Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Перспективы поиска, создания и доклинического изучения ферментных противоопухолевых препаратов. Обзор литературы 16
1.1. Ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот 16
1.1.1. L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1.) 16
1.1.2. L-аргининдеиминаза (КФ 3.5.3.6.) 22
1.1.3. L-метионин-у-лиаза (КФ 4.4.1.11.) 25
1.1.4. Оксидазы L-аминокислот 26
1.1.5. Ь-фенилаланин:аммиак-лиаза (КФ 4.3.1.5) 29
1.1.6. Тирозин-фенол-лиаза(КФ 4.1.99.2) 30
1.2. Рибонуклеазы 30
1.2.1. Ранпирназа (онконаза) 30
1.2.2. Амфиназа 31
1.2.3. Биназа 32
1.3. Современные подходы к созданию и экспериментальному изучению противоопухолевых
ферментов 32
1.3.1. Поиск перспективных субстанций 32
1.3.2. Разработка методов выделения субстанции в препаративном количестве 33
1.3.3. Оценка физико-химических и кинетических свойств ферментов 36
1.3.4. Оценка антипролиферативной активности ферментов 37
1.3.5. Поиск способов оптимизации терапевтических характеристик 40
1.3.6. Оценка элементов фармакокинетики 42
1.4. Актуальность разработки новых подходов к поиску и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов 43
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Изученные ферменты и их источники 46
2.2. Реактивы 47
2.3. Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов 47
2.4. Наработка биомассы и очистка L-аспарагиназ 49
2.5. Определение ферментативной активности 49
2.6. Определение физико-химических свойств 50
2.7. Исследования зависимости «структура-функция» 51
2.8. Оценка цитотоксичности 52
2.9. Оценка специфической противоопухолевой активности
2.10. Оценка токсичности 57
2.11. Оценка элементов фармакокинетики 58
2.12. Оценка иммуногенности 60
2.13. Статистическая обработка 62
Глава 3. Экспериментальные подходы к созданию и отбору продуцентов ферментов 64
3.1. Новый метод отбора штаммов-продуцентов L-аспарагиназ 64
3.2. Создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов L-аспарагиназ
3.2.1. Создание штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis 69
3.2.2. Создание штамма продуцента L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum 73
3.2.3. Создание продуцентов мутантных форм L-аспарагиназы i?. rubrum 75
3.3. Выделение и очистка полученных L-аспарагиназ 76
3.3.1. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы Y. pseudotuberculosis 76
3.3.2. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы i?. rubrum 77
Глава 4. Физико-химические и кинетические характеристики полученных ферментов 81
4.1. Оптимальные условия протекания ферментативных реакций 81
4.1.1. Оптимумы рН и температуры новых L-аспарагиназ 81
4.2. Чувствительность к химической и температурной денатурации 85
4.2.1. Стабильность полученных L-аспарагиназ 85
4.3. Кинетические параметры полученных L-аспарагиназ 87
Глава 5. Отдельные биологические характеристики полученных ферментов 91
5.1. Антигенные свойства и перекрестная иммуногенность новых L-аспарагиназ 91
5.1.1. IgG-иммунный ответ 91
5.1.2. IgM-иммунный ответ 91
5.1.3. Перекрестная иммуногенность L-аспарагиназ 92
5.2. Основные фармакокинетические параметры 94
5.2.1. Элементы фармакокинетша -лизин-а-оксидазы у мышей 94
5.2.2. Прогнозирование фармакокинетических параметров L-лизин-а-оксидазы у человека 96
5.2.3. Элементы фармакокинетики L-метионин-у-лиаз у мышей 97
5.2.4. Стабильность L-метионин-у-лиаз в плазме крови человека 98
Глава 6. Прескрининг на культурах опухолевых клеток новых ферментов различной природы
100
6.1. Цитотоксичность новых L-аспарагиназ 100
6.2. Цитотоксичность L-метионин-у-лиаз из новых источников 105
6.3. Цитотоксичность L-фeнилaлaнин:aммиaк-лиaзыі?/гой?о рог/ й?шда toruloides 106
6.4. Цитотоксичность L-лизин-альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai 107
6.5. Цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius 108
6.1.6. Отбор ферментов на основании данных прескрининга 108
Глава 7. Противоопухолевая активность новых ферментов различной природы и механизма действия 110
7.1. Скрининг противоопухолевой активности отобранных ферментов 110
7.1.1. Скрининг и диапазон терапевтических доз новых L-аспарагиназ 110
7.1.2. Оценка антипролиферативной активности in vivo L emir aHHH:aMMHaK Ha3bi... 115
7.1.3. Оптимизация схемы внутривенного введения противоопухолевого фермента L-лизин-альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai 116
7.1.4. Спектр чувствительных опухолей к L-лизин-альфа-оксидазе Trichoderma cf. aureoviride Rifai 120
7.1.5. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius 123
7.2. Доклиническое изучение новых ферментов на подкожных ксенографтах опухолей
человека у иммунодефицитных мышей 124
7.2.1. Спектр противоопухолевой активности L-лизин-альфа-оксидазы 124
7.2.2. Противоопухолевая активность иммуноРНКазы 4D5 scFv-дибарназы 126
7.2.3. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы) 130
7.3. Разработка модели для доклинической оценки противоопухолевого эффекта L-метионин у-лиаз 131
7.4. Доклиническое изучение in vivo эффективности и переносимости комбинаций с L-лизин альфа-оксидазой 135
7.4.1. Оценка «острой» токсичности L-лизин-альфа-оксидазы и препаратов для комбинаций 135
7.4.2. Эффективность и переносимость комбинации иринотекана с L-лизин-альфа-оксидазой 138
7.4.3. Эффективность и переносимость комбинации цисплатин + L-лизин-альфа-оксидаза 143
7.4.4. Эффективность и переносимость комбинированной терапии этопозид + L-лизин-альфа-оксидаза 146
Глава 8. Новые аспекты изучения механизмов действия и прогнозирования биологической активности ферментов 148
8.1. Оценка взаимосвязей «структура-функция» с использованием сайт-направленного мутагенеза L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum 148
8.2. Взаимосвязь между антипролиферативной и ферментативной активностью 1 8.2.1. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-аспарагиназ 155
8.2.2. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-метионин-у-лиаз 164
8.3. Прогнозирование иммуногенности и анализ структуры эпитопов L-аспарагиназ 165
8.4. Влияние L-метионин-у-лиазы на отдельные звенья механизма индукции апоптоза 169
Глава 9. STRONG Обсуждение полученных данных с оценкой перспектив поиска и экспериментального
изучения ферментов с противоопухолевой активностью STRONG 171
9.1. Поиск и создание ферментов с противоопухолевой активностью 171
9.2. Анализ выбора продуцента фермента 176
9.3. Прогнозирование антипролиферативной активности на основании кинетических характеристик фермента 177
9.4. Прогнозирование основных фармакокинетических параметров противоопухолевого фермента у человека на основе данных in vivo 180
9.5. Оценка очередности использования ферментных препаратов одной группы с учетом перекрестной иммуногенности 181
9.6. Алгоритм экспериментального изучения антипролиферативной активности потенциальных противоопухолевых ферментов 182
9.7. Особенности выбора препаратов для комбинированного применения с противоопухолевыми ферментами 186
9.8. Новые подходы к экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов 187
Выводы 189
Практические рекомендации 191
Благодарности 193
Литература
- Тирозин-фенол-лиаза(КФ 4.1.99.2)
- Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов
- Создание штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis
- Основные фармакокинетические параметры
Тирозин-фенол-лиаза(КФ 4.1.99.2)
Однако существуют доказательства того, что противоопухолевое действие L-аспарагиназ не ограничивается только лишь снижением уровня свободного L-аспарагина [53], но имеются также и более специфические механизмы прямого воздействия на опухолевые клетки, заключающиеся в гидролизе связанного L-аспарагина в составе гликопротеиновых клеточных рецепторов. Известно, что на поверхности многих клеток гемобластозов присутствует увеличенное количество мембранных рецепторов, таких как CD 19, CD40, IGF-R, значительно повышающих их чувствительность к действию митогенов различной природы. Данные рецепторы, связываясь со своими лигандами, обусловливают усиление роста и пролиферации опухолевых клеток [53; 216]. Между тем, многие из этих рецепторов представляют собой гликопротеиновые комплексы, в которых белковая часть объединена с N-гликозидной через пептидный спейсер (подобен пептидному мостику N-ацетилмурамовой кислоты), обогащенный амидными группами L-аспарагина [53; 133]. Полученные данные позволяют предполагать, что L-аспарагиназа не только разрушает свободный L-аспарагин в окружении опухолевых клеток, но также, возможно, способна расщеплять аспарагин в составе пептидных спейсеров гликопротеиновых рецепторов опухолевых клеток [133]. Рецепторы с отщеплённой подобным образом гликозидной частью не способны связываться с соответствующими лигандами-митогенами и стимулировать пролиферацию, что может объяснять еще один вероятный специфический механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ.
Исследования in silico показали высокий уровень гомологии (до 49%) нуклеотидных последовательностей генов L-аспарагиназ и интерферонов Р из различных биологических источников. Эти данные позволяют предположить, что L-аспарагиназы, наряду с ферментативным действием, могут обладать также механизмом специфического цитокинового действия. Данный механизм можно охарактеризовать как интерфероноподобный эффект, который, по всей видимости, может выражаться в способности взаимодействовать с рецепторами к интерферонам (interferon alpha/beta receptor (IFNAR)), приводя к индукции внутриклеточных ингибиторов целого ряда циклинзависимых киназ (Cdk) и их активных комплексов. Взаимодействие с IFNAR приводит к усилению экспрессии р38 МАР-киназы, активно фосфорилирующей белок р57 (Кір2) по остатку Thrl43. В результате такого фосфорилирования в значительной степени возрастает блокирующее сродство р57 к комплексу Cyclin A/Cdk2, что влечёт за собой остановку деления клеток в фазе G1 жизненного цикла
Совокупность современных научных знаний предполагает наличие многофакторного механизма антипролиферативного действия L-аспарагиназ, ведущая роль в котором все же принадлежит расщеплению L-аспарагина. Реальный вклад каждого механизма в реализацию противоопухолевого эффекта пока остается недостаточно выясненным, в опубликованных работах также нет доказательства прямой связи между сродством к субстрату и антипролиферативной активностью L-аспарагиназ.
В экспериментальных исследованиях 1970-х годов была выявлена наиболее чувствительная опухоль мышей — лимфаденоз Фишера L5178Y. Эта модель стала сигнальной для первичной оценки противоопухолевого действия новых препаратов L-аспарагиназы in vivo [38]. Начиная с 70-х годов прошлого века и по настоящее время ЕсА используется в составе схем комбинированной индукционной химиотерапии при ОЛЛ. В последние годы появились сообщения об ее эффективности в комбинированной терапии NK/T-клеточной и кожной Т-клеточной лимфом [172, 254, 363].
Исследования последних лет направлены на минимизацию выявленных в ходе клинического применения недостатков существующих препаратов L-аспарагиназ: иммуногенности, отдельных побочных эффектов, а также предупреждение формирования лекарственной резистентности при повторных курсах. С этой целью исследуются L-аспарагиназы из новых источников, а также модифицированные (конъюгированные с другими макромолекулами или мутантные) формы известных ферментов.
Минимизация L-глутаминазной активности L-аспарагиназ. Помимо расщепления L-аспарагина большинство L-аспарагиназ бактериального происхождения также способны к дезаминированию L-глутамина. При этом многие авторы полагают, что именно с L-глутаминазной активностью связаны гепатотоксичность, нарушения свертываемости крови и угнетение центральной нервной системы (ЦНС) [256, 278, 340, 345]. Это обусловлено тем, что в основном пути биосинтеза L-аспарагина в клетках млекопитающих (из аспарагиновой кислоты при участии аспарагинсинтетазы) донором амидной группы является L-глутамин [349]. Таким образом, снижение концентрации L-глутамина лишает нормальные клетки возможности избежать токсического действия фермента путем внутриклеточного синтеза L-аспарагина. На культуре гепатоцитов крысы показано, что ЕсА вызывает угнетение синтеза белка, которое сопровождается пропорциональным снижением внутриклеточной концентрации L-глутамина [340]. В клинических исследованиях было установлено, что через 1 ч после в/в введения ЕсА больным ОЛЛ концентрация L-глутамина плазмы крови уменьшалась до 5% от исходного значения. Это позволило ряду авторов предположить, что угнетение синтетической функции печени коррелирует с L-глутаминазной активностью [256]. Этой гипотезе отвечают результаты доклинического изучения L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (WsA), лишенной L глутаминазной активности, продемонстрировавшей, в отличие от ЕсА, отсутствие гепатотоксичности или иммуносупрессивного эффекта in vivo [69, 112]. Позднее было установлено, что угнетение синтеза белка в печени и селезенке после применения ЕсА коррелирует с содержанием фосфорилированного трансляционного фактора еГЕ2 [278]. Существуют предположения, что нейротоксичность препаратов L-аспарагиназ так же, как и гепатотоксичность, связана с образованием L-глутаминовой кислоты, повышенная концентрация которой может оказывать угнетающее воздействие на ЦНС [316]. Показано, что через 24 ч после введения ЕсА мышам концентрация глутаминовой кислоты в плазме крови может возрастать в 6 раз [280]. Эти предположения подтверждаются результатами I фазы клинического изучения фермента из Acinetobacter, обладающего высокой L-глутаминазной активностью: нейротоксичность аспарагиназы-глутаминазы Acinetobacter проявляется выраженным угнетением ЦНС вплоть до комы и летального исхода и является дозолимитирующей [345]. В качестве альтернативной причины нейротоксичности L-аспарагиназ рассматривается повышение концентрации аммиака в плазме крови [313, 316]. Так, концентрация аммиака увеличивается в течение первых суток после введения ЕсА до уровня, в 7 раз превышающего исходный, после чего в течение 2 сут полностью нормализуется, что соответствует длительности циркуляции ЕсА [313, 346].
Попытки снизить L-глутаминазную активность препаратов L-аспарагиназ традиционно предпринимаются двумя путями. Первый из них предполагает поиск аспарагиназ с низкой L-глутаминазной активностью из других источников и детальное изучение их биохимических и биологических свойств. Например, практически отсутствует L-глутаминазная активность у WsA и L-аспарагиназы Helicobacter pylori (НрА) [7, 89, 112].
Второй подход — модификация уже изученных ферментов; замена аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность. В частности, к избирательному снижению L-глутаминазной активности ЕсА приводит замена Asp248 [109]. Путем направленного мутагенеза были получены гены, кодирующие ЕсА с различными заменами Asp248, которые в составе вектора рТ7-7 использовались при трансформации штамма Е. coli CU1783. Из полученных рекомбинантных ферментов наиболее перспективным оказался белок с заменой Asp248Ala: константа скорости ферментативной реакции kcat гидролиза L-глутамина по сравнению с природным ферментом снижалась с 3,3х Ю-1 до 2,9 10 3, снижение kcat гидролиза L-аспарагина было значительно менее выраженным [109].
Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов
Определение фармакокинетики LO. Для определения фармакокинетических параметров использованы мыши линии Balb/c средней массой тела 20 г из питомника лабораторных животных ИБХ. В каждую группу было включено 16 мышей. Для получения первичных антител к LO использованы 2 кролика породы Шиншилла массой тела до 3 кг. Всех животных содержали в виварии НИИ Митоинженерии (г. Москва).
Непосредственно перед введением LO разводили водой для инъекций до концентрации 1 мг/мл, затем 0,9% раствором хлорида натрия до концентрации 0,1 или 0,2 мг/мл. LO вводили в/в в концентрации 0,1 мг/мл (для доз 1,0 и 1,5 мг/кг) или 0,2 мг/мл (для дозы 3,0 мг/кг). Общий объем инъекционного раствора составлял 160-340 мкл. Для оценки фармакокинетики LO при повторном в/в введении использовали 5-кратное введение LO в терапевтических дозах 1,0-1,5 мг/кг с интервалом 48 ч.
У мышей отбирали по 50 мкл крови из ретроорбитального синуса (сроки до 3 ч) или по 100 мкл из яремной вены после умерщвления путем дислокации шейных позвонков (сроки 9 ч и 24 ч). От 8 животных из каждой экспериментальной группы кровь забирали через 10 мин, 1 и 9 ч, от второй половины группы — через 30 мин, 3 и 24 ч после введения фермента. Время взятия крови для каждого животного рассчитывали индивидуально в соответствии со временем введения LO. В течение 1 ч после взятия кровь центрифугировали (3000 об/мин, 1 мин) и отбирали сыворотку. При многократном введении LO пробы отбирали после 1-й и 5-й инъекций через 15 мин, 1-3-9-24-48 часов.
Использована оригинальная методика определения количественного содержания LO в сыворотке крови. 96-луночные планшеты для ИФА были покрыты чистым антигеном LO. Исследуемый образец наносили на планшет, затем вносили иммунную сыворотку в рабочем разведении. Антитела, не связавшиеся с образцом, связывались с покрытием. После отмывки планшетов их обрабатывали вторичными антителами к иммуноглобулину кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена. Затем планшеты снова промывали и в реакции с тетраметилбензидином определяли связавшуюся пероксидазу. В качестве нулевого уровня брали максимальный сигнал в лунке без добавления образца. Оптическую плотность в лунках после окрашивания определяли спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Первичные антитела к LO были получены после двукратной иммунизации двух кроликов. Для каждой иммунизации было использовано по 2 мг LO в 1 мл фосфатного буфера с добавлением 1 мл полного (при первой иммунизации) или неполного (при второй иммунизации) адъюванта Фройнда. Фермент вводили внутрикожно. Вторую иммунизацию выполняли через 30 дней после первой. Кровь отбирали каждые 3 дня в период от 10 по 20-й дни после второй инъекции. По данным предварительного титрования для проведения исследования использована сыворотка крови с максимальным титром антител к LO.
Перед выполнением исследования 96-луночные планшеты обрабатывали раствором LO (50 мкг/мл) в карбонатном буфере при +4 С в течение 12 ч. В пилотных исследованиях для покрытия каждой лунки использовали по 5 мкг LO. После определения остальных параметров исследовали чувствительность теста при использовании LO в дозах 10, 5 и 2 мкг. Лучшие результаты были получены при использовании 2 мкг LO. Затем лунки промывали фосфатно-солевым буфером рН 7,4, содержащим 0,05% Tween 20, после чего в каждую лунку планшета помещали по 300 мкл 10% раствора сыворотки теленка и инкубировали в фосфатном буфере в течение 2 ч.
Серийные 2-кратные разведения LO в сыворотке теленка, начиная с 1 мкг/мл до 1 нг/мл, исследовали с серийными 10-кратными разведениями гипериммунной кроличьей сыворотки, начиная от 1:100 до 1:1000 000. Затем исследование повторяли в полученном диапазоне разведений сыворотки, используя 3,2-кратные (0,5 log) разведения. Оптимальным считали разведение сыворотки, при котором было возможно определение минимальной концентрации LO при достаточном уровне сигнала (оптическая плотность выше 0,5).
Определение концентрации LO проводили в соответствии с описанным выше способом. Для каждой 96-луночной плашки использовалась индивидуальная калибровочная кривая в диапазоне от 10 до 1000 нг/мл. В соответствии с рабочим диапазоном метода образцы, собранные на сроки до 3 ч включительно, исследовались в разведении 1:100, образцы, собранные в более поздние сроки — в разведении 1:10. Для образцов, выпадавших из рабочего диапазона метода, проводилось повторное исследование после коррекции рабочего разведения. Основные фармакокинетические параметры рассчитывали модельно-независимым методом: AUCo-24, мкг/млхч; Со, мкг/мл; Кеі, ч_1; Ті/2, мин; О, мл/мин; Vd, мл. Для отображения полученных данных в координатах Дедрика хронологические времена отбора проб крови пересчитывали в соответствующие «фармакокинетические времена» по уравнению: tpk=t/m0 25, где tpk — «фармакокинетическое время», m — масса тела мыши, кг [106]. Значение Тт выражали в «фармакокинетическом времени» (Ti/2, Pk), на основе чего рассчитывали продолжительность Ti/2 у человека (Ti/2, h) по уравнению: Тшд = Ti/2, Pk х 700 25. Определение фармакокинетики MGL. Для определения фармакокинетических параметров MGL C.freundii, С. sporogenes и С. tetani использованы мыши-самки С57В16 средней массой тела 23 г разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина. В каждую группу было включено 3 мыши. Непосредственно перед введением MGL разводили изотоническим раствором натрия хлорида до концентрации 50 МЕ/мл. MGL вводили в/в в дозах 500 и 1000 МЕ/кг. У мышей отбирали по 100 мкл крови после умерщвления путем дислокации шейных позвонков из ретроорбитального синуса. В каждой экспериментальной группе кровь забирали через 10 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч и 24 ч. Время взятия крови для каждого животного рассчитывали индивидуально в соответствии со временем введения MGL. В течение 10 мин после взятия кровь центрифугировали (3000 об/мин, 1 мин) и отбирали сыворотку. Содержание MGL определяли по стандартной методике (см. раздел. 2.5).
Определение содержания пиридоксина и L-метионина в сыворотке крови мышей после введения MGL проводили хроматографическим методом. Использовали соответствующие растворы концентрации 10 мкмоль/л. Для осаждения белков плазму крови объемом 100 мкл разбавляли в 3 раза ацетонитрилом и центрифугировали в течение 10 мин при 13400 rpm. Хроматографию проводили на UPLC (LC-30 Nexera Х2, «Shimadzu Europa GmbH»). Для разделения использовали режим инъекции с полным заполнением петли образцом 10 мкл на колонке Shim-pack FC-ODS С18 (2 мм х 150 мм, 3 мкм), при температуре 35 С. Для элюции использовали градиент 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и ацентонитрил (расвторитель В) со скоростью потока 0,2 мл/мин. Использовался следующий градиент: В 0% (0 мин) — 55% (10 мин) — 0% (10,01-20 мин). Масс-спектрометрический анализ првоодили на тандемном масс-спектрометре Shimadzu LCMS-8050 («Shimadzu Europa GmbH»). Пиридоксин и L-метионин определяли методом ионизации электрораспылением с режимом детекции положительно заряженных ионов со следующими значениями MRM: отношение массы к заряду m/z 170,2 152,1 и 170,2 134,3 для пиридоксина и m/z 150,2 104,2 и 150,2 61,2 для L-метионина. Параметры измерений: капиллярное напряжение 4 кВ, напряжение на конусе 30 В, скорость потока распыляемого газа 5,0 л/мин, скорость потока осушающего газа 10,0 л/мин, скорость потока нагревающего газа 10,0 л/мин, температура DL 250 С, температура обогревателя блока цилиндров 400 С, температура поверхности раздела 300 С. В качестве газа для соударений использовался аргон при давлении 270 кПа.
Определение стабильности MGL в плазме крови. 10 образцов плазмы крови человека были получены от здоровых доноров из ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава РФ. Ферменты инкубировали в плазме при 37 С в течение 24 ч. Стабильность препаратов MGL в плазме крови человека оценивали, отбирая аликвоты в течение 24 ч и определяя специфическую активность MGL описанным выше методом. В качестве контроля ферменты инкубировали в аналогичных условиях в натрий-фосфатном буфере при рН 7,4.
Создание штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis
С целью разработки метода отбора продуцентов L-аспарагиназ на плотной среде была предпринята попытка модифицировать известные методы с использованием плотных дифференциальных сред Эндо или LB путем включения различных индикаторов (бромтимоловый синий, метиловый красный, бромкрезоловый пурпурный, бромфеноловый синий). Добавление индикаторов к средам не позволило дифференцировать продуценты L-аспарагиназ от неактивных штаммов, вероятно, по причине диффузии растворимых окрашенных продуктов реакции в агаре.
Принцип нового разработанного метода основан на способности L-аспарагина и L-аспарагиновой кислоты образовывать прочные хелатные комплексы с металлами (Си, Ni, Со) [304]. Выявление активных продуцентов L-аспарагиназы основано на образовании красных комплексов меди с анионом гексацианоферрата при ферментативном разрушении синих комплексов меди с L-аспарагином. В результате реакции с восстанавливающими ингредиентами агара, входящего в состав плотной питательный среды (например, LB или М9), гексацианоферрат (III) восстанавливается до гексацианоферрата (II). При ферментативном гидролизе аспарагина и разрушении прочного хелатного комплекса этой аминокислоты с Cu(II) ионы меди связываются с анионом гексацианоферрата(П), что сопровождается выпадением красно-коричневого осадка.
2Cu2+ + [Fe(CN)6]2" - Cu2[Fe(CN)6] ; рН 7 Таким образом, основой предлагаемого метода выявления штаммов-продуцентов L-аспарагиназы является цветовая индикация ферментативного гидролиза аспарагина. Нами были изучены также реакции комплексообразования с Ni или Со, но их использование было менее информативным из-за слабого внешнего эффекта (неяркие продукты реакции). Ниже приведены примеры приготовления сред. В качестве модифицируемых сред использованы стандартные среды LB и М9 с добавлением 1,5% агара [24, 144].
Модифицированная среда LB. Сначала готовится стандартная среда LB; рН 7,6 [70] с добавлением 0,2-0,8 г СаСОз. К 100 мл расплавленной стерильной среды LB, содержащей 1,5% бакто-агара, последовательно добавляют 4,0 г L-аспарагина; 3,0 мл 0,2 М CuS04x5H20, и 2,5 мл 0,1 М K3Fe(CN)6 до конечной концентрации 0,3 М L-аспарагина, 0,0057 М CuS04x5H20 и 0,0024 М K3Fe(CN)6. После добавления каждого компонента смесь тщательно перемешивают.
Эксперименты выполнены совместно с к.б.н. М.В. Покровской, ИБМХ им. В.Н. Ореховича Модифицированная среда М9. Сначала готовится стандартная среда М9; рН 7,6. После автоклавирования и охлаждения в среду добавляют следующие компоненты: 1 М MgS04x7H20 2 мл; 20% глюкоза 10 мл; 1 М СаСЬ 1 мл. Три последних раствора стерилизуются фильтрованием. К 100 мл расплавленной стерильной среды М9, содержащей 1,5% агара, последовательно добавляют 4,0 г L-аспарагина, а также 4,5 мл 0,2 М CuS04x5H20 и 3,5 мл 0,1 М K3Fe(CN)e до конечной концентрации 0,3 М L-аспарагина, 0,0083 М CuS04x5H20 и 0,0032 М K3Fe(CN)6. После добавления каждого компонента смесь тщательно перемешивают. При необходимости в среду вносят антибиотики и индукторы, например, при выращивании штаммов BL-21(DE3)/pBAD/ECARLANS (Е. coli/pBAD) и BL-21(DE3)/pACYC177-LANS (Е. coli/pACYC) вносят L-арабинозу до 0,0015 М или IPTG (isopropyl-beta-Dhiogalactopyranoside) до 0,001 М, соответственно.
Среду, содержащую комплексные соединения с медью, необходимо готовить непосредственно перед употреблением. Автоклавирование питательной среды и растворов проводят в стандартных условиях. Среду разливают в чашки Петри и подсушивают в ламинаре в течение 20 мин. Приготовленная горячая среда имеет желто-зеленый цвет, холодная — приобретает голубоватый оттенок, обусловленный наложением синего комплекса меди и желтого гексацианоферрата калия. Герметично закрытые чашки с готовой средой могут храниться при комнатной температуре в течение месяца. Покрасневшая или побуревшая среда вследствие выпадения осадка Cu2[Fe(CN)6] для диагностических целей непригодна.
Исследуемые микроорганизмы высевают на поверхность приготовленной диагностической среды истощающим мазком, выдерживают посевы в термостате при оптимальной температуре роста в течение 12-20 или 24-48 ч соответственно, после чего учитывают результаты по окраске выросших колоний. Красный цвет колоний и красный ореол вокруг них указывают на способность исследуемого микроорганизма разрушать аспарагиновые комплексы, в то время как неактивные свой естественный цвет не изменяют.
Для тестирования сред из коллекции лаборатории медицинской биотехнологии ИБМХ им. В.Н. Ореховича были отобраны рекомбинантные штаммы Е. coli с высокой L-аспарагиназной активностью от 12 до 34 МЕ/мг белка: BL-21(DE3)/pBAD/ECARLANS (E.coli/pBAD) и BL-21(DE3)/pACYC177-LANS (Е. coli/pACYC); стандартные генетически модифицированные штаммы Е. coli, используемые в биотехнологии с низкой L-аспарагиназной активностью (до ЮМЕ/мл белка): JM 109, DH-52, МС 1061, BL-21(DE3); а также природные штаммы: Lactobacillus plantarит, Lactobacillus casei var. rhamnosus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis и Erwinia carotovora N1 (коллекция микроорганизмов БГУ, Минск) с активностью 0,003-0,007 и 0,1-0,3 МЕ/мг белка, соответственно. Исследуемые штаммы выращивали на среде LB в течение ночи в качалке со скоростью перемешивания 180 об/мин при температуре 37 С до СЮбоо=1,5-2,0 ОЕ. После стандартных 10-кратных разведений бактериальную культуру шпателем или петлей высевали на поверхность приготовленной диагностической среды. Посевы выдерживали в термостате при температуре 37 С в течение 12-20 (среда на основе LB) или 24-48 ч (среда на основе М9) соответственно, после чего результаты учитывали по окраске выросших колоний и сопоставляли с данными стандартного метода прямой несслеризации (табл. 3). Показано, что покраснение колоний и диаметр окрашенной зоны вокруг них находятся в прямой зависимости от L-аспарагиназной активности изучаемых штаммов, концентрации реагирующих компонентов, а также времени инкубации. Видно, что красное окрашивание колоний коррелирует с активностью штамма, определенной при помощи стандартного метода. Показано, что только колонии Lactobacillus plantarium, Lactobacillus casei var. rhamnosus, Bacillus subtilis и Bacillus megaterium с активностью 0,007 МЕ/мг белка оставались неокрашенными при любых сроках инкубации и любой окраске среды. Штаммы, демонстрирующие невысокую активность, окрашиваются в розовый цвет. Рекомбинантные штаммы Е. coli BL-21(DE3)/pBAD/ECARLANS и Е. coli BL-21(DE3)/ pACYC177-LANS, активность которых составляет 28 и 34 МЕ/мг белка соответственно, окрашены в ярко красный цвет. На рис. 1 в бесцветных секторах находятся штаммы Е. coli XL-blue и Lactobacillus plantarium, в окрашенном секторе — Е. coli BL-21(DE3)/pACYC177-LANS.
Основные фармакокинетические параметры
Сравнение структур активных центров RrA и ЕсА показало, что многие аминокислотные остатки, формирующие активные центры в N-концевом домене ЕсА и RrA, совпадают, включая каталитически наиболее значимый Thrl6 RrA (Thrl2 ЕсА). Необходимо отметить, что активные центры всех известных L-аспарагиназ формируются при взаимодействии двух субъединиц. Участие только двух аминокислотных остатков С-концевого домена другой субъединицы в формировании активного центра ЕсА, также подтверждает правильность модели фолдинга RrA. Тем не менее, наши экспериментальные данные показали, что в растворе RrA существует главным образом в форме тетрамера, поэтому вопрос олигомеризации RrA остается предметом дальнейших исследований. Анализ положений аминокислотных замен показал, что в процессе олигомеризации могут принимать участие остатки D60 и F61 у RTAD И R118 И G120 у RrAj. В обоих случаях полученные мутантные белки были более стабильны в растворе мочевины и более эффективно катализировали гидролиз субстрата. Возможно также, что в этом процессе участвуют аминокислотные остатки С-конца, поскольку удаление четырех С-концевых остатков приводило к разрушению четвертичной структуры.
Расчет электростатического потенциала на поверхности RrA согласно построенной модели показал наличие большого количества отрицательно заряженных участков и ограниченного числа кластеров с положительным зарядом. Учитывая, что для RrA характерно снижение ферментативной активности при повышении ионной силы раствора, можно предположить, что в формировании олигомеров большую роль играют также электростатические взаимодействия. Сайт-направленный мутагенез ЕсА [60, 111, 149, 206, 348], а также результаты рентгеноструктурного анализа [261] показали, что остатки Tyr25, Thrl2, Thr89 и Lysl62 непосредственно участвуют в катализе, в то время как Asp90, Ser58, Asn248, А1а114 и Glu283 ответственны за связывание субстрата с помощью водородных связей. Гидроксильные группы в положениях 89 и 12 необходимы для реакции расщепления L-аспарагина [149, 261]. В случае RrA аминокислотные замены G86P, D88H, М90К (RrAH), а также II7S, D18T, D20H (RrAF) изменяют заряд фермента и его конфигурацию рядом с каталитически значимыми остатками Thrl6, Thr87 и Thr89, что полностью снижает ферментативную активность до базового уровня и подтверждает важность этого участка белка для ферментативной реакции (табл. 53). Замены D60K и F61L (RrAo), а также R118H и G120R (RrAj) приводят к улучшению кинетических характеристик и стабилизации фермента, возможно, вследствие устранения стерических препятствий при олигомеризации.
В активном центре ЕсА выявлены две наиболее значимые группы из трех аминокислотных остатков «триады»: Thr89-Lysl62-Asp90 и Thrl2yr25-Glu283 [109]. Аминокислотные остатки в триадах связаны между собой водородными связями наподобие каталитических триад сериновых протеаз, образованных аспарагиновыми, гистидиновыми и сериновыми аминокислотными остатками. В случае RrA для осуществления гидролиза L-аспарагина критично важно наличие остатка L-аспарагиновой кислоты не только в положении 88, но также и в положении 123, поскольку показано, что мутации в RrAi (G121L, D123A) приводят к потере ферментативной активности. Несмотря на удаленность этих аминокислотных остатков друг от друга, можно предположить, что эти участки сближаются при фолдинге белка и формируют активный центр с несколькими остатками треонина. Снижение отрицательного заряда в непосредственной близости контакта субъединиц фермента может уменьшать отталкивание мономеров, заряженных, главным образом, отрицательно, и повышать конформационную стабильность. Стабильность четвертичной структуры также возрастает при образовании дополнительных ионных связей и формировании неполярных контактов. Замены A64V и Е67К, особенно в сочетании с E149R и V150P (RTAE), существенно дестабилизируют фермент. В этом случае конформационная нестабильность при физиологических значениях рН, возможно, является причиной ухудшения кинетических параметров и снижения биологической активности.
Все основные активные центры ЕсА (взаимодействующие с КНг-группой и карбоксильными группами субстрата остатки Thrl2, Gln59, Ser58, Thr89, Asp90, Alall4, Glu283) совпадают с YpA [220]. Совпадают также Tyr25, непосредственно участвующий в катализе, Туг181 и Туг326, важные для стабилизации нативного тетрамера ЕсА, а также Asn248, отвечающий за L-глутаминазную активность ЕсА и образующий водородную связь с остатком Asp90 [ 109, 110]. У ЕгА и EwA общий участок 12TGGTIAG19, включая высоко консервативный для L-аспарагиназ Thrl5, атакующий у-амидную группу субстрата [43]. Однако величина Km EwA для L-аспарагина существенно выше, чем у ЕгА и других ферментов сравнения. Различие Кш для EwA и ЕгА может объясняться заменами Ala22Thr и Asn23Gly в подвижной петле активного центра EwA, которые изменяют сеть водородных связей этого участка и, соответственно, снижают специфичность EwA в отношении L-Asn [21]. Другой причиной отличия Кш для L-аспарагина у EwA может быть замена Glu289, которая участвует в связывании L-аспарагина и является консервативным остатком для всех L-аспарагиназ, на А1а289 [43].
Таким образом, путем сайт-направленного мутагенеза были идентифицированы отдельные участки RrA, отвечающие за фолдинг белка и его ферментативную активность. Отсутствие L-аспарагиназной активности у ЯгАн, RTAF, RrAi, RrAo подтверждают важность аминокислотных остатков 117, D18, D20, D32, РЗЗ, G86, D88, М90, G121, D123 для ферментативной активности. Замены D60K, F61L, R118H, G120R приводят к улучшению кинетических характеристик и стабилизации фермента. Замены A64V, Е67К, особенно в сочетании с E149R и V150P, заметно дестабилизируют его. YpA, WsA и EwA близки к другим L-аспарагиназам II типа и, вероятно, обладают идентичным молекулярным механизмом гидролиза L-аспарагина.
Совокупность современных научных знаний предполагает наличие многофакторного механизма антипролиферативного действия L-аспарагиназ, однако считается, что ведущая роль принадлежит расщеплению L-аспарагина. В опубликованных работах пока нет доказательств прямой связи между сродством к субстрату и антипролиферативной активностью L-аспарагиназ. Выделение L-аспарагиназ из новых источников и получение новых данных об их кинетических характеристиках и антипролиферативной активности расширило возможности сопоставления различных параметров их ферментативной и антипролиферативной активности с целью выявления возможных закономерностей. Для оценки связи между антипролиферативной и ферментативной активностью нами были использованы собственные данные, полученные при изучении пяти различных L-аспарагиназ YpA, RrA, WsA, EwA в сравнении с ЕсА. Были отобраны сопоставимые количественные параметры ферментативной (Кт) и антипролиферативной активности (ICso) изученных ферментов и оценена статистическая значимость их взаимосвязи.
Зависимость антипролиферативной активности in vitro от Кт. Поскольку предварительно определенная цитотоксическая активность RrA с Кш 0,221 мМ (рис. 34) не укладывалась в общую закономерность, было проведено два варианта корреляционного анализа: по всем проведённым наблюдениям и только по внеклеточным L-аспарагиназам II типа WsA, YpA, ЕсА и EwA (табл. 54). Для этих ферментов выявлен отчетливый тренд: с повышением Кш увеличивалась IC50: г=0,66, р=0,007. Однако при включении в анализ всех полученных L-аспарагиназ коэффициент корреляции закономерно снижался до статистически незначимой величины 0,39 (р=0,097), т.к. связь оказалась нелинейной. На основе полученных данных формально возможно построение нелинейной регрессии с квадратичной формой зависимости: ICso =-1,9+ 556,6хКт-2023хКт2 (рис. 35). Таблица 54. Коэффициенты корреляции между ICso и Km изученных L-аспарагиназ