Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 11
Глава 2. Характеристика клинического материала, методов исследования и лечения. 40
Глава 3. Клиническая оценка результатов неоадъювантной химиоиммунотерапии у больных неоперабельным раком яичников IIIC–IV стадии 63
Глава 4. Морфологические, иммуногистохимические, ДНК цитометрические характеристики рака яичников при применении интерферона-гамма в курсе неоадъювантной химиотерапии 90
4.1 Морфологические и иммуногистохимические характеристики рака яичников 90
4.2 ДНК-цитометрические характеристики рака яичников 104
Глава 5. Динамика иммунного статуса больных раком яичников при применении интерферона-гамма в курсе неоадъювантной химиотерапии 111
Глава 6. Структура адаптационных реакций и особенности морфоструктуры сыворотки крови у больных раком яичников при применении интерферона-гамма в курсе неоадъювантной химиотерапии 121
6.1 Изучение структуры адаптационных реакций у больных с раком яичников 121
6.2 Изучение морфоструктуры сыворотки крови у больных с раком яичников 129
Заключение 140
Выводы 156
Практические рекомендации 158
Список сокращений 159
Список литературы 160
- Клиническая оценка результатов неоадъювантной химиоиммунотерапии у больных неоперабельным раком яичников IIIC–IV стадии
- Морфологические и иммуногистохимические характеристики рака яичников
- Динамика иммунного статуса больных раком яичников при применении интерферона-гамма в курсе неоадъювантной химиотерапии
- Изучение морфоструктуры сыворотки крови у больных с раком яичников
Введение к работе
Актуальность темы. Рак яичников (РЯ) в структуре смертности от злокачественных новообразований женских гениталий занимает одно из лидирующих мест (Каприн А.Д., Старинский В.В. и соавт., 2016, 2017). Ведущим методом лечения рака яичников в настоящее время является хирургический, с которого и рекомендуется начинать лечение (Кузнецов В.В., 2016; Тюлян-дин С.А., и соавт., 2016; Penson R.T. et al., 1999; Сolombo N. et al., 2010; Kang S., Jong Y.H. et al., 2011). Однако у 70–80% больных выявляются распространенные стадии заболевания (Жордания К.И. и соавт., 2017; Wenham R.M., 2011; Morgan R.J. et al., 2016), когда выполнить радикальную операцию не всегда бывает возможно без предварительной цитостатической терапии, которая позволяет не только уменьшить размеры опухоли, но и улучшить общее состояние пациенток (Тюляндин С.А., Деньгина Н.В., 2016; Тюляндина А.С. и соавт., 2017; Сухих Г.Т., Ашрафян Л.А., 2017; Thrall M.M. et al., 2011; Kehoe S. et al., 2015). В настоящее время «золотым стандартом» при проведении курсов химиотерапии у больных РЯ является комбинация препаратов карбоплатин и паклитаксел. С целью повышения возможностей и эффективности проведения противоопухолевой лекарственной терапии она в настоящее время нередко дополняется иммуномодуляторами, что в свою очередь может значительно снижать токсический и иммуносупрессивный эффект противоопухолевых препаратов (Платинский А.В., 2010; Брюзгин В.В., 2014; Переводчикова Н.И., 2015; Титов К.С., 2016; Nemunalis J., 1999). Современными авторами показана эффективность применения при некоторых заболеваниях химиотерапии в комбинации с рекомбинантным интерфероном-гамма, который известен своим имму-номодулирующим и цитостатическим действием (Платинский А.В., 2010; Када-гидзе З.Г., 2013; Пыльцин С.П., 2013; Шмелев В.А., 2013; Хрянин А.А., Решетников О.В., 2016; Решетников О.В., Присяжная Н.В. и соавт., 2016). С учетом вышеизложенного представляется актуальным изучение применения интерферона-гамма в курсах неоадъювантной химиотерапии РЯ и сравнительная характеристика клинической эффективности и ряда лабораторных показателей при различных способах введения иммуномодулятора.
Степень разработанности проблемы
Несмотря на постоянное усовершенствование методов лечения больных IIIC–IV стадией, неоперабельным, распространенным раком яичников, результаты остаются неудовлетворительными (Новикова Е.Г, Московская Е.Ю., 2015; Жорданиа К.И. и соавт., 2017; Пирмамедова С.С., Антонеева И.И., 2017, Leder-mann J.A., Kristeleit R.S., 2010). Неоадъювантная химиотерапия занимает важное место в лечении больных данной категории и позволяет улучшить непосредственные результаты проводимого лечения (Новикова Е.Г. и соавт., 2004; Павлова Т.Д., 2006; Мелько А.И. и соавт., 2006; Меньшенина А.П., 2009; Каирбае-ва М.Ж., 2009; Ашрафян Л.А. и соавт., 2015; Morice P. et al., 2003; Weinberg L.E. et al., 2010; Menczer J. et al., 2011). Иммунотерапия в онкологии в настоящее время доказала свою эффективность, однако стандартные подходы до сих пор не определены (Степура Л.А.1998; Платинский Л.В. и соавт. 2010; Брюзгин В.В. и соавт., 2014; Хаитов Р.М., Кадагидзе З.Г., 2018; Vlad A.M. et.al.,2009; Ghoneum M. 2011). Таким образом, поиск путей оптимизации и повышения эффективности лечения с применением иммуномодуляторов, в частности препаратов интерферона-гамма у таких больных остается актуальной проблемой онкогинекологии.
Цель исследования
Улучшение результатов лечения больных распространенным, неоперабельным раком яичников IIIС–IV стадий, асцитной формой путем применения неоадъювантной химиотерапии с рекомбинантным интерфероном-гамма.
Поставленная цель достигнута решением следующих задач:
-
Разработать методику неоадъювантной химиоиммунотерапии с применением рекомбинантного интерферона-гамма для лечения больных с IIIС-IV стадией рака яичников и оценить непосредственные и ближайшие результаты проведенного лечения.
-
Дать оценку иммунного статуса больных с IIIС–IV стадией рака яичников при проведении химиотерапии с применением и без применения интерферона-гамма.
-
Исследовать лекарственный патоморфоз, показатели пролиферации и апоптоза в образцах удаленной опухоли у больных раком яичников после хи-
миотерапии с применением и без применения интерферона-гамма.
-
Изучить ДНК-цитометрические показатели рака яичников IIIС–IV стадий после химиотерапии с применением и без применения интерферона-гамма.
-
Исследовать изменения характера адаптационных реакций и морфоструктуры фаций сыворотки крови у больных раком яичников после химиотерапии с применением и без применения интерферона-гамма.
Научная новизна работы
впервые разработан и применен в клинической практике вариант неоадъювантной химиоиммунотерапии с внутримышечным и внутрибрюшин-ным введением рекомбинантного интерферона-гамма больным с неоперабельной IIIС–IV стадией рака яичников (Патент на изобретение № 2624509 от 04.07.2017)
впервые выполнен сравнительный анализ эффективности внутримышечного и внутрибрюшинного введения рекомбинантного интерферона-гамма в комплексе с неоадъювантной химиотерапией у больных с IIIС–IV стадией рака яичников; проведена оценка результатов лечения, а также состояния иммунной системы, структуры адаптационных реакций, иммуногистохимиче-ских, морфологических, ДНК-цитометрических изменений в опухоли; на основании полученных результатов лабораторных исследований с использованием разработанного метода оценки прогнозирования рецидива по результатам ДНК-цитометриии опухолевой ткани (Патент на изобретение № 2530556 от 10.10.2014) показана более высокая эффективность и меньшая токсичность химиотерапии в сочетании с интерфероном-гамма по сравнению с неоадъювантной химиотерапией без иммунотерапии.
Теоретическая и практическая значимость работы
На основании проведенного исследования установлено усиление эффективности неоадъювантной химиоиммунотерапии IIIС–IV стадией рака яичников, асцитной формы, при включении в лечение больных внутримышечного или внутрибрюшинного введения интерферона-гамма за счет его иммуномодулирую-щего, адаптагенного и антипролиферативного действия. Полученное улучшение
непосредственных и ближайших результатов позволяет рекомендовать метод для лечения больных данной категории в онкологических стационарах.
Методология и методы диссертационного исследования
Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне открытого сравнительного проспективного исследования с использованием анамнестических, общеклинических, лабораторных, статистических методов исследования.
Внедрение в практику
Метод неоадъювантной химиоиммунотерапии внедрен и применяется в отделении гинекологии ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России.
Основное положение, выносимое на защиту
Применение неоадъювантной химиоиммунотерапии с интерфероном-гамма у больных распространенным неоперабельным раком яичников, асцит-ной формы, IIIС–IV стадии целесообразно, так как улучшает непосредственные и ближайшие результаты лечения за счет снижения агрессивности опухолевого процесса путем угнетения пролиферативной активности опухоли, усиления лечебного патоморфоза, иммуномодулирующего действия и формирования неспецифических адаптационных реакций антистрессорного типа.
Степень достоверности результатов
Определяется достаточным количеством обследованных больных в процессе исследования, формированием сопоставимых групп сравнения, адекватными методами исследования, корректными методами статистической обработки. Сформированные в диссертации выводы, положение и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа результатов выполненных исследований.
Апробация диссертации
Апробация работы состоялась 7 декабря 2017 года на заседании Ученого Совета ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России. По результатам исследования сделан устный доклад: на II Национальном научно-образовательном Конгрессе «Онкологические проблемы от менархе до постменопаузы», 14-16 февраля
2018 г., г. Москва и Первом всероссийском междисциплинарном онкологическом форуме с международным участием «Актуальные вопросы онкологической помощи», 20-21 апреля 2018 г., г. Алушта.
Соответствие диссертации паспорту специальности
Основные описанные положения диссертации и выводы, соответствуют п. 2 «Исследования по изучению этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, основанные на достижениях ряда естественных наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии и других) и п. 6 «Внедрение в клиническую практику достижений фармакологии в области создания и использования цитостатиков, гормонов, биологически активных препаратов» паспорта специальности 14.01.12 – «онкология».
Публикации
Основные положения диссертации опубликованы в 29 работах, их них 7 в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования России, получено 2 патента на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, клинической характеристики материала и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 366 источников, из них 220 отечественных и 146 зарубежных. Работа содержит 56 таблиц и 35 рисунков.
Клиническая оценка результатов неоадъювантной химиоиммунотерапии у больных неоперабельным раком яичников IIIC–IV стадии
Согласно задачам нашего исследования, после окончания неоадъювантного лечения мы оценивали непосредственные и ближайшие результаты лечения, характер и выраженность побочных реакций в зависимости от проводимой терапии. Характеристика изменения жалоб больных до и после проведения НАХТ представлены в таблице 3.1.
До проведения лечения всех больных беспокоили увеличение живота в объеме и расстройство мочеиспускания. После проведения полихимиотерапии с внутримышечным введением интерферона-гамма зафиксировано значительное уменьшение живота в размере со 100% (22 пациентки) до 22,7% (5 пациенток) (р 0,05), также выявлена нормализация суточного диуреза – олигурия зарегистрирована только у 6 (27,3%) (р 0,05). После проведения неоадъювантной полихимиотерапии в комплексе с внутримышечным введением интерферона-гамма отмечено уменьшение жалоб на боли в эпигастрии с 22,7% (5 пациенток) до 4,5% (1 больная) и внизу живота с 72,7% (16 человек) до 22,7% (5 человек) (р 0,05). В результате проведенного лечения отмечено снижение массы тела у 22,7% больных, против 54,5% до лечения (р 0,05).
Кашель и одышка уменьшились с 59,1% (13человек) до 13,6% (3 человека), (р 0,05). Также отмечалось уменьшение отеков нижних конечностей у больных с 18,2% (4 больных) до 9,1% (2 женщины). Уменьшились такие признаки интоксикации как: рвота, тошнота – с 27,3% (6 больных) до 4,5% (1 больная) (р 0,05), общая слабость – с 81,8% (18 человек) до 31,8% (7человек) (р 0,05), снижение или отсутствие аппетита – с 95,5% (21 больная) до 13,6% (3 больных) (р 0,05). Таким образом, применение ВМХИТ позволяет улучшить общее состояние больных, о чем свидетельствует почти полное купирование или значительное уменьшение основных жалоб больных.
В результате проведения химиоиммунотерапии с внутримышечным введением интерферона-гамма произошли изменения и в локальном статусе, в виде уменьшения опухолей, которые отражены в таблице 3.2.
Из данных, представленных в таблице 3.2, видно, что после проведенния ВМХИТ количество пациентов с опухолями небольшого размера (до 5см) значительно увеличилось с 36,4% (8 больных) до 59,1% (13 больных), за счет регрессии опухоли после НАХТ и уменьшения ее размера. Так, до лечения опухоли более 10см были отмечены у 4 больных(18,2%), а после лечения только у 1 (4,5%), т.е. уменьшились на 13,7%. Если до лечения подвижные опухоли отсутствовали, то после химиоиммунотерапии количество больных с подвижными опухолями увеличилось до 59,1% (13 человек). Вследствии проведенного лечения уменьшилось количество пациентов с метастазами в задний свод (с 54,5 до 31,8%). Резорбция асцита после химиотерапии у отмечена большинства больных (со 100,0% случаев до 22,7, р 0,05). Также отмечено значительное уменьшение количества пациенток с пальпируемым в мезогастральной области метастатически измененного большого сальника с 90,9 до 18,2% (р 0,05). Кроме того, до лечения у 27,3% больных отмечено наличие жидкости в плевральной полости, после лечения плеврит резор-бировался у 22,8% (с 27,3 до 4,5%, р 0,05).
В дальнейшем нами были проанализированы данные УЗ-исследования больных раком яичников с ВМХИТ до и после проведения НАХТ (таблица 3.3)
Ультразвуковое исследование после проведения неоадъювантной полихимиотерапии с внутримышечным введением интерферона-гамма, выявило ряд немаловажных изменений, а именно, увеличилось количество пациенток, у которых опухоли были до 5см с 7 (31,8%) до 12 больных – 54,5%, опухоли свыше 10 см определялись у 4 (18,2%) до, а после лечения опухоли больших размеров определялись лишь у 4,5% больных (1 женщина). В 68,1% (15 больных) отмечена полная резорбция асцита, в 31,8% (7 человек) отмечено наличие выпота в заднем своде или по флангам брюшной полости в умеренном количестве (р 0,05). Частота выявления пальпируемого метастатически измененного большого сальника уменьшились с 86,4% до 13,6% (р 0,05). Метастазы в задний свод в виде узлового образования определялись только лишь у – 9,1%, по сравнению с 59,1% больных до лечения (р 0,05).
Оценка непосредственного эффекта от проведенной НАХТ представлена в таблице 3.4, из которой видно, что полная регрессия опухоли наступила у 27,3%, частичная регрессия опухоли достигнуа у 40,9% пациенток, таким образом, объективный эффект (полная и частичная регрессия), отмечен у 68,2%, стабилизация процесса отмечена у 31,8%. Ни у одной больной не было зарегистрировано про-грессирование заболевания.
После проведения химиоиммунотерапии с внутримышечным введением иммуномодулятора все больные данной группы подверглись хирургическому лечению (таблица 3.5).
За «полный объем» оперативного пособия считали экстирпацию матки с придатками с резекцией или экстирпацией большого сальника. Неполный объем оперативного пособия заключался, как правило, в удалении опухолей яичников с резекцией большого сальника. Однако, основной целью неоадъювантного лечения является выполнение максимальной циторедукции, так чтобы объем остаточной опухоли не превышал 1 см.
Оценка характера операции в зависимости от объема остаточной опухоли: оптимальная циторедуктивная операция – отсутствуют визуальные признаки остаточной опухоли в брюшной полости; субоптимальная циторедуктивная операция – остаточной опухоли в наибольшем измерении не более 2 см; неоптимальная циторедуктивная операция – остаточная опухоль в наибольшем измерении более 2 см (Чиссов В.И., Давыдов М.И., 2008).
Как видно из таблицы 3.5, оптимальной и субоптимальной циторедукции было подвергнуто 18 больных (81,8%), пробных лапаротомий не было.
С целью оценки эффективности и целесообразности применения предоперационной химиотерапии с внутримышечным введением интерферона-гамма мы сравнили полученные результаты с контрольной группой без иммунотерапии.
В таблице 3.6 и 3.7. представлена оценка непосредственных клинических результатов.
Процент достижения эффекта в виде полной клинической регрессии был более высокий в подгруппе с ВМХИТ – 27,3% против 7,7% в контрольной группе. Частота частичных регрессий составила в первой подгруппе 40,9%, в контрольной – 38,5%. Следует отметить, что в группе контроля у 3,8% больных после прове денного неоадъювантного лечения было выявлено прогрессирование заболевания. Случаев прогрессирования злокачественного процесса в подгруппе с ВМХИТ не наблюдалось (таблица 3.6).
Из данных, представленных в таблице 3.7, видно, что при применении хи-миоиммунотерапии количество выполненных оптимальных и субоптимальных циторедуктивных операций, статистически значимо больше, чем в группе со стандартной химиотерапией без введения интерферона-гамма.
Итак, на основании вышеприведенных данных, можно сказать, что применение химиоиммунотерапии с внутримышечным введением интерферона-гамма способствует уменьшению размеров опухоли и улучшению общего состояния больных, что свидетельствуют в пользу эффективности проведенного лечения, по причине которого полной и частичной регрессии удалось достичь у 68,2% больных (прогрессии опухоли не отмечено ни в одном случае); что в свою очередь позволило у 81,8% больных выполнить радикальный объем операции.
Получив хорошие результаты лечения в группе больных с внутримышечным введением интерферона-гамма в комплексе с химиотерапией (ВМХИТ), и имея данные литературы о том, что у больных с диссеминированным раком яичников и наличием асцита некоторыми авторами применялось внутрибрюшинное введение различных иммуномодуляторов и при этом показано, что особой эффективностью обладают цитокины: ИЛ-2 и интерферон-гамма (Pujade-Lauraine E., 1996; Титов К.С., 2011, 2016; Feedman R.S., 2000; Nagamine I.,Yamaguchi Y., 2009), нами была набрана вторая основная подгруппа с внутрибрюшинным введением интерферона-гамма в комплексе с химиотерапией (24 человека). Больным с неоперабельной IIIС–IV стадией рака яичников в условиях стационара, перед началом химиотерапии и после удаления асцитической жидкости, в брюшную полость вводился дренаж.
Морфологические и иммуногистохимические характеристики рака яичников
При проведении гистологического исследования у большинства больных после выполненного лечения отмечался лекарственный патоморфоз разной степени выраженности. В группе, где проводилась химиотерапия без введения интерферона-гамма, патоморфоз был не столь выражен (I–II степень) и отмечался лишь в 23% (6 из 26), определяясь в виде одиночных петрификатов, небольших очагов некроза и фиброза в опухоли. II–III степень патоморфоза была характерна для пациенток, которым проводилась химиоиммунотерапия с внутримышечным введением интерферона-гамма; она была определена у 55% больных (12 из 22) (рисунок 4.4, 4.5). У пациенток, получавших химиоиммунотерапию с внутрибрюшинным введением интерферона-гамма, преобладал выраженный терапевтический патоморфоз III–IV степени, который наблюдался в 42% случаев (10 из 24), а II–III степень была отмечена только у 25% (6 из 24) (рисунок 4.1, 4.2, 4.3, 4.6). После лечения с применением интерферона-гамма опухоль определялась в виде папиллярных раковых структур с большим количеством псаммомных телец или петрификатов.
Некоторые характеристики морфологических показателей эффективности лечения представлены в таблице 4.1.
Одним из наиболее объективных критериев эффективности противоопухолевой терапии является показатель митотической активности. При применении химиоиммунотерапии было установлено достоверное снижение активности опухолевых клеток. Митотическая активность у пациенток группы с ХТ снизилась на 56,5% по сравнению с группой, которой проводили только хирургическое лечение, а у пациенток с ВБХИТ данный показатель снизился на 80% (p 0,05). Дистрофические изменения опухолевых клеток также были выражены в значительной степени у пациенток с ВБХИТ, увеличение составило на 29% по сравнению с пациентками в группе ХТ и на 52% по сравнению с пациентками без НАХТ (p 0,05). С увеличением количества поврежденных клеток возрастали частота и размеры участков некроза: у пациенток подгруппы с ВБХИТ участки некроза встречались чаще на 27% по сравнению с таковыми из группы с ХТ, хотя различия оказались недостоверны (p0,05), и на 82% по сравнению с группой операция без НАХТ (различия достоверны p 0,05).
Под влиянием лечения одновременно с выраженными дистрофическими и некротическими процессами в опухоли происходили также процессы резорбции и замещения погибшей ее части соединительной тканью. Проведение неоадъ-ювантной химиотерапии привело к снижению площади паренхимы. Так, проведение ХТ способствовало снижению данного показателя на 10% по сравнению с группой, где проводилась операция без НАХТ, что оказалось статистически недостоверным (p0,05). В опухолях же пациенток подгруппы с ВБХИТ было выявлено статистически достоверное изменение общей структуры: уменьшение площади паренхимы на 36,5% (p 0,05), при увеличении площади стромы на 26%, что свидетельствовало о выраженном патоморфозе III–IV степени (рисунок 4.1, 4.2, 4.3).
Итак, результаты морфологического исследования показали преобладание патоморфоза III–IV степени у пациентов с ВБХИТ при сравнении с пациентами из других групп.
Для определения влияния химиоиммунотерапии на процессы пролиферации и апоптоза была исследована экспрессия маркеров Ki-67 и mt р53. В развитии апоптоза центральную роль играют ген-супрессор опухолевого роста и соответствующий ему белок р53 (Шульга А.В., Басинский В.А., 2009). Самое частое регистрируемое генетическое нарушение при развитии злокачественных опухолей является мутации гена p53. Белок p53 экспрессируется во всех клетках организма. В клетке при неимении повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при мутации p53 клетки вынуждены входить в клеточный цикл с поврежденной и нерепарированной ДНК, поэтому их деление становится неуправляемым процессом (Карапетян В.Л., Степанова Е.В., 2011). В норме белок p53, кодируемый одноименным геном, быстро деградирует в протеосомах и живет приблизительно 20 минут и поэтому в клетках большинства тканей находится на пороге детекции. Его содержание оказывается ниже чувствительности иммуногистохимических методов. Мутантный же p53 (mt р53) существует от 24 часов до нескольких дней и накапливается в ядрах опухолевых клеток.
Антиген Ki-67 экспрессируется фактически во всех фазах митотического цикла, и в соответствии с этим отражает пролиферативный пул опухоли (Khouja M.H., 2007). Данный антиген выявляется соответствующими монокло-нальными антителами и представляет собой короткоживущий протеин, который разрушается в течение 1,5–2 часов. Поэтому антитела к Ki-67 выявляют только делящиеся клетки, так как Ki-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2012). Пролиферативный индекс Ki-67 рассматривается как предсказательный фактор для определения чувствительности к химио- и лучевой терапии, является независимым прогностическим признаком возникновения рецидива, общей и безрецидивной выживаемости (Чу-руксаева О.Н., Коломиец Л.А., 2012).
В результате ИГХ-исследования было выявлено, что в группе больных, не получавших НАХТ, экспрессия mt р53 отмечалась у 76,2% (16 из 21) из них, тогда как отрицательная реакция наблюдалась у 23,8% (5 из 21) больных; разброс количества окрашенных клеток при этом находился в пределах от 10,0 до 75,0% клеток (рисунок 4.7). Высокая экспрессия mt р53 наблюдалась у 9 пациентов из 21, что составляло 43,0%.
После проведения неоадьювантной химиотерапии (ХТ) накопление mt р53 в ядрах опухолевых клеток встречалось у 80,8% (21 из 26) пациентов, отсутствие экспрессии наблюдалось в 19,2% случаев (5 из 26), разброс количества окрашенных клеток при этом находился в пределах от 7,0 до 90% клеток (рисунок 4.8). Высокая экспрессия mt р53 наблюдалась у 7 пациентов из 26, что составляло 27%.
В подгруппе больных, получавших неоадъювантную химиоиммунотерапию и внутримышечное введение интерферона-гамма (ВМХИТ), положительная экспрессия mt р53 в ядрах опухолевых клеток была отмечена у 27,3% (6 из 22) больных, а преобладало отсутствие экспрессии, наблюдаемое у 72,7% (16 из 22) пациентов, при этом разброс количества окрашенных клеток находился в пределах от 10,0 до 40% клеток (рисунок 4.9).
В подгруппе, получавшей неоадъювантную химиоиммунотерапию и внут-рибрюшинное введение интерферона-гамма (ВБХИТ), положительная реакция на mt р53 в опухолевых клетках определялась лишь у 16,7% (4 из 24) пациентов, а преобладала, как и в предыдущем случае, отрицательная реакция, составлявшая 83,3% (20 из 24) больных; разброс количества окрашенных клеток был от единичного окрашивания до 30% клеток (рисунок 4.10).
Как видно из таблицы 4.2, проведение неоадъювантной химиотерапии не вызывало статистически достоверных различий экспрессии mt р53 по сравнению с группой без ее выполнения. При этом включение в курс НАХТ интерферона-гамма приводило к статистически значимому снижению экспрессия mt р53, в большей мере выраженному при внутрибрюшинном применении иммуномодулятора. Так, в опухолевых клетках пациентов подгруппы с ВБХИТ экспрессия mt р53 была в 2,2 раза ниже по сравнению с пациентами подгруппы с ВМХИТ, в 4,3 раза ниже по сравнению с больными группы ХТ и в 4,1 раз – по сравнению с пациентами группы без НАХТ (данные статистически достоверны при р 0,05). У больных подгруппы с ВМХИТ данный показатель был ниже в 1,9 раза, чем в группе ХТ (данные статистически достоверны при р 0,05). Распределение разброса окрашенных клеток маркером р53 у пациентов всех групп изображено на рисунке 4.11.
При распределении по критерию 2 связь между факторным и результативным признаками всех исследуемых групп была статистически значима (30,813 11,345) при уровне значимости р 0,01.
Среднее значение экспрессии mt р53 в ядрах опухолевых клеток у пациентов из подгруппы с ВБХИТ было ниже по сравнению с экспрессией данного маркера у больных из подгруппы ВМХИТ на 55% (р 0,05), из группы больных с ХТ – на 77% (р 0,05), а из группы без НАХТ на 76% (р 0,05). Среднее значение экспрессии mt р53 в ядрах опухолевых клеток у пациентов из подгруппы с ВМХИТ было ниже по сравнению с экспрессией данного маркера у больных из группы с ХТ на 48 % (р 0,05), из группы без НАХТ на 46% (р 0,05). При сравнении данного показателя между пациентами без НАХТ и группы с ХТ оказалось, что разница была совсем небольшая и составляла всего 4% с преобладанием экспрессии в ядрах опухолевых клеток у больных группы с ХТ (р 0,05).
При оценке пролиферативного потенциала клеток по экспрессии Ki-67 у пациентов исследуемых групп было выявлено наличие низкой, умеренной проли-феративной активности (ПА) во всех группах, а высокая экспрессия маркера обнаружена только в опухолевых клетках больных группы, где в предоперационном периоде не было лекарственного воздействия на опухоль. Полученные результаты представлены в таблице 4.3.
Динамика иммунного статуса больных раком яичников при применении интерферона-гамма в курсе неоадъювантной химиотерапии
Как описано в Обзоре литературы, рак яичников, а также проводимое лечение, в частности, химиотерапия, приводят к нарушениям иммунного статуса больных, вследствие чего снижаются возможности организма противостоять развитию рецидивов и генерализации заболевания в дальнейшем. Исходя из известных к настоящему времени свойств интерферона-гамма, нами была предложена схема применения препарата ингарона на его основе в курсе неоадъювантной химиотерапии.
Интерферон-гамма (IFN-) является одним из важнейших медиаторов межклеточных взаимодействий в иммунной системе и отчасти вне ее. Он продуцируется Т-лимфоцитами, в частности, Th1, эффекторными Т-клетками, NК-клетками, натуральными Т-киллерами (NKT), аутокринно и паракринно регулируя их активность, обладает противоопухолевым и противовирусным действием.
IFN- регулирует дифференцировку и функции многих иммунокомпетент-ных клеток, вовлечен во все аспекты Th1-опосредованного иммунного ответа путем контроля процессов дифференцировки и активации Т-лимфоцитов, обеспечивающих клеточные иммунныe реакции, при этом ингибируя развитие Th2-пути. Однако в литературе есть данные и о том, что он способствует развитию регуля-торных Т-клеток (T regs) (Agnello D. et al., 2003), т.е. потенциально может не только стимулировать, но и ингибировать Т-клеточный ответ. Поскольку различные компоненты цитокиновой сети взаимосвязаны, он через активацию макрофагов способен влиять на секрецию других цитокинов, а также хемокинов, которые привлекают эффекторные клетки в патологический очаг (Hu X. et al., 2008).
В многочисленных публикациях, начиная еще с конца предыдущего столетия, описана роль IFN- как цитокина, препятствующего развитию и распространению злокачественной опухоли: его антипролиферативное действие на опухолевые клетки (Hobeika A.C. et al., 1999; Platanias L.C. et al., 1999), например, путем влияния на гены клеточного цикла, в результате чего происходит задержка клетки в G1/S фазе (Zhao Y.H. et al., 2013), индукция апоптоза (Chawla-Sarkar M. et al., 2003), ингибирование ангиогенеза за счет снижения синтеза фактора адгезии alphaVbeta3-интегрина (Ruegg C. et al., 1998; Beatty G. et al., 2001).
В обзоре А.В. Ванхальского (2014) детально проанализированы позитивные и возможные негативные эффекты IFN- на развитие опухоли и приведены данные о неоднозначности его роли: с одной стороны, он проявляет антипролифера-тивное, проапоптотическое, антиангиогенное действие; с другой стороны, поддерживает активный воспалительный ответ по Th1-типу, на фоне которого новообразование может развиваться и прогрессировать; разноречивы также данные о том, способен ли он повышать или снижать распознаваемость опухолевых клеток для клеток иммунной системы. Эти аспекты следует учитывать при клиническом применения ингарона, в частности, с помощью новых способов его введения. Так, при внутрибрюшинном введении происходит непосредственное взаимодействие препарата не только с опухолевыми клетками рака яичника, но и с перитонеаль-ными макрофагами, продуцирующими провоспалительные цитокины, негативная роль гиперпродукции которых в очаге опухолевого роста показана при различных злокачественных опухолях (Златник Е.Ю., Неродо Г.А. и соавт. 2016; Никипело-ва Е.А., Кит О.И., 2016). Присутствие в перитонеальной полости макрофагов 2-го типа и высокого количества Т regs (Курганова Е.В. и соавт., 2008) также содержит опасность стимуляции опухолевого роста.
В эксперименте на модели мышиной меланомы В16 были получены данные о том, что комбинация Ронколейкина с Ингароном при локальном (паратумораль-ном) введении вызывала выраженный антиметастатический эффект на фоне активации Т-клеточного звена, а именно, повышения плотности расположения тимо-цитов в дольках тимуса и содержания Th в селезенке (Златник Е.Ю. и соавт., 2017). Описано также повышение клинического эффекта при паратуморальном применении цитокинового препарата рефнота у больных раком молочной железы в курсе неоадъвантной химиотерапии, который также сопровождался положительной иммунологической динамикой (Владимирова Л.Ю., Подзорова Н.А., 2016)
Итак, определение показателей иммунного статуса больных раком яичника при применении ингарона в предлагаемом нами режиме представляется важным для комплексной оценки полученного эффекта.
Иммунный статус больных до начала лечения характеризовался угнетением Т-клеточного звена за счет Т-хелперно-индукторных клеток: количество Т-лимфоцитов (СD3+) составляло 62,1±2,8%, СD3+СD4+ клеток 36,2±1,6%; при этом уровни СD3+СD8+ лимфоцитов и СD16+СD56+(NК)-клеток были в пределах нормы (25,7±1,83 и 18,8±2,77% соответственно).
В таблице 5.1 представлена динамика показателей клеточного иммунитета больных раком яичников, получавших интерферон-гамма различными способами, в курсе неоадъювантной химиотерапии, а также группы без введения интерферона-гамма.
Как видно из таблицы 5.1, после 1-го курса НАХТ у больных с ХТ без введения интерферона-гамма не происходило статистически достоверных изменений исследованных показателей иммунного статуса. При этом у больных, получавших интерферон-гамма внутримышечно, получено статистически значимое повышение по сравнению с исходным фоном уровней CD3+ при снижении содержания CD19+. Внутрибрюшинное введение интерферона-гамма дополнительно приводит к повышению общего процентного содержания лимфоцитов и количества CD3+CD4+ клеток.
Подобная иммунологическая динамика сохранялась и по окончании нео-адъювантного лечения. Данные приведены в таблице 5.2 без разделения на курсы, так как разные больные получали разное количество курсов НАХТ (от 2 до 4).
Так, после окончания курсов неоадъювантного лечения у больных, получавших внутримышечное и внутрибрюшинное введение интерферона-гамма, наблюдались более высокие по сравнению с исходными уровни CD3+CD4+ и более низкие – CD19+ лимфоцитов. В этот же срок исследования уровень CD16/56+ лимфоцитов статистически достоверно снижался в группе с ХТ без введения интерферон-гамма и у больных, получавших интерферон-гамма внутримышечно, а после его внутрибрюшинного введения снижения данного показателя не отмечено, что говорит о большей сохранности NK-звена иммунной системы при таком методе введения препарата.
Итак, применение рекомбинантного интерферона-гамма (ингарон) в курсе неоадъювантной химиотерапии приводит к положительной динамике иммунного статуса, статистически значимой по уровню Т-лимфоцитов за счет хелперно-индукторной субпопуляции, при этом происходит снижение уровня В-лимфоцитов. Внутрибрюшинное и внутримышечное введение интерферона-гамма в целом приводит к сходным позитивным изменениям клеточного иммунитета по сравнению с исходным фоном, в отличие от группы, где интерферон-гамма не применялся, однако по ряду показателей некоторые преимущества отме чены при внутрибрюшинном введении (таблица 5.3).
Изучение морфоструктуры сыворотки крови у больных с раком яичников
Визуализировать информацию о состоянии организма в целом, выявлять патологические отклонения, расширять представления о патогенезе опухоли и характеризовать эффективность противоопухолевого лечения с высокой степенью информативности позволяет анализ показателей процессов самоорганизации жидких сред, в частности изучение характера изменений морфологической структуры сыворотки крови (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001).
При изучении морфологии сыворотки крови практически здоровых доноров и больных раком яичников были идентифицированы их основные морфотипы, а также установлены показатели структур твёрдой фазы, образующихся при накоплении в организме разнообразных аномальных веществ и отнесённых к группе патологических элементов. Структурные особенности фации сыворотки крови практически здоровых доноров соответствовали радиальному и частично радиальному морфотипу. Для этих морфотипов была характерна радиальная симметричность расположения секторов, отдельностей, конкреций и отсутствие патологических структур (рисунок 6.3).
При анализе фации сыворотки крови у большинства больных раком яичников до проведения лечебных мероприятий и контрольной группы было установлено нарушения системного ритма кристаллизации, которые проявились в выраженном возрастании аморфных типов фаций с полным отсутствием основных структурных элементов: радиальных трещин, секторов, конкреций (рисунок 6.4).
По заключению В.Н. Шабалина и С.Н. Шатохиной (2001) появление таких аморфных фаций следует трактовать как результат значительного замедления большинства энергетических процессов в организме больного опухолью человека, приводящих к резкому понижению количества кристаллических структур, растворенных в фации. Поверхность фации была представлена аморфной массой с единичными кристаллами, утратившими ауторитмичные свойства и асимметрично расположенными на пористом белковом поле. Данные изменения говорят о глубоких нарушениях концентрационных взаимодействий. Если у практически здоровых доноров в фации сыворотки крови рост лучей кристаллов был направлен к центру, то в контрольной группе заменялся хаотичным иррадиальным кристаллическим ветвлением, зачастую перпендикулярным радиусу фации; в 63,1% случаев у таких фаций отмечается отсутствие или значительные аномалии круговых концентрационных волн. Одним из наиболее часто встречаемых дефектов структурирования у больных контрольной группы была утрата радиально-лучевой симметрии роста кристаллов солей. В этой группе кристаллизация с преимуществом ассиметричных иррадиальных и циркулярных типов фаций составляет 2/3 всех образцов (рисунок 6.5). При тяжелых патологических состояниях у ряда больных было зафиксировано появление двойной фации, слияние концентрационных аутоволн или их аннигиляцией в краевой и промежуточной зонах фации.
Двойные фации определяются, как правило, при хронической интоксикации (Шатохина С.Н., Шабалин В.Н., 2013). Отмеченный сбой уровня самоорганизации также проявлялся в нарушении формы окружности, различного рода «натеках» и «гребнях». Как следует из таблицы (таблица 6.2), число случаев, где в сумме частота встречаемости нарушений и отсутствия системного аутоволнового ритма в 11,7 раз превышала число случаев с сохраненной структурой концентрационных волн, а частично сохраненный превышал – в 5,8 раза. При анализе уровня устойчивости системного ритма в контроле выявлено преобладание патологически устойчивого типа. Из таблицы 6.2 видно, что в контроле физиологически устойчивых типов фаций нет. Напротив, отмечалось десятикратное увеличение патологически устойчивых типов, что может свидетельствовать о глубоких нарушениях межсистемных отношений в организме онкологического больного.
Второй уровень самоорганизации сыворотки крови больных контрольной группы характеризовался нарушением порядка формирования основных структурных единиц: снижением или отсутствием трещин, отдельностей и конкреций, структурированием маркеров локальных процессов – токсических белков в виде «морщин» и «бляшек», склерозирования – «структур листа», ангиоспаз-ма – «гребешков», воспалительных белков – «ковры Серпинского», «языки Арнольда» и др. (Арджа А.Ю., Пржедецкий Ю.В. и соавт., 2013).
При анализе результатов исследования образцов сыворотки крови в 1 подгруппе больных после неоадъювантной пoлихимиоиммунотерапии с внутримышечным введением (ВМХИТ) интерферона-гамма были получены статистически достоверные различия признаков упорядоченности и нормализации I и II уровня самоорганизации (таблица 6.2). Отмечается увеличение частоты фаций с нормотипом в 9,6 раз по отношению к фону (до лечения) и 2,2 раза по отношению к контролю. Число нормотипов с неустойчивым системным ритмом было выше в 2,1–2,5 раз, чем в контроле, где доминировал патологически неустойчивый тип. Порядок симметрии в фации восстановился с частотой выявления в 1,9 раза выше, чем в контроле. Отмечалось снижение частоты фаций патологических типов (циркулярного типа и двойной фации) в 1,6 и 3 раза соответственно по сравнению с контролем.
Частота выявления маркеров ангиоспазма в фациях сыворотки крови у пациентов до проведения НАХТ равна 21,0%, а после же ХТ как в группе контроля, так и в основной группе достоверно снижалась до 14–16%. Заметно уменьшилась частота выявления структурных маркеров интоксикации типа «языков Арнольда» и «ковров Серпинского», так при ХТ с внутримышечным введением интерферона-гамма эти маркеры определялись в 36,0% случаев, в то время как до лечения и в контроле частота выявления этих маркеров была в 1,9 раза выше (68,4%), что свидетельствовало об общем снижении белков воспаления в сыворотке крови в подгруппе с ВМХИТ (рисунок 6.6).
При анализе результатов исследования образцов сыворотки крови в подгруппе больных с ВБХИТ также были получены статистически достоверные различия признаков упорядоченности и нормализации I и II уровня самоорганизации (таблица 6.3) по отношению к группам сравнения. Кроме того, по сравнению с 1-й подгруппой (ВМХИТ) было отмечено увеличение частоты выявления нормо-типа фаций на 20% увеличение в 1,8 раза частоты формирования фаций с симметрией радиального типа, снижением частоты встречаемости фаций частично-радиального, иррадиального и циркулярного типов, а двойная фация, как крайне неблагоприятный критерий токсичности, вообще не определялась (рисунок 6.7).
На более высокий уровень самоорганизации структурных процессов в фациях также указывает значительное снижение частоты определения фаций патологических типов и возрастание в 2 раза числа фаций с физиологически устойчивым типом (таблица 6.3).
Таким образом, были получены доказательства повышения упорядоченности и нормализации структуры фаций у больных с введением интерферона-гамма на фоне химиотерапии, частоты образования радиальных трещин, отдельностей и конкреций. Как уже отмечалось, при внутримышечном введении интерферона-гамма количество этих основных структурных единиц, определяющих нормотипы фаций сыворотки крови, значительно увеличилось по сравнению с контролем и фоновым состоянием – перед применением интерферона-гамма в курсах химиотерапии. Изменение при химиоиммунотерапии с внутрибрюшинным введением интерферона-гамма отмечен более выраженный эффект по сравнению с внутримышечным. Об этом свидетельствовали показатели увеличения частоты образования трещин в 1,8 раза, учащения формирования отдельностей и конкреций, соответственно на 8,0 и 14,0% (таблица 6.3).
Важным критерием оценки эффективности лечения стали локальные топографические особенности фаций сыворотки крови у больных с распространенным раком яичников. Во-первых, в группе с внутрибрюшинным введением интерферона-гамма заметно реже по сравнению с другими стали выявляться структуры типа «токсических бляшек», морщин белковой основы фации. Не было зафиксировано ни одного случая образования двойной фации – критерия, определяющего высокую степень интоксикации и зашлакованности организма. Это указывало на активацию процессов детоксикации, снижения уровня застойных явлений и общей нормализации состояния организма. Анализируя морфологические проявления процессов интоксикации, можно отметить клинико-лабораторные параллели, а именно, связь между снижением наличия морфологических маркеров в виде «бляшек», морщин и двойных фаций и снижение побочных явлений характерных для химиоиммунотерапии, как следствие реагирования организма на внутрибрю-шинное введение интерферона-гамма. Прежде всего, это касалось заметного ограничения развития гриппоподобного синдрома в виде ослабления или отсутствия лихорадки, тошноты, рвоты, слабости, проявления клинических признаков улучшения самочувствия, которое подробно описано в главе 3.