не изменилось содержание Е2, но повысилось Е1и Е3 (таблица 5.24). Коэффициент соотношения метаболитов эстрогенов у самок в коже снизился, а у самцов оставался в пределах нормы, за исключением снижения через 2 недели.
Рецепторный аппарат эстрогенов в непораженной коже у мышей с перевивной меланомой В16/F10 претерпел некоторые изменения: у самцов повысилось содержание ER только через 4 недели эксперимента, а ER через 3и 4 недели, у самок увеличение содержания в коже ER через 3-4 недели не сопровождалось повышением уровня ER (таблица 5.25).
Что касается рецепторов прогестерона и андрогенов, то их содержание в коже у самцов не отличалось от показателей нормы, тогда как у самок уровень RP4 был снижен на протяжении всего эксперимента.
В опухоли у самок установлен рост уровня Е2 и особенно Е1, без изменения содержания Е3 и с небольшим снижением коэффициента соотношения метаболитов 2ОНЕ/16ОНЕ в 1,3 раза. У самцов выявлен прирост концентрации Е1 в опухолевой ткани на фоне снижения и Е2, и Е3, без изменения коэффициента соотношения метаболитов (таблица 5.26).
У самок возрастание уровня эстрогенов в опухоли не повлияло на изменение содержания Т общего, однако снизило, с 3 недели уровень Тсв. У самцов установлено прогрессивное снижение содержания Т общего с резким падением Тсв.
Изменения содержания рецепторов в опухоли и ее перифокальной зоне у животных обоего пола оказались однонаправленными, но отличались своей интенсивностью.
В образцах меланомы установлено повышение содержания всех исследованных рецепторов у животных обоего пола, с более выраженным приростом ER у самцов, по сравнению с самками (таблица 5.27).
В перифокальной зоне у самок установлен рост уровня эстрона, начиная с момента выхода опухоли, а у самцов только с 3-й недели, то есть к моменту гибели большинства животных (таблица 5.28). Вероятно, что до 3 недели эстрон у самцов метаболизировался в эстриол, уровень которого в начале эксперимента (1-2 недели) повышался.
При этом содержание тестостерона у самцов было резко снижено (как свободной, так и общей формы), а у самок снижался уровень только активного, свТ, общая форма не отличалась от нормальных показателей.
У интактных животных уровень цАМФ в коже половых различий не имел тогда, как содержание пролактина было выше у самок.
В перифокальной зоне животных с перевивной меланомой возрастал уровень рецепторов эстрогенов обоих типов, с большей интенсивностью у самцов (таблица 5.29). Содержание рецепторов прогестерона увеличилось в перифокальной зоне только через 4 недели эксперимента.
Известно, что передача сигналов цАМФ позволяет меланоцитам противостоять УФ-повреждению за счет усиления синтеза УФ-блокирующего пигмента эумеланина и усиления восстановления ДНК-индуцированного повреждения ДНК (Jarrett S.G. et al., 2014; Wolf Horrell E.M. et al., 2017). Нарушение передачи сигналов цАМФ связано с повышенным риском развития меланомы кожи (Kadekaro A.L. et al., 2012; Rodrguez C.I. et al., 2017; 2018; Ma M. et al., 2019). В кожных меланоцитах млекопитающих цАМФ-опосредованные сигнальные пути, активируемые рецепторами, связанными с G-белком (GPCR), такими как рецептор меланокортина 1 (MC1R), играют критическую роль в гомеостазе меланоцитов, включая выживание клеток, пролиферацию и синтез пигмента(Rodrguez C.I., Setaluri V., 2014). Передача сигналов цАМФ может оказывать противоположные эффекты в первичной и метастатической меланоме, и этот переключатель в роли передачи сигналов цAMP опосредуется осью EPAC-RAP1 (Kadekaro A.L. et al., 2012).
В меланоцитах синтез меланина стимулируется повышением цАМФ(Amaro-Ortiz A. et al., 2014). Использование модели меланомы мыши, показывает, что активация передачи сигналов цАМФ ускоряет развитие опухоли меланомы в естественных условиях (Rodrguez C.I. et al., 2017; 2018). Однако роль цАМФ в развитии и прогрессировании меланомы до конца не изучена.
Таким образом, можно сказать, что существуют половые различия в функционировании ГГН, ГГТ и ГГГ осей у животных с перевивной меланомой В16/F10, которые, скорей всего, зависят от эволюционно заложенных особенностей организмов самцов и самок.
У самцов зафиксирована разбалансировка центральной гипоталамо-гипофизарной регуляции, начиная с 1 недели эксперимента, заключающаяся в отсутствии повышения АКТГ гипофиза в ответ на рост уровня кортиколиберина в гипоталамусе. При этом возрастание кортикостероидной активности надпочечников, очевидно, происходило в ответ, как на гипоталамические импульсы, так и на влияние эктопически синтезированного опухолью и окружающими ее тканями АКТГ. Кроме того есть вероятность подавления экспрессии синтеза АКТГ через сигналы обратной связи повышенным синтезом кортикостероидов кожей.
Разработка способа прогнозирования развития метастазов у больных меланомой кожи
Метастазирование меланомы регулируется фундаментальным процессом клеточной подвижности, в результате которого аберрантно трансформированные раковые клетки используют нормальные клеточные процессы, экспрессированныев гомеостазе и развитии (Mitra D, Fisher D.E. 2009; Bailey C.M. et al., 2012). В общих чертах, опухолевые клетки, которые относятся к преинвазивному фенотипу, достигают метастатического распространения посредством процессов интра- и экстравазации для остановки в анатомически отдаленных местах, где они восстанавливают свое пролиферативное программирование (Valastyan S., Weinberg Robert A. 2011). Хотя постепенно выясняются метастатические формы поведения клеток, общие для нескольких типов рака, точные молекулярные механизмы остаются неизвестными и имеют большого клинического значения (Zbytek B. et al., 2008; Damsky W.E. et al., 2011).
Несмотря на распространение по большинству типов тканей, меланома проявляет метастатический тропизм, преимущественно метастазированием в мозг, легкое, печень, тонкую кишку или кожу (Maxwell R. et al., 2017). Хотя конкретные механизмы тропизма опухолевой ткани до сих пор неясны, по-видимому, хемокиновые рецепторы играют важную роль в этом процессе (Plebanek M.P. et al., 2017).
Одной из важных задач клинической онкологии является поиск критериев прогноза заболевания до клинического проявления метастазов и рецидивов, что может способствовать индивидуализации тактики адъювантных методов лечения и, в конечном итоге, определить продолжительность жизни больного.
В рамках развития принципов трансляционной медицины мы разработали способ прогнозирования развития метастазов у больных меланомой кожи, заключающийся в том, что в ткани удаленной во время операции опухоли исследуют уровень VEGF C и VEGF A, рассчитывают величину их соотношения и при увеличении этого показателя относительно значений в интактной коже, полученной при оперативном лечении неонкологических больных (косметические операции), в 5 и более раз прогнозируют метастазы в лимфатические узлы, тогда как при снижении этого соотношения в 10 и более раз прогнозируют гематогенное метастазирование. Новизна такого подхода заключается в оценке индивидуальных особенностей ткани опухоли индуцировать ангиогенные факторы, ответственные за образование лимфатических (VEGF C) или кровеносных (VEGF A) сосудов. Мы учитывали факторы злокачественной опухоли, способные стимулировать неолимфангиогенез или неогемангиогенез и существенно влиять на развитие процесса при сходных морфологических и фенотипических свойствах меланомы.
Способ прогнозирования развития метастазов у больных меланомой кожи выполняется следующим образом:
Навеску ткани меланомы кожи, удаленной во время операции, в количестве 100 мг гомогенизировуют на льду с 1 мл 0,1 M калий-фосфатного буфера pH 7.4, содержащего 0,1% Твин-20 и 1% БСА. Полученныегомогенаты центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин, осадок отбрасывают. В приготовленной 10% цитозольной фракции методом ИФА с использованием стандартных тест-систем исследуют уровень VEGF C и VEGF A, рассчитывают соотношение первого ко второму. В качестве контрольных значений используют уровень VEGF C и VEGF A, а также соотношение первого ко второму, определенное в интактной коже неонкологических больных, полученной при выполнении косметических операций.
Под нашим наблюдением находилось 28 больных обоего пола, у которых при поступлении была диагностирована меланома кожи. Возраст больных колебался от 45 до 66 лет. Больные подвергались оперативному лечению в объеме иссечения опухоли, после операции устанавливалась стадия процесса - pT1-4 N0M0.Всем больным проводилось исследование уровней фактора роста эндотелия сосудовVEGF C и VEGF A, рассчитывалось соотношение VEGF C к VEGF A. В 16 образцах меланомы кожи (1 группа) соотношение VEGF C к VEGF A было в 5 и более раз выше (от 11,1 до 86,8), чем этот показатель в интактной коже, который был равен 2,2±0,06. В 8 образцах (2 группа) соотношение VEGF C к VEGF A было в 10 и более раз ниже (от 0,22 до 0,03), чем этот показатель в интактной коже. В 4 образцах меланомы кожи (3 группа) соотношение VEGF C к VEGF A колебалось от 3,2 до 9,0.
Динамическое наблюдение за этими пациентами выявило в сроки от 1 года до 1,5 лет появление:
- у 12 из 16 больных 1 группы метастазов в регионарные лимфатические узлы;
- у 5 из 8 больных - метастазы в висцеральные органы - у 2-х в печень, у 2-х - в легкие и у 1-го - в мозг.
Все больные 3-й группы живы в течение этого срока без признаков метастазирования.
В качестве доказательства приводим примеры клинического наблюдения.
Пример 1
Больная X., история болезни № С-16257/б, 1954 г.р., поступила в отделение реконструктивно-пластической хирургии 9.09.2012 г. с диагнозом: Меланома кожи правого плеча кл.гр. 2. При поступлении предъявляла жалобы на наличие пигментного опухолевого образования на коже правого плеча.
Объективно: На наружной поверхности правого плеча пигментное (иссиня черное) экзофитное образование с четкими границами, около 2,5 см в диаметре, наличие сателлита опухоли. Регионарные лимфоузлы не увеличены, безболезненны при пальпации, не спаяны с окружающими тканями.
Данные дополнительных методов обследования: ФЛО ОГК от 2.10.2012 - легкие и сердце без патологии.
УЗИ ОБП и регионарных л/у от 26.09.2012 г. - Гепатомегалия. Диффузные изменения паренхимы печени (по типу жирового гепатоза). Диффузные изменения поджелудочной железы. Уплотнение стенок желчного пузыря. Микролиты почек.
СРКТ ОГК, ОБП и малого таза от .09.12 г. – без патологии.
МРТ г. мозга от 15.10.12 г. – без патологии.
Проведенное лечение: операция (10.10.2012 г.) – широкое иссечение образования кожи правого плеча с пластикой ротационным лоскутом.
Верификация процесса (гистологический анализ № 62307-08/12): Меланома из невусоподобных клеток, ст. III по Кларку, 3 мм по Бреслоу, с подлежащей тканью.
В ткани меланомы методом ИФА определили уровень VEGF-C и VEGF-A, величина которых составила 1216,6 пг/мл и 29,2 пг/мл соответственно. Коэффициент соотношения VEGF-C/ VEGF-A был равен 41,7, т.е. коэффициент превосходил контрольные значения в 19 раз, что указывало на вероятность развития лимфогенного метастазирования.
Послеоперационный период протекал гладко, без осложнений. В п/о периоде проводилась а/б терапия медоцефом 1 г 1 р/д, курсом 5 дней. Рубец розовый. Заживление первичным натяжением.
Заключительный диагноз: (С 43.6) Меланома кожи в/з правого плеча pT3aN0M0, st. IIa, состояние после хирургического лечения кл. гр. 2.
С 1.10.12 по 23.10.12 г. получила курсы ДГТ на область п/о рубца и зоны лимфооттокав ГОД г. Шахты в СОД=40 изоГр., курсы иммунотерапии – роферон 3 млн. ME п/к 3 раза в неделю, с перерывами 2 недели, длительностью 8 месяцев.
Повторно больная X., история болезни № С-1625 7/б, 1954 г.р., поступила в отделение реконструктивно-пластической хирургии 17.07.2013 г. с диагнозом: Меланома кожи правого плеча pT3aN0M0, St. IIa, состояние после комбинированного лечения, интерферонотерапии, mts в аксиллярный л/у справа, кл.гр.2.
При поступлении предъявляла жалобы на наличие гиперплазированного л/у в подкрыльцовой области справа. Объективно: в п/о рубце на коже правого плеча без рецидива. При пальпации в аксиллярной области справа обнаружен гиперплазированный лимфоузел до 4 см в диаметре, умеренной подвижности, плотной консистенции.
Данные дополнительных методов обследования: ФЛО ОГК от 15.07.13 г. – сердце и легкие без патологии.
УЗИ ОБП и регионарных л/у от 15.07.2013 г. – Гепатомегалия. Диффузные изменения паренхимы печени (по типу жирового гепатоза). Диффузные изменения поджелудочной железы. Уплотнение стенок желчного пузыря. Микролиты почек. В правой аксиллярной области определяется единичный изоэхогенный л/у размером 4,2 см.
СРКТ ОГК, ОБП и малого таза от 15.07.13 г. – без патологии.
Проведенное лечение: операция (18.07.2013 г.) – подкрыльцово-подлопаточная ЛАЭ справа. Верификация процесса (гистологический анализ № 43010-11/13): метастаз меланомы.
Заключительный диагноз: (С 43) Меланома кожи правого плеча pT3aN0M0, st. IIa, состояние после комбинированного лечения, интерферонотерапии, mts в аксиллярные л/усправа, состояние после хирургического лечения, кл. гр. 2: Больная прошла 4 курса ПХТ дакарбазин 1000 мг в/в кап. в 1 и 8 день, метотрексат 40 мг в/в в 1 и 8 день, винкристин 1 мг/м2 в/в в 1 и 8 день. Перерыв до 28 дней. Под контролем OAK.