Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Эпидемиология колоректального рака 11
1.2. Молекулярные аспекты патогенеза колоректального рака 14
1.3. Морфологическая характеристика колоректального рака 21
1.4 Факторы прогноза при колоректальном раке 26
1.5. Роль белков апоптоза и маркера клеточной пролиферации Ki-67 при колоректальном раке 29
1.6 Роль регуляторов аутофагии mOR и Beclin-1 в развитии злокачественных опухолей 35
Глава 2. Материал и методы 43
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 57
3.1. Характеристика экспрессии маркеров аутофагии в зависимости от клинико-морфологических параметров колоректального рака 57
3.2. Связь экспрессии маркеров аутофагии с пролиферативной активностью опухоли и белками апоптоза у пациентов с колоректальным раком 66
3.3. Анализ экспрессии белков-регуляторов аутофагии в зависимости от соотношения стромального и паренхиматозного компонента опухоли и степени воспалительной инфильтрации при колоректальном раке 68
3.4. Связь экспрессии маркеров аутофагии с частотой лимфогенного метастазирования у пациентов с колоректальным раком 81
3.5. Прогнозирование вероятности лимфогенного метастазирования при колоректальном раке 90
Заключение 94
Выводы 101
Список сокращений и условных обозначений 102
Список литературы 103
- Молекулярные аспекты патогенеза колоректального рака
- Роль регуляторов аутофагии mOR и Beclin-1 в развитии злокачественных опухолей
- Анализ экспрессии белков-регуляторов аутофагии в зависимости от соотношения стромального и паренхиматозного компонента опухоли и степени воспалительной инфильтрации при колоректальном раке
- Прогнозирование вероятности лимфогенного метастазирования при колоректальном раке
Молекулярные аспекты патогенеза колоректального рака
Колоректальный рак является довольно гетерогенной группой опухоли, что проявляется как в клиническом поведении, так и патогенезе развития данной злокачественной опухоли.
В современной литературе, основываясь на результатах молекулярно-генетических исследований, выделяют 4 основных типа канцерогенеза колоректального рака: 1) Переход от аденомы к карциноме, 2) наследственный неполипозный колоректальный рак (HNPCC-тип) (синдром Линча), 3) развитие рака de-novo, 4) малигнизация эпителия на фоне хронического колита.
Согласно современной классификации наследственные формы принято делить на полипозные и неполипозные в зависимости от количества полипов в толстой кишке. Неполипозный синдром включает в себя врожденный неполипозный рак, который еще известен под названием «Линч-синдром».
Данный синдром характеризуется аутосомно-доминантным типом наследования и связан с зародышевой мутацией в гене репарации ДНК, включающий нарушения в hMLH1, hPMS1,hPMS2, hMSH2, hMSH3 и hMSH6 [18]. Выделяют гиперпластические и аденоматозные полипы. Для аденоматозных полипов характерно железистое происхождение, представляют собой тубулярные или папиллярные разрастания со стромой, высокой митотической активностью и частичной или полной утратой способности к дифференцировке, что приводит к малигнизации [1,127].
К полипозным синдромам относят аденоматозный полипоз (семейный аденоматозный полипоз (FAP), MUTYH-ассоциированный полипоз, полимеразно-ассоциированный полипоз) и гамартоматозный полипоз (ювенильный полипозный синдром, Пейтса-Йегерса синдром, PTEN-гамартомный опухолевый синдром) и гиперпластический полипоз [48, 131].
Еще один путь патогенеза основан на малигнизации клеток слизистой оболочки кишечника при поражении хроническим колитом. По данным Jessica Gagne Sansfacon и соавторов, наблюдается увеличение риска развития колоректального рака при воспалительных заболеваниях кишечника и, в частности, язвенного колита. Для спорадических форм КРР и для форм, ассоциированных с язвенным колитом, характерно увеличение числа мутаций, приводящих к канцерогенезу. Так, показано, что в развитии спорадических форм принимает участие онкоген KRAS и гены-супрессоры опухоли APC, SMAD4 и TP53 [69, 210]. Показано, что патогенез форм КРР, ассоциированных с хроническим колитом, отличается упорядоченным стадийным развитием от воспаления и гиперпластических процессов до дисплазий, трансформирующихся в последующем аденокарциномы [61].
В патогенезе колоректального рака играют роли микросателлитная и хромосомная нестабильности. Большинство спорадических форм КРР образуются в результате хромосомных нестабильностей, которые приводят к потере гетерозиготности и к выключению генов APC, TP53, DCC, KRAS. Довольно низкий процент опухолей толстой и прямой кишки являются врожденными и возникают в следствие мутаций APC гена и MUTYH гене. К таким вариантам относят семейный аденоматозный полипоз и MUTYH-ассоциированный полипоз, которые встречаются в 2% колоректальных раков [191]. По данным литературы микросателлитная нестабильность встречается и играет важную роль в развитии рака и правых, и левых отделов толстой кишки [212].
Особое внимание в современной науке выделяется молекулярным аспектам развития колоректального рака. Нарушение в системе генов супрессоров, онкогенов и генов регуляторов аутофагии приводят к развитию данной патологии. Stefanius K. и соавторы отмечали, что совместная мутация в гене KRAS (Kirstenrat sarcoma viral oncogene homolog) вместе с нарушением в гене BRAF (Rafmurine sarcoma viral oncogene homolog B1) приводило к увеличению частоты встречаемости рака у пациентов [45,186].
В развитие онкологического процесса могут принимать роль различные сигнальные пути: MAPK/ERK и AKT/mOR и др. [203]. Каждый путь вносит свой вклад в процессы выживания, адаптации и активации клеточных элементов и молекул [30]. Каскад митоген-активированных протеинкиназ MAPK играют значимую роль в выживании, распространении и устойчивости к химиотерапии раковых клеток человека [50]. Путь MAPK/ERK получает сигналы от многих внутренних факторов, таких как: нарушения в ДНК, метаболическом стрессе, изменение концентрации белка. Мутации в генах, кодирующих данный путь, могут приводить к изменению концентрации белка в опухолевом окружении и тем самым активировать опухолевую пролиферацию [201]. По данным литературы эти мутации могут происходить в генах мембранных рецепторов (EGFR-рецептор эпителиального фактора роста) [21, 192], в генах сигнальной трансдукции (RAS) [75, 126] и других киназах, принимающих роль в регуляции MAPK/ERK пути [46].
В развитии колоректального рака играют значительную роль микросателлитная нестабильность, вызванная метилированием области промотора, и хромосомная нестабильность, которая вызывается нарушениями на хромосомном уровне [205]. Хромосомные нестабильности занимают 90% случаев, а микросателлитные всего 10%, но оба этих процесса играют важную роль в канцерогенезе рака прямой и толстой кишки [215]. Микросателитные нестабильности в гене UVRAG уменьшает способность к выживанию клеток. Данный белок принимает участие в процессе аутофагии, но по данным наблюдений мутации в нем не влияют существенно на индукцию аутофагии у пациентов с колоректальным раком [100,179].
Микросателлитные нестабильности захватывают и другие гены, такие как ATG2, ATG5, ATG9, ATG12, продуцирующие одноименные белки-участники процесса [91]. Соматические мутации этих генов приводят моно- и динуклеотидным повторам, приводя в 30% случаев к возникновению КРР. Данные мутации встречаются как на ранних стадиях канцерогенеза, так и на этапе опухолевой прогрессии [91]. По данным Patrick G. Gavin и соавторов мутации BRAF ассоциированы с опухолями с низким уровнем микросателлитной нестабильности, с плохим прогнозом в отношении безрецидивной и общей выживаемости [122].
Особое внимание уделяется изучению полиморфизмов генов, участвующих в развитии и оценке прогноза колоректального рака. Изучение полиморфизма +898 A G (Thr300Ala) вариант гена ATG16L1, который является важным маркером развития воспалительных заболеваний кишечника (язвенный колит, болезнь Крона), показало, что разные полиморфизмы проявляются разной активностью аутофагии к патогенной флоре и, как итог, развитие воспалительных процессов в слизистой оболочке [47, 183]. По данным литературы, носители мужского пола генотипа Ala / Ala относились к группе повышенного риска развития колоректальной карциномы. Однако у пациентов, имеющих в анамнезе колоректальный рак, данный вариант полиморфизма связан с более благоприятным прогнозом. Делая выводы по этим данным, можно предположить, что полиморфизмы +898 A G (Thr300Ala) полиморфизм в ATG16L1 гена (rs2241880) с одной стороны могут являться маркером риска развития колоректального рака, с другой стороны- факторов прогноза для пациентов с данным онкологическим заболеванием [68,149].
Однако разные молекулярно-генетические маркеры имеют разные характеристики при КРР правой и левой половины толстой кишки. Понимание в канцерогенезе этих 2 видов рака может привести к новым методам скрининга [187]. Так, случаи микросателлитной нестабильности правых отделов кишечника редко встречаются в левых отделах, и лишь некоторые ее формы встречаются с одинаковой частотой. Yayoi Takahashi и соавторы показали статистические различия в клинико-морфологических и генетических характеристиках колоректального рака правой и левой половины толстой кишки. Согласно данным авторов рак правых отделов был намного чаще представлен карциномой муцинозного типа и в нем чаще наблюдалась микросателлитная нестабильность, в то время как опухоли левой половины чаще представлены низкодифференцированной аденокарциномой и развивались по хромосомному пути патогенеза [164, 190].
Согласно литературным данным ген ТР53-часто мутирующий ген, измененные копии которого встречаются почти в половине случаев рака, а при КРР обнаруживается в 60-80% наблюдений. По данным литературы мутации в гене ТР53 чаще встречаются в левых отделах кишечника. Отмечается его роль в пути развития рака из аденом, что дополнительно подтверждает различия в патогенезе КРР левых и правых отделов толстой кишки [190, 215].
Мутации в гене KRAS ассоциируются с изменениями в поведении аденом от медленно развивающихся до агрессивных форм КРР. Мутации в данном гене встречаются до 50% всех случаев онкологических заболеваний, а также в 50 % случаях колоректального рака. Отмечается одинаковая частота встречаемости в опухолях левых и правых отделов толстой кишки [28].
Метилирование ДНК играет важную роль в канцерогенезе рака толстой кишки. Kaneda и соавторы показали, что уровень метилирования увеличивался в аденомах при нарастании степени дисплазии эпителии и в процессе перехода от аденомы к раку [111]. Метилирование ДНК характерно для любой локализации колоректального рака.
Роль регуляторов аутофагии mOR и Beclin-1 в развитии злокачественных опухолей
Аутофагия – лизис-зависимый катаболический процесс, который необходим для роста, пролиферации нормальных клеток и для поддержки внутриклеточного гомеостаза [144]. Аутофагия является биологическим процессом, который позволяет внутриклеточным отработавшим или нарушенным белкам, липидам и органеллам возвращаться в цитоплазму для дальнейшего использования, пройдя путь расщепления в лизосомах [112, 169].
Согласно современным представлениям аутофагия включает в себя три взаимосвязанных процесса: а) микроаутофагия, включающая переработку мелких клеточных элементов лизосомами; б) шаперон-зависимая аутофагия, осуществляемая через взаимодействие специальных белков-шаперонов с определенными клеточными белками для их выборочной транспортировки к мембране лизосомы для из дальнейшего поглощения и расщепления внутрилизосомальными протеазами; в) макроаутофагия, включающая в себя формирования двумембранных везикул с содержимым, которые в последствии сливаются с лизосомами, формируя аутолизосому [109]. В дальнейшем содержимое аутолизосом взаимодействует с лизосомальными гидролазами, а получившиеся в результаты взаимодействия макромолекулы либо удаляются из клетки, либо возвращаются в цитоплазму для дальнейшего повторного расщепления [34, 218].
Регуляция аутофагии осуществляется более чем 30 белками, кодируемыми генами ATG, обнаруженными у дрожжей, а также большим количеством гомологичных белков млекопитающих [99].
Регуляция аутофагии является сложным, многоэтапным и комплексным процессом. Основным регулятором является путь, который включает протеинкиназосерин-треониновой специфичности mOR (мишень рапамицина у млекопитающих), играющую значимую роль в регуляции не только аутофагии, но и в регуляции клеточного метаболизма, роста, пролиферации, дифференцировки клеток [109] (Рисунок 2). Путь mTOR активируется и регулируется сигналами от PI3K-I (фосфоиназитол-3-киназа-1) и AKT1 (RAC-альфа-серин-треониновой протеинкиназа-1) (Рисунок 3). Рост и пролиферация клеток осуществляется при подавлении аутофагии в ответ на действие факторов роста или питательных веществ, этот процесс осуществляется активацией комплекса PI3K-AKT- mTOR [32]. У млекопитающих mOR является участников двух разных комплексов: первый, mTORC1, включающий в себя MTOR, Raptor, GL, PRAS40 и Deptor, а второй mTORC2, состоящий из mTOR, Rictor, GL, SIN1, PRR5 и Deptor) [87]. Первый каскад, принимая сигнал от факторов роста или при повышенном содержании питательных веществ, ингибирует формирование аутофагосом, а второй каскад через регулирование АКТ-киназ угнетать фосфорилирование и затормаживать аутофагию [87, 185].
Процесс аутофагии происходит в несколько этапов. На первом этапе формируется двумембранная фагофора [174]. Под действием ULK1 комплекса (состоящий из ULK1, ULK2, ATG13 и FIP200), который является гомологом Atg1 дрожжей, осуществляется функция по инициации аутофагии [144]. Каскад mTORC1ингибирует аутофагию путем фосфорилирования ULK1, а в условиях голодания или стресса влияние mTORC1 на ULK1 останавливается, но ULK1активирует ATG13 и FIP200 и формируется фагофора [207]. Далее в процесс включаются Vps34 и Beclin-1. Vps34 отвечает за производство фосфолипидов в фагофоре, а Beclin-1, создавая комплекс с Ambra-1, UVRAG и BIF-1, взаимодействует с антиапоптотическим белком Bcl-2, нарушая его связь с Vps34 и ингибируя аутофагию [128, 207]. Следующий этап характеризуется удлинением и закрытием аутофагосомы. В результате формируется убихинон-подобный комплекс из ATG16L-ATG12-ATG5, которому необходимо содействие двух ферментов ATG7 и ATG10. Этот комплекс отсоединяется в конце формирования аутофагофоры [218]. Другая убихинон-подобная система включает в себя LC3, которая из формы LC3-I после взаимодействия с ATG3, ATG4, ATG7 превращается в LC3-II и накапливается на внутренней и наружной поверхности мембраны фагофоры. После слияния аутофагосомы с лизосомой с внешней мембраны удаляется и LC3-II [218]. Далее аутофагосома созревает, сливается с лизосомой при помощи Rab-7 и мембранными белками LAMP1 и LAMP2. После происходит активация лизосомальных ферментов и содержимое аутолизосомы расщепляется [105, 174]. Схема формирования аутолизосомы представлена на рисунке 4.
Влияние аутофагии на канцерогенез до сих пор остается неоднозначным [88]. С одной стороны, аутофагия выступает супрессором развития опухолевых клеток, когда разрушает онкогенные протеины, токсичные белки и дефектные органеллы, которые могут быть токсичными для клетки и способствовать повреждению ДНК [51, 145].C другой стороны, аутофагия может принимать участие в выживании опухолевых клеток в условиях гипоксии, присутствии активных форм кислорода, голодании, путем блокировки апоптоза, увеличивая шансы на выживание опухолевого клона и способствуя развитию опухолевого процесса [51, 181].
По данным Write E. J. и соавторов понижение уровня аутофагии в опухоли связывают с онкогенной функцией пути PI3-K, который запускает каскад реакций mTORC1[204]. По данным других источников опухолевые клетки с активированным процессом аутофагии отличаются устойчивостью к химиотерапии и повышенной агрессивностью, а в опухолях после химиотерапии и лучевой терапии наблюдается увеличение аутофагосом [114, 145].
В современных исследованиях авторы пытаются найти связь аутофагии с патогенетическими основами канцерогенеза. В литературе есть данные о влиянии белков аутофагии ATG5, LC3A и LC3B, Beclin-1 на клеточную выживаемость, развитие опухоли, прорастание и инвазию [37, 39, 65]. Белок ATG5 по данным литературы проявляет повышенную экспрессию у пациентов с лимфоваскулярной инвазией и принимает участие в метастазировании [37].
Анализ экспрессии белков-регуляторов аутофагии в зависимости от соотношения стромального и паренхиматозного компонента опухоли и степени воспалительной инфильтрации при колоректальном раке
Стромальный компонент в опухоли имеет не только опорную, модулирующую и трофическую функцию, но в совокупности с иммунокомпетентными клетками создает микроокружение вокруг опухоли, регулируя множество процессов, в частности, пролиферацию, ангиогенез, инвазию и др. В связи с этим представляло интерес изучить экспрессию регуляторов аутофагии в зависимости от соотношения паренхиматозного компонента, представленного непосредственно опухолевыми клетками и стромой новообразования.
На первом этапе нами была оценена связь экспрессии маркеров апоптоза, пролиферации и аутофагии в зависимости от соотношения стромального и паренхиматозного компонентов опухоли.
При оценке связи выраженности паренхиматозного компонента опухоли от наличия экспрессии белка аутофагии Beclin-1 статистически достоверных отличий обнаружено не было (2=0,27, p=0,87). Однако обнаружена связь наличия экспрессии белка mOR с соотношением стромы и паренхимы в первичной опухоли (таблица 16).
Как видно из данных таблицы, во всех случаях, в которых не отмечено позитивного окрашивания в опухолевых клетках с белку mOR строма опухоли была выражена минимально.
При оценке выраженности паренхиматозного компонента в зависимости от пролиферативной активности опухолевых клеток, оцененной по уровню экспрессии маркера Ki-67, существенных различий нами не обнаружено (2=1,5, p=0,45). Не обнаружено также какой-либо связи степени выраженности паренхимы с наличием экспрессии р53 в клетках опухоли (2=0,42, p=0,8). Однако положительная экспрессия Bcl-2 в клетках опухоли чаще обнаруживалась у пациентов с выраженностью паренхимы в диапазоне от 30% до 70% (таблица 17).
По результатам исследования не обнаружено какой-либо связи между степенью выраженности паренхиматозного компонента и уровнем экспрессии Beclin-1 (2=2,7, p=0,59), уровнем экспрессии mOR (2=7,2, p=0,12), уровнем экспрессии р53 (2=7,9, p=0,09), уровнем экспрессии Ki-67 (2=7,0, p=0,13).
В исследовании была оценена связь степени выраженности паренхиматозного компонента от процента экспрессии белков аутофагии, апоптоза и пролиферации (таблицы 18,19).
Из данных, представленных в таблице 18 следует, что процент экспрессии Beclin-1 в опухоли не связан со степенью выраженности паренхимы в опухоли. Напротив, процент экспрессии белка аутофагии mOR статистически значимо ниже у пациентов, в опухолях которых преобладает паренхиматозный компонент, а стромальный, соответственно, выражен минимально.
Нами не было обнаружено каких-либо различий в уровне экспрессии белков апоптоза и пролиферативной активности в зависимости от соотношения паренхиматозного и стромального компонента в опухоли (соответственно: р53 - F=2,786, p=0,072; Bcl-2 - F=0,301, p=0,741 и Ki-67 -F=0,493, p=0,612).
Микроокружение опухоли, представленное в значительной степени клетками воспалительного инфильтрата, является важным составляющим для прогрессии, пролиферативной активности, клеточной гибели, миграции, процессов инвазии и метастазирования опухоли. Клетки опухоли обладают различной способностью реагировать на сигнальные молекулы цитокинов, хемокинов, селектинов зоны воспаления. В связи с этим одной из задач нашего исследования явилась оценка, исследуемых молекулярно биологических маркеров колоректального рака в зависимости от степени выраженности инфильтрации иммунокомпетентными клетками стромы опухоли.
Результаты исследования показали, что статистически значимой связи степени выраженности воспалительного инфильтрата с наличием экспрессии белков аутофагии mOR обнаружено не было (таблица .20).
Однако при изучении связи частоты позитивной и негативной экспрессии в опухоли протеина Beclin-1 со степенью инфильтрации иммунокомпетентными клетками стромы новообразования нами была обнаружена отчетливая тенденция к снижению доли случаев с позитивной экспрессией при слабой и умеренной степени воспаления в строме (таблица 21).
Анализ соотношения степени выраженности воспалительного инфильтрата от наличия экспрессии белков Bcl-2 и Ki-67, в нашем исследовании не показал связи между указанными параметрами (Ki-67 2=0,15, p=0,92; Bcl-2 2=0,2, p=0,9).
При исследовании экспрессии онкопротеина p53 в зависимости от степени воспалительной инфильтрации в опухоли нами было выявлено, что большая частота случаев с положительной экспрессией данного белка обнаруживается при умеренном уровне воспалительной инфильтрации. При этом частота экспрессии данного белка была примерно одинаковой в группе пациентов со слабой инфильтрацией в строме опухоли (таблица 22).
Кроме анализа факта наличия или отсутствия экспрессии исследуемых молекулярных паттернов нами проведена оценка связи уровня экспрессии изучаемых белков с выраженностью воспаления. Нами не обнаружено существенных различий в зависимости от степени выраженности воспалительного инфильтрата и уровня экспрессии Beclin-1 (2=1,7, p=0,7), уровня экспрессии mOR (2=3,38, p=0,49), уровня экспрессии р53 (2=7,5, p=0,11), уровня экспрессии Bcl-2 (2=0,7, p=0,9).
Однако было обнаружено, что пролиферативная активность в опухоли отличалась в зависимости от степени выраженности воспалительной инфильтрации в строме новообразования. Так, при слабой степени инфильтрации иммунокомпетентными клетками преобладали опухоли с уровнем пролиферации до 35%, в то время как при выраженной воспалительной инфильтрации преобладали карциномы с уровнем пролиферации в диапазоне от 35% до 70% (таблица 23).
Прогнозирование вероятности лимфогенного метастазирования при колоректальном раке
На основании полученных данных в ходе исследования данных была построена математическая модель для прогнозирования вероятности риска развития лимфогенного метастазирования в группе больных колоректальным раком без предварительного предоперационного лечения.
В качестве независимых признаков в модель вошли такие показатели, как наличие зон некроза в опухолевой ткани, уровень экспрессии белка аутофагии Beclin-1 в опухоли, уровень экспрессии белка аутофагии mOR, наличие экспрессии белка p53, характер экспрессии белка p53 в опухолевой ткани, наличие в воспалительном инфильтрате экспрессии Ki-67 и Bcl-2.
Далее расчет вероятности риска лимфогенного метастазирования при колоректальном раке проводят по следующей формуле:
Y = 6 - 6X1 + 6X2- 14,8X3 + 11,9X4 + 9,8X5- 10,3Х6 + 11,9Х7, где Y - значение уравнения регрессии;
(6) - значение коэффициента регрессии свободного члена;
X1- наличие участков некроза в ткани опухоли (1 балл - участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; 2 балла - участки некроза в ткани опухоли присутствуют),
(6) - значение коэффициента регрессии признака Х1;
X2- процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка Beclin-1 (1 балл - в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка Beclin-1; 2 балла - в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка Beclin-1; 3 балла - в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка Beclin-1), (6) - значение коэффициента регрессии признака Х2;
Х3- процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка mOR (1 балл - в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка mOR; 2 балла - в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка mOR; 3 балла - в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка mOR), (-14,8) - значение коэффициента регрессии признака Х3;
Х4- наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53 (1 балл позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; 2 балла позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует), (11,9) - значение коэффициента регрессии признака Х4;
Х5- характер экспрессии р53 в ткани опухоли (1 балл - гомогенная экспрессия р53, 2 балла - гетерогенная экспрессия р53), (9,8) - значение коэффициента регрессии признака Х5;
Х6- наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии Ki-67 (1 балл - позитивная экспрессия Ki-67 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; 2 балла - позитивная экспрессия Ki-67 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует), (-10,3) - значение коэффициента регрессии признака Х6;
Х7- наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии Bcl-2 (1 балл - позитивная экспрессия Bcl-2 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; 2 балла - позитивная экспрессия Bcl-2 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует), (11,9) - значение коэффициента регрессии признака Х7.
Вероятность развития лимфогенных метастазов определяют по формуле: Р = еY/(1+ еY), где Р - значение вероятности развития признака; Y - значение уравнения регрессии; е - математическая константа, равная 2,72.
При вероятности Р50% определяют высокий риск развития лимфогенного метастазирования, при вероятности Р 50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов (степень достоверности 2 = 188,66; р = 0,0000). Чувствительность модели составила 83%, специфичность - 97,4%.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Пациентка Т., 68 лет, гистотип опухоли прямой кишки соответствует аденокарциноме. При гистологическом исследовании на светооптическом уровне в ткани опухоли участки некроза отсутствовали (1 балл). При иммуногистохимическом исследовании в ткани новообразования процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка Beclin-1 составил менее 35% (1 балл), процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка mOR составил более 70% (3 балла), также в ткани опухоли присутствовала позитивная экспрессия p53 (2 балла), при этом характер экспрессии p53 в опухоли был расценен как гетерогенный (2 балла). При оценке экспрессии изучаемых маркеров в клетках воспалительного инфильтрата опухоли было установлено отсутствие позитивной экспрессии Ki-67 (2 балла) и наличие позитивной экспрессии Bcl-2 (1 балл). Расчет степени риска лимфогенного проводили по формуле: Y = 6 - 6X1 + 6X2- 14,8X3 + 11,9X4 + 9,8X5- 10,3Х6 + 11,9Х7 = 6 - 61 + 61 - 14,83 + 11,92 + 9,82 - 10,32 + 11,91 = 6 - 6 + 6 - 44,4 + 23,8 + 19,6 - 20,6 + 11,9 = - 3,7
Вероятность развития лимфогенных метастазов определялось по формуле: Р = е-3,7/(1+ е-3,7) = 2,72-3,7/(1+2,72-3,7) = 0,024665791442429/1,024665791442429 = 0,02 = 2%. Таким образом, у пациентки был определен низкий риск развития лимфогенных метастазов. При исследовании лимфатических узлов метастатического поражения обнаружено не было.
Пример 2. Пациентка С., 63 лет, гистотип опухоли прямой кишки соответствует аденокарциноме. При гистологическом исследовании на светооптическом уровне в ткани опухоли участки некроза отсутствовали (1 балл). При иммуногистохимическом исследовании в ткани новообразования процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка Beclin 1 составил менее 35% (1 балл), процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка mOR составил менее 35% (1 балл), также в ткани опухоли присутствовала позитивная экспрессия p53 (2 балла), при этом характер экспрессии p53 в опухоли был расценен как гомогенный (1 балл). При оценке экспрессии изучаемых маркеров в клетках воспалительного Ki-67 (2 балла) и отсутствие позитивной экспрессии Bcl-2 (2 балла). Расчет степени риска лимфогенного проводили по формуле: Y = 6 - 6X1 + 6X2- 14,8X3 + 11,9X4 + 9,8X5- 10,3Х6 + 11,9Х7 = 6 - 61 + 61 - 14,81 + 11,92 + 9,81 - 10,32 + 11,92 = 6 - 6 + 6 - 14,8 + 23,8 + 9,8 - 20,6 + 23,8 = 28
Вероятность развития лимфогенных метастазов определялось по формуле: Р = е28/(1+ е28) = 2,7228/(1+2,7228) = 1472072884036,705/1472072884037,705 = 0,99 = 99%.
Таким образом, у пациентки был определен высокий риск развития лимфогенных метастазов. При оценке метастатического поражения в 5 лимфоузлах из 12 исследованных было обнаружено наличие метастазов.
Предлагаемый способ основан на анализе данных морфологического и иммуногистохимического исследования операционного материала.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью и информативностью при наличии конкретных числовых показателей прогнозировать вероятность лимфогенного метастазирования у пациентов с колоректальным раком, в частности, при аденокарциноме толстой кишки, что может позволить персонализировать тактику ведения больных.