Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Патогенетические аспекты метастатического поражения печени (обзор литературы). 14
1.1. Эпидемиология метастазов в печени у человека 14
1.2. Экспериментальные модели метастатического поражения печени 17
1.3. Основные методологические подходы к изучению процессов метастазирования 29
1.3.1. Генетический подход 29
1.3.2. Эпигенетический подход 38
1.4. Современные представления о патогенезе метастазирования 50
Глава 2. Общая характеристика экспериментального материала и методов исследования 65
2.1. Характеристика экспериментальных групп животных 65
2.2. Экспериментальные модели метастазирования в печень 67
2.3. Биохимические методы исследования 68
2.4. Морфологические методы исследования 69
2.5. Статистические методы исследования 69
Глава 3. Экспериментальные модели метастатического поражения печени у крыс 72
3.1. Модель сочетанного (гематогенно-лимфогенного) метастазирования 73
3.2. Модель гематогенного метастазирования в печень 78
3.3. Динамика веса и весовых коэффициентов внутренних органов у крыс при воспроизведении модели гематогенного метастазирова-ния в печень 82
Глава 4. Система биогенных аминов при экспериментальном метастазировании в печень у крыс 88
Глава 5. Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система при экспериментальном метастазировании в печень у крыс 163
Глава 6. Гипоталамо-гипофизарно-гонадная система при экспериментальном метастазировании в печень у крыс 184
Глава 7. Гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная система при экспериментальном метастазировании в печень у крыс 228
Глава 8. Пролактин, гормон роста, инсулиноподобные факторы роста и их антагонист – фактор роста фибробластов при экспериментальном метастазировании в печень у крыс 266
8.1. Пролактин 266
8.2. Гормон роста, инсулиноподобные факторы роста и их антагонист – фактор роста фибробластов 21 278
Глава 9. Система ростовых факторов: VEGF, EGF, ТGF, НGF при экспериментальном метастазировании в печень у крыс 311
Глава 10. Факторы апоптоза при экспериментальном мета стазировании в печень у крыс 345
Глава 11. Система активации плазминогена в печени и метастазах, локализованных в ней, на этапах экспериментального злокачественного процесса у крыс 358
Заключение 367
Выводы 393
Практические рекомендации 397
Список сокращений 399
Список литературы 401
- Экспериментальные модели метастатического поражения печени
- Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система при экспериментальном метастазировании в печень у крыс
- Гормон роста, инсулиноподобные факторы роста и их антагонист – фактор роста фибробластов 21
- Факторы апоптоза при экспериментальном мета стазировании в печень у крыс
Экспериментальные модели метастатического поражения печени
В качестве объектов исследования при моделировании метастатического поражения печени, как правило, используются мыши или крысы с сохраннным или ослабленным иммунитетом. Животным с нормальным иммунитетом (беспородным или линейным) перевивают опухолевые штаммы соответствующей видовой принадлежности или вводят канцерогены. Иммунодефицитным животным, к которым относят Nude животных, животных с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) и некоторых других, осуществляется перевивка человеческих опухолей различной гистоструктуры. У Nude крыс и мышей нет тимуса и, следовательно, они не могут образовывать Т-лимфоциты. Мыши SCID имеют мутацию в рецепторе цитокинов (IL2), что приводит к нарушению созревания лимфоцитов и дефициту циркулирующих зрелых функциональных T- и B-клеток. Одной из сильных сторон применения иммунодефицитных животных является широкий спектр доступных типов опухолей и возможность генетической или терапевтической манипуляций ex vivo до ксенотрансплантации. Однако необходимо признать и ряд недостатков таких моделей: кровоснабжение и строма опухоли обеспечиваются мышью, ортотопическая трансплантация технически затруднена, метастазирование неоплазм возникает очень редко. Более того, если источником ксенотрансплантатов являются постоянные непрерывно перевивающиеся ( 100 раз) клеточные линии, то они становятся недифференцироваными и теряют сходство с реальной гистологией и зоной болезни человека (Sausville E.A., Burger A.M., 2006). Мутантные животные не всегда доступны, в числе прочего и вследствие их высокой стоимости. У иммунодефицитных животных в качестве моделей злокачественных опухолей, метастазирующих в печень, используются, главным образом, две, наиболее часто метастазирующие в печень у людей: человеческий колоректальный рак и человеческая протоковая аденокарцинома поджелудочной железы.
По способу воспроизведения все известные экспериментальные модели метастатического поражения печени можно разделить на три основные группы. Первая – объединяет модели, в которых для получения опухолевого узла в печени злокачественные клетки вводят либо непосредственно в печень субкапсулярно или в толщу паренхимы (Heijstek M.W. et al., 2005; Sperling J. et al., 2013; Strowitzki M.J. et al., 2014); либо в вены: портальную (Gl N. et al., 2012; Georges R. et al., 2012; Eyol E. et al., 2012; Krause P. et al., 2013; Valles S.L. et al., 2013; Hatwell C. et al., 2014; Bocuk D. et al., 2017), верхнюю брыжеечную (Muraoka T. et al., 2013) или селезночную (Zhou H.S. et al., 2016).
Примерами моделей данной группы с использованием клеточных линий ко-лоректального рака соответствующей видовой принадлежности могут служить следующие. Введение опухолевых клеток линии CMT-93 (клетки мышиной аде-нокарциномы колоректальной области) в портальную вену C57BL/6NCrl мышей. У 70–80% животных возникали метастазы в печени. Клетки CMT-93 колонизировали около 30–50% мышиной печени, при этом опухолевые очаги увеличивались примерно до 5–10 мм в диаметре. Положительные стороны: мыши являлись им-мунокомпетентными, что позволяло исследовать нормальный иммунный ответ организма на рост опухоли, клеточная линия CMT-93 возникла у мышей той же линии, которая была использована для воссоздания метастазов в печени, что предупреждало отторжение опухолей (Bocuk D. et al., 2017). В ходе работы были испробованы, но отвергнуты другие опухолевые штаммы и линейные мыши, в частности, линия опухолевых клеток APC1638-NT при перевивке мышам C57BL/6N или C57BL/6 J не давала метастазы в печени.
Другой пример – интрапортальная имплантация клеток колоректальной карциномы CC531 (злокачественные клетки выделены из индуцированной 1,2-диметилгидразином аденокарциномы толстой кишки у крыс Wag/Rij) в печень сингенных крыс, приводящая к быстрому и локально агрессивному развитию метастазов в печени, которые росли путем диффузной инфильтрации с удвоением объма опухоли в течение 20 часов и обильным ангиогенезом (Georges R. et al., 2012).
Кроме колоректального рака, чаще всего в печень метастазирует рак поджелудочной железы (PDAC). Для имитации PDAC было создано множество моделей. К ним относятся модели ксенотрансплантатов клеток рака поджелудочной железы человека, такие как MIA PaCa-2, CFPAC-1, Panc-1, Capan-1, Capan-2, BxPC-3, SW1990, AsPC-1, Colo 357 и другие. Кроме того, были использованы линии клеток грызунов: AS (инвазивные, но не метастатические) и ASML (высокометастатические in vivo, но не инвазивные) клетки, полученные из линии клеток рака поджелудочной железы BSp-73 (Eyol E. et al., 2012). Также появились генетические модели – мыши Mist1-KrasG12D, которые развивают метастазирующую экзокринную панкреатическую карциному и гепатоцеллюлярную карциному смешанной дифференцировки (Tuveson D. et al., 2006). Стабильный рост опухоли давали четыре клеточных линии: ASML, AS, Suit2-013 и Suit2-007. Оставшиеся линии клеток показали либо умеренную, либо малую скорость роста, за которой следовала регрессия опухолевых узлов (AsPC-1, BxPC-3, Colo-357 и Panc-89) или не вырастали метастазы в печени (Capan-1, DAN-G, MIA PaCa-2, Panc-1, Patu 390, SU86.86 и T3M4) (Eyol E. et al., 2012).
ASML-клетки получали из аденокарциномы поджелудочной железы, растущей у крыс BDX. В связи с коммерческой недоступностью этих крыс вместо них использовали другую линию иммунокомпетентных крыс (Wag/Rij). Однако через 2 недели опухоли, вызванные внутрипортальной имплантацией клеток ASMLGFP-LUC, регрессировали. Поэтому для всех последующих экспериментов использовались Nude крысы (RNU-Strain). У иммунокомпрометированных крыс 2107 клеток ASMLGFP-LUC вызывали устойчивый рост опухоли c 1 по 4 пассаж. После 6 пассажа метастазы появлялись по краям долей печени (жемчужное ожерелье). Карцинома в печени росла в виде узлов с большим количеством волокнистой соединительной ткани. Опухолевые узлы были четко отделены от нормальной ткани печени (Eyol E. et al., 2012).
Suit-2 клетки были выделены от 73-летнего японца, у которого в печени развилась метастатическая панкреатическая карцинома. Линию клеток S2-007, являющуюся субклоном клеток Suit-2, очень агрессивным и способным метастази-ровать в печень, интрапортально инъецировали Nude крысам. Через две недели образовались метастазы в печени. После 3 перевивки, был установлен новый субклон Suit2-007, который был способен образовывать метастазы в печени в два раза быстрее. S2-013 modelSuit2-013 – еще один подклон Suit-2, который инициирует менее агрессивную метастатичекую модель. После первой внутрипортальной инъекции клетки сначала медленно умерли в печени, затем спонтанно регрессировали у некоторых животных. Через 24 дня после их имплантации под капсулу средней доли печени Nude крысы наблюдался устойчивый рост опухоли. Впоследствии полученные опухолевые клетки инъецировали внутрипортально, что приводило к образованию опухолей в печени через 3–4 недели (Eyol E. et al., 2012). Основные недостатки перечисленных моделей: быстрая гибель опухолевых клеток при попадании в воротоную вену (Bouvet M. et al., 2006), образовавшийся опухолевый процесс в печени нельзя считать метастазом, поскольку отсутствует первичный очаг, дающий метастатические отсевы и влияющий на них, нет ранних шагов метастатического каскада.
Наличие первичной злокачественной опухоли очень важно в экспериметаль-ной модели метастатического поражения любой локализации, предполагающей изучение патогенеза этого процесса, поскольку многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о существовании постоянного взаимодействия между организмом, развивающейся в нм злокачественной опухолью и метастазами. Удаление опухолевого узла нередко приводит к усилению метастази-рования, что косвенно свидетельствует о способности первичной опухоли влиять на эти процессы. Существуют различные точки зрения относительно факторов, связанных с первичной опухолью, которые тормозят образование метастазов. К ним относятся антитела, комплексы «антиген-антитело», некоторые компоненты системы комплемента, ангиостатин и эндостатин (Уразова Л.Н. и соавт., 2004, Peeters C.F. et al., 2005). Так, удаление первичной опухоли увеличивало метаболическую активность метастазов печени, тогда как уровни ангиостатина и эндостати-на в плазме снижались. Это открытие указывает на то, что первичные опухоли подавляли ангиогенез в метастазах, и что удаление первичного очага вызывало вспышку неоангиогенеза и, таким образом, повышало метаболическую активность в метастазах печени (Peeters C.F. et al., 2005). Кроме того, известно, что первичная опухоль продуцирует факторы, участвующие в формировании преметастатической ниши во вторичных органах. Такой факт установлен в отношении гипоксии первичной опухоли.
Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система при экспериментальном метастазировании в печень у крыс
Известно, что гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система (ГГНС) одна из первых начинает реагировать на действие стрессорных факторов активацией синтеза АКТГ в гипофизе и, как следствие, увеличением стимуляции коркового слоя надпочечников с формированием его гипертрофии и повышенным синтезом и выбросом глюкокортикоидных гормонов в кровь. Кортикотропин-рилизинг гормон (КТ-рг) является основным регуляторным пептидом в гипотала-мо-гипофизарно-надпочечниковой оси в условиях стресса, активируя е (Theo-harides T.C., Konstantinidou A.D., 2007). В ответ на стресс КТ-рг продуцируется в гипоталамическом паравентикулярном ядре (Kageyama K. et al., 2011). Однако функции КТ-рг на этом не ограничиваются. Так, установлено, что более высокомолекулярная форма иммунореактивного -эндорфина, предполагаемого про-опиомеланокортина (POMC), увеличивается у мышей с нокаутом КТ-рг, что указывает на его важную роль в обработке POMC путем изменения уровней экспрессии рецептора первого уровня прогормона (Kageyama K. et al., 2011).
Развитие злокачественного процесса в организме – это особенный «стрес-сорный фактор», поскольку, с одной стороны, нервная и эндокринная системы играют важную роль в возникновении и росте злокачественных опухолей, с другой – опухоль вызывает глубокие нарушения нейрогуморальной регуляции, которые, в свою очередь, могут выступать в качестве дополнительного патогенетического фактора е прогрессии.
Учных давно интересовала роль ГГНС в канцерогенезе. В этом аспекте было проведено немало успешных экспериментальных и клинических исследований и обнаружено, в частности, что один из механизмов канцерогенного эффекта глюкокортикоидов основан на их иммунодепрессивных способностях, нередко ассоциированных с нарушениями жирового и углеводного обменов (Бер-штейн Л.М., 2004; Reiche E.M. et al., 2004). Однако роль ГГНС в механизмах ме-тастазирования исследовалась мало.
В конце 20 века группа экспериментаторов во главе с К.П. Балицким (1991) начала всестороннее изучение метастатической болезни, в том числе и участия в ней ГГНС. В качестве объектов исследования были выбраны экспериментальные модели, метастазирующие преимущественно в лгкие: карцинома 3LL и меланома В16 у мышей. Установлено, что при развитии злокачественного процесса с метастатическим поражением лгких происходило усиление работы ГГНС. Об активации гипофизарно-надпочечникового комплекса свидетельствовало значительное нарастание концентрации 11ОКС в крови на 3 сутки роста опухоли и кортикотро-пина – на 21 сутки. На фоне общего гиперкортицизма выявлен низкий уровень 11ОКС в опухоли и окружающих е тканях: на 14–28 сутки содержание 11ОКС составляло 50–65% от уровня в интактной ткани (Балицкий К.П. и соавт., 1991). S.L. Valles et al. (2013) и M. Benlloch et al. (2016) подтвердили эту тенденцию у мышей с меланомой В16, метастазирующей в лгкие и печень – постепенное увеличение уровней АКТГ, кортикостерона и норадреналина в крови по мере развития злокачественного процесса.
В настоящее время – в век геномных исследований природы рака, изучению функционирования регуляторных систем организма, в том числе и ГГНС, при он-копатологии уделяется гораздо меньше внимания, но вс-таки изыскания в этом направлении продолжаются. По большей части, это клинические работы, которые ограничены наличием доступного для исследования материала, представленного кровью, а также тканями опухолей или метастазов, полученных во время оперативного вмешательства. Несмотря на скудность клинических данных, такие исследования позволяют показать участие ГГНС в течение опухолевой болезни у большей части онкобольных как при гормонально-зависимых опухолях (рак предстательной железы, молочной железы, тела матки), так и при опухолях, привычно не относимых к гормоночувствительным (рак легкого, носоглотки, неходжкин-ские лимфомы и другие). Например, выявлено изменение содержания кортизола в сыворотке крови, направленность и выраженность которого зависела от злокачественной нозологии (Никитина В.П., 2005; Козлова М.Б. и соавт., 2009; 2012; 2014 (1)). Так, при раке тела матки, молочной железы, носоглотки, неходжкинских лимфомах гиперкортизолемия регистрировалась у всех или большей части больных. При раке легких, почек и меланоме кожи концентрация кортизола изменялась у меньшей части больных, причем сдвиги гормона у больных со злокачественной опухолью одной локализации могли иметь разную направленность. Особняком стояли больные с метастатической болезнью головного мозга – у них уровень кортизола в крови в той или иной степени падал вне зависимости от места расположения первичной опухоли (Айрапетов К.Г., 2011; Козлова М.Б. и со-авт., 2012; 2014 (2)). В то же время у больных раком молочной железы с внутри-легочными метастазами уровень кортизола в сыворотке не отличался от здоровых лиц (Андреяшкина И.И., 2012). В опухолевой ткани мозга при глиобластомах, ме-нингиомах, метастазах рака молочной железы увеличивались уровни кортизола и АКТГ, в то время как в перифокальной зоне первичной глиобластомы концентрации кортизола и АКТГ оказались также увеличены, как и в опухолях, а в параме-тастатической зоне метастаза рака молочной железы – не изменялись (Кит О.И. и соавт., 2016). У больных раком тела матки все стадии болезни сопровождались повышенной секрецией АКТГ гипофизом, гиперподукцией кортизола корой надпочечников, увеличением экскреции свободных 17-оксикетостероидов и кортизона и снижением всех остальных показателей (кортизол, тетрагидроформы, 17-кетостероиды). Применение различных видов аутобиохимиотерапии: эндо-лимфатической, аутогемохимиотерапии, аутолимфохимиотерапии, – сопровождалось статистически значимым уменьшением исходно высокого уровня экскреции кортизола за счет повышения его трансформации в кортизон и усилением продукции дегидроэпиандростерона. Оперативное вмешательство вызывало увеличение уровня кортизола в крови у больных раком тела матки репродуктивного возраста в 1,3 раза, в результате сочетанной лучевой терапии в 1,5 раза снижался уровень суммарных 17-оксикетостероидов, экскреция кортизона и его тетрагид-ропроизводных. Повышение экскреции кортизона и дегидроэпиандростерона после химиотерапии сочеталось со степенью ее эффективности. Увеличение концентрации кортизола в крови выше нормы после лечения оказалось прогностическим в отношении развития рецидива заболевания (Никитина В.П., 2005).
Ряд зарубежных исследований был посвящн изучению особенностей цир-кадной секреции глюкокортикоидов при онкопатологии. Установлено, что циркад-ная система синхронизации, контролируемая супрахиазматическими ядрами гипоталамуса, регулирует суточные ритмы двигательной активности и адренокорти-кальной секреции. Изменение этих ритмов связано с плохой выживаемостью у пациентов с метастазами в печень при колоректальном раке и раке молочной железы (Touitou Y. et al., 1995; Mormont M.C. et al., 2000; Filipski E. et al., 2002). При раке молочной железы ранняя смертность наблюдалась у пациентов с относительно «плоскими» ритмами. Пациенты с метастазами в молочной железе, в отличие от пациентов с висцеральными или костными метастазами, имели более ритмичные профили кортизола (Sephton S.E. et al., 2000). Клинические данные были подкреплены экспериментальными исследованиями, установившими ускоренный рост злокачественных опухолей двух типов: остеосаркомы Глазго и аденокарциномы поджелудочной железы, – при нарушении циркадных ритмов у мышей вследствие полного разрушения супрахиазматических ядер гипоталамуса (Filipski E. et al., 2002).
Также были найдены экспериментальные работы, направленные на изучение особенностей функционирования системы КТ-рг при злокачественном процессе, в том числе и метастазировании в печень. Установлено, что урокортин (Ucn), относящийся к семейству белков КТ-рг, способствовал миграции опухолевых клеток HepG2 и SMMC-7721 в печень путем регуляции экспрессии cPLA2 через CRFR1, и подавлял миграцию опухолевых клеток путем снижения уровня экспрессии iPLA2 через CRFR2. Эти результаты указывают на двойную роль UCN в миграции злокачественных клеток, которая связана с регуляцией как cPLA2, так и iPLA2 (Zhu C. et al., 2014). Найдено, что пептиды КТ-рг выступают в качестве медиаторов перекрестных взаимодействий между клетками печени и инфильтрирующими иммунными клетками при раке (Theoharides T.C., Konstantinidou A.D., 2007).
Неоднозначность динамики компонентов ГГНС в крови и злокачественной ткани у онкобольных, скудность экспериментальных данных требуют продолжения изучения роли этой регуляторной системы на этапах развития злокачественной патологии.
Целью данной главы явилось изучение особенностей функционирования ГГНС на этапах развития злокачественного процесса с метастатическим поражением печени: в центральном регуляторном звене (гипофиз, гипоталамус), в периферическом гормональном звене (надпочечниках), в органах реципиентах и/- донорах злокачественных клеток (селезёнка, первичная опухоль, печень, метастазы печени), а также в связующем звене всего организма - сыворотке крови у крыс мужского пола.
Установлено, что выведение селезёнки под кожу сопровождалось накоплением в ней кортизола - увеличение содержания в 3,5 раза (таблица 5.1).
Гормон роста, инсулиноподобные факторы роста и их антагонист – фактор роста фибробластов 21
Как уже было отмечено, гормон роста (СТГ) относится к одному большому семейству пептидных гормонов гомологичной структуры и перекрывающимися биологическими свойствами. Оно включает в себя пролактин и члены его семейства (плацентарные лактогены (PL), пролактин-подобные белки (PLP), пролактин-связанные белки (PRP), пролиферин (PLF) и связанный с PLF белок (PLF-RP)), а также – СТГ и члены семейства СТГ. СТГ, как и пролактин, представляет собой одноцепочечный полипептид, состоящий из 190–200 остатков с молекулярной массой 22–23 кДа, имеет третичную структуру, представляющую собой пучок четырех антипараллельных -спиралей, и использует консервативный однопроходный трансмембранный рецептор, названный рецептором цитокинового типа 1 (Ben-Jonathan N. et al., 2006).
СТГ синтезируется не только в гипофизе, но и в других тканях: респираторной, желудочно-кишечного тракта, нервной, иммунной, репродуктивной (Harvey S., 2010; Sustarsic E.G. et al., 2013), участвует в регуляции постнатального роста и метаболизма, а его действие часто опосредуется через инсулиноподобный фактор роста 1(IGF1) (Ben-Jonathan N. et al., 2006; Inagaki T. et al. 2008). СТГ играет важную роль в регуляции сердечно-сосудистой, дыхательной, почечной, репродуктивной и иммунной систем. Эта роль выполняется через повсеместно расположенные рецепторы СТГ. Активация рецептора СТГ эндокринным или аутокринным (паракринным) гормоном роста индуцирует транскрипцию IGF1 и рецепторы про-лактина, EGF, эстрогенов и андрогенов, а также способствует синтезу и секреции инсулина и регулируется SOCS, фосфатазами и PIAS. Свои эффекты СТГ может инициировать и через рецепторы пролактина (Bernichtein S. et al., 2010).
Большое количество данных подтверждают роль оси СТГ-IGF в заболеваемости и прогрессировании рака (Clayton P.E. et al., 2010). Модели грызунов, лишенные СТГ или его родственных рецепторов, поразительно устойчивы к индукции и тяжести широкого спектра злокачественных заболеваний (Ikeno Y. et al., 2009), а лечение антагонистом рецептора СТГ пегвизоманом может замедлять прогрессирование опухолей (Divisova J. et al., 2006). Мыши, трансгенные по гену СТГ, характеризуются более частым и ускоренным развитием опухолей печени (Snibson K.J., 2002). СТГ считается ответственным за увеличение частоты некоторых условно предраковых состояний и злокачественных опухолей толстой кишки, щитовидной железы у больных, страдающих акромегалией (Sustarsic E.G. et al., 2013; Dagdelen S. et al., 2014). Его бластомогенные свойства выявлены также при определнных экспериментальных исследованиях (Lupulescu A., 1996). Сообщается, что рецептор СТГ экспрессируется в клетках меланомы (Sustarsic E.G. et al., 2013). Введение СТГ извне увеличивало злокачественность клеток меланомы B16/F10 и образование метастазов в легких у мышей DJ-1 KO (Chien C.H. et al., 2016). Увеличение уровня эндогенного СТГ вызывало рак молочной железы у трансгенных мышей (Jenkins P.J. et al., 2006).
Установлено, что стимуляция рецептора СТГ приводит к активации онко-генных путей Src, Ras/ERK, PI3-киназы и NF-B, а также – STAT, STAT3 и STAT5. Комплексы с глюкокортикоидными рецепторами и TGF необходимы для трансформационных действий ядерной локализации рецептора СТГ. Причм как промотер рака, как и в случае с пролактином, преимущественно действует ауто-криный СТГ (Chhabra Y. et al., 2017). Экспрессия рецептора СТГ повышается во многих злокачественных опухолях (Stajduhar E. et al., 2014).
Как уже было упомянуто, посредниками действия СТГ на многие ткани являются инсулиноподобные факторы роста (IGF): IGF1 и IGF2, представляющие собой группу факторов роста структурно похожих на инсулин и являющихся важными регуляторами энергетического обмена и роста (Capoluongo E., 2011). Они участвуют в клеточной пролиферации, миграции, адгезии и ограничении апоптоза (Chitnis M.M. et al., 2008; Tian D., Kreeger P.K., 2014).
Оба ростовых фактора обладают различным сродством к трм рецепторам IGF1, IGF2 и, в меньшей степени, к рецептору инсулина, а также к IGF-связывающим белкам, число которых доходит до 6. Формируется своеобразная буферная система IGF/IGF-связывающие белки (Tian D., Kreeger P.K., 2014). IGF2 является наиболее важным на стадии эмбриона, а IGF1 более значительным для пост-натального развития (Siddle K., 2012). IGF1 (в основном) и IGF2, продуцируемые в результате активации рецептора СТГ и регулируемые СТГ-зависимым IGFBP3/ALS, связываясь с рецептором IGF1 (IGFR1), запускают каскад трансдук-ции сигнала, что приводит к увеличению пролиферации и повышенной выживаемости клеток, чувствительных к IGF, а, следовательно, к прогрессированию опухолей (Chhabra Y. et al., 2011; Weroha S.J., Haluska P., 2012). Известно, что рецептор IGF1 эволюционировал из того же предкового рецептора, что и инсулиновый рецептор, и состоит из двух полурецепторов, каждый из которых содержит одну внеклеточную -субъединицу и одну трансмембранную -субъединицу, которая обладает активностью тирозинкиназы. Кроме того, рецептор инсулина (IR) и IGFR1, которые в норме находятся в качестве гомодимеров, при злокачественной патологии могут гетеродимеризоваться с образованием гибридных рецепторов инсулина и IGF. Оба гибрида IR-A-IGFR и IR-B-IGFR связывают IGF1 и IGF2 с высоким сродством на уровне, сравнимом с гомодимерным IGFR (Benyoucef S. et al., 2007). В целом если посчитать все возможные гомодимеры и гибридные рецепторы, существует потенциально восемь рецепторов тирозинкиназы, вовлеченных в трансдукцию сигнала (Yee D., 2012). IGF2 также взаимодействует со своим рецептором (IGFR2), который уменьшает передачу IGF2 посредством лизосомной деградации. Лиганд IGF и его рецепторная экспрессия жестко регулируются в клеточном типе и пространственно-временном режиме (Epaud R. et al., 2012).
Эпидемиологические исследования выявили взаимосвязь увеличения циркулирующих IGF в крови с ростом случаев колоректального рака, рака молочной железы, предстательной железы, легких и яичников (Weroha S.J., Haluska P., 2012; Yee D., 2012; Stajduhar E. et al., 2014). В то же время другие исследователи такой закономерности не обнаружили: при раке предстательной железы уровень IGF1 увеличивался в крови незначительно только на последних стадиях заболевания (Allen N.E. et al., 2007), риск рака эндометрия не был связан с уровнями IGF1, IGFBP2 и IGFBP3 (Lukanova A. et al., 2004), не найдена связь между сывороточными уровнями IGF1, IGF2 и IGFBP3 и риском развития рака желудка (Pham T.M. et al., 2007), колоректальным раком (Suzuki S. et al., 2009), сывороточными уровнями IGF1 и IGF2 и раком молочной железы (Sakauchi F. et al., 2009).
Неоднозначные результаты исследования динамики IGF в сыворотке крови при раке могут быть обусловлены особенностями популяции, в которой проводились исследования. Так, у лиц японской национальности со злокачественной патологией уровень компонентов системы IGF в крови не изменялся, в то время как у европейцев было выявлено увеличение содержания IGF1 и/или IGF2 в крови. В целом показана возможность продукции IGF злокачественными опухолями (Боч-карева Н.В. и соавт., 2008; Кушлинский Н.Е., Тимофеев Ю.С., 2011; Chitnis M.M. et al., 2008). Установлено, что клетки рака яичников, лгких, глиом, сарком, мела-номы чувствительны к IGF1 (Capoluongo E., 2011; Tian D., Kreeger P.K., 2014), а молочной железы – к IGF2 (Sakauchi F. et al., 2009). Причм клеточная пролиферация меланомы индуцируется именно системой IGF (Capoluongo E., 2011). У пациентов с акромегалией – эндокринным расстройством, которое характеризуется гиперсекрецией СТГ, и, следовательно, более высоким эндогенным IGF, двукратно увеличивался риск развития рака желудочно-кишечного тракта (Weroha S.J., Haluska P., 2012).
Исследования, проведенные за последние два десятилетия, показали важность IGFR1 при опухолегенезе, метастазировании и резистентности к существующим формам терапии рака (Chitnis M.M. et al., 2008). Дизрегуляция IGFR1 встречается во многих злокачественных опухолях: предстательной железы, молочной железы, колоректальном раке, почечно-клеточной карциноме, раке яичников (Tian D., Kreeger P.K., 2014). Так, при раке яичников избыточная экспрессия IGFR1 коррелировала с плохим прогнозом. В то время как при раке молочной железы его низкий уровень увеличивал риск метастазирования за счт нарушения комплекса E-cadherin-catenin (Tian D., Kreeger P.K., 2014). Сигнализация как инсулином, так и IGF была связана с регуляцией продолжительности жизни и неоплазией (Siddle K., 2012). И, наоборот, отсутствие рака было зарегистрировано у людей с врожденным недостатком IGF1: синдромом Ларона, удалением гена СТГ, дефектами рецептора СТГ, резистентностью к IGF1 (Yee D., 2012; Sustar-sic E.G. et al., 2013).
Оба инсулиноподобных фактора в крови человека циркулируют в виде белкового комплекса, состоящего из IGFBP, молекулы IGF1 или IGF2 и кислото-лабильной субъединицы, только около от одного до 5–6% IGF по данным разных авторов остаются в свободной форме (Шарова А.А., 2011). Концентрация IGF в сыворотке зависит, прежде всего, от IGFBP3, который является наиболее распространенным связывающим белком с самым высоким сродством к IGF1 и IGF2, около 90% IGF1 связывается с IGFBP3 (Balch C.M. et al., 2009). Хотя IGFBP синтезируются, главным образом, в печени, многие нормальные и злокачественные ткани: рак легких, молочной железы и яичников экспрессируют IGFBP (Wero-ha S.J., Haluska P., 2012). Считается, что эти молекулы влияют на злокачественность несколькими механизмами. Они регулируют биодоступность и период полувыведения IGF в кровообращении и обеспечивают механизм транспортировки в органы-мишени. IGFBP модулируют активность IGF посредством важных взаимодействий с внеклеточными протеазами, которые разрушают связь лиганда с IGFBP и способствуют его высвобождению и последующей активации IGFR1.
Факторы апоптоза при экспериментальном мета стазировании в печень у крыс
Семейство факторов некроза опухолей и каспазы принято считать маркерами апоптоза – генетически регулируемого процесса избавления от «ненужных» в функциональном отношении клеток. Однако появляется вс больше доказательств того, что факторы апоптоза плейотропны.
Семейство факторов некроза опухолей многочисленно и кроме TNF и включает Fas (СD95), Fas L, TRAIL, СD40L, CD27L, OX30L, DR4 (TRAIL-R1), DR5 (TRAIL-R2). Существуют две формы TNF: трансмембранная (проNF) и растворимая (секреторная, зрелая). Трансмембранная форма представляет собой мономер, встроенный в клеточную мембрану и состоящий из 233 аминокислотных остатков; она обусловливает паракринные эффекты TNF. Путем протеоли-тического отщепления внеклеточного домена трансмембранной формы за счет действия TACE (TNF-конвертирующего фермента) или адамализина (члена класса трансмембранных протеолитических ферментов), имеющих в своем составе домен матричной металлопротеиназы, образуется растворимая форма TNF, которая по своей биологической активности во многом превосходит трансмембранную; с помощью этой формы TNF реализует свои основные функции (Знаменская Л.Ф. и соавт., 2011; Schottelius A.J. et al., 2004). TNF могут продуцировать многие клетки организма: фибробласты, кератиноциты, гладкомышечные клетки, остеобласты, клетки глии, астроциты, клетки пигментного эпителия сетчатки, нейроны, B- и T-лимфоциты, базофилы, эозинофилы, дендритные клетки, натуральные киллеры, нейтрофилы, тучные клетки, клетки сперматогония и многие виды опухолевых клеток. Однако основными источниками синтеза TNF являются моноциты и тканевые макрофаги (Знаменская Л.Ф. и соавт., 2011). Подавлять экспрессию гена TNF могут кортикостероиды, простагландины, а также медиаторы, синтезированные под действием самого TNF (Schottelius A.J. et al., 2004).
Биологическая функция TNF реализуется путем его связывания со своими рецепторами: типа I (TNF-RI) и типа II (TNF-RII), представляющими собой трансмембранные гликопротеиды, внеклеточные домены которых похожи, а внутриклеточные отличаются, что опосредует различные биологические эффекты. TNFRI представлены на всех клетках организма, кроме эритроцитов; связь лиган-да с ними прочная. TNFRII экспрессируются преимущественно на эндотелиаль-ных клетках и клетках гемопоэтического ряда; сродство лиганда с ними значительно ниже, поэтому при низкой концентрации TNF TNFRII может выступать в роли депо цитокина, задерживая его в организме и обеспечивая в случае необходимости передачу сигнала на TNFRI (Al-Lamki R.S. et al., 2001).
Через TNFRI реализуются апоптотический и провоспалительный внутриклеточные сигнальные пути. Апоптотический путь TNFRI играет второстепенную роль и часто замаскирован эффектами главного провоспалительного пути, который, в конечном итоге, активирует ядерный фактор B (NF-B) – белок, управляющий транскрипцией ДНК и стимулирующий синтез различных пептидов, ответственных за пролиферацию и воспаление (Egberts J.H. et al., 2008). Активация NF-B-зависимого пути приводит к торможению апоптоза, а его ингибирование усиливает проапоптотический эффект TNF. Через TNFRII реализуется третий сигнальный путь, посредством которого осуществляется контроль межклеточных взаимодействий, пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. Индукция этого сигнального пути заканчивается активацией транскрипционного белка-активатора 1, регулирующего экспрессию различных генов (Zhao Y. et al., 2007). Выбор доминирующего пути зависит от внутриклеточной концентрации белков-посредников. Например, увеличение внутриклеточной концентрации RIP, вызванное IL2, ведет к апоптозу клеток, а истощение RIP тормозит его (Знаменская Л.Ф. и соавт., 2011).
Под действием TNF синтезируется ряд цитокинов, таких как IL1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12, IL18, INF, TGF, LIF (фактор, ингибирующий лейкемию), MIF (фактор торможения миграции макрофагов), гормонов (кортизол, адреналин, глюкагон, инсулин и норадреналин) и различных других молекул (белки острой фазы, лейкотриены, свободные радикалы кислорода, фактор активации тромбоцитов (PAF), оксид азота и простагландины) (Знаменская Л.Ф. и соавт., 2011; Schotelius A.J. et al., 2004).
Известно, что TNF играет важную роль в формировании микроокружения опухоли (Balkwill F., 2009). TNF является промотером многих опухолей, способствуя их росту, инвазии и метастазированию непосредственно или за счт увеличения в них экспрессии других цитокинов, таких как IL6, CXCL12 и CCL2 (Szlosarek P. et al., 2006). Мыши TNF (-/-) устойчивы к развитию доброкачественных и злокачественных опухолей кожи, независимо от того, были ли они вызваны инициацией DMBA, промотированием с помощью TPA или путем повторного воздействия DMBA (Moore R.J. et al., 1999). TNF участвует в патогенезе злокачественных опухолей молочной железы, яичников, почек, поджелудочной железы и других (Szlosarek P. et al., 2006; Harrison M.L. et al., 2007; Egberts J.H. et al., 2008). Изменение уровня TNFa в крови наряду с IL2 и IL8 значимо для прогнозирования продолжительности ремиссии при раке печени и толстой кишки (Lukasiak S. et al., 2008; Aichem A., Groettrup M., 2016; Fichtl J. et al., 2016).
В семействе каспаз идентифицировано 14 ферментов. Наиболее важной инициаторной каспазой, приводящей к запуску рецептор опосредованного пути апоптоза, является каспаза 8. Митохондриальный путь апоптоза обычно опосредован активностью инициаторной каспазы 9. В обоих случаях ключевой эф-фекторной каспазой, приводящей к расщеплению клеточного субстрата, служит каспаза 3. Цитохром С запускает процесс активации каспазы 3 и каспазы 7, что в конечном итоге и приводит к фрагментации ДНК и апоптозу (Вишнякова П.А. и соавт., 2014).
Каспаза 3 регулирует клеточный цикл, вовлекается в процессинг цитокинов, дифференцировку миоцитов и нейробластов, пролиферацию Т-лимфоцитов, регенерацию кожи (Boehm D. et al., 2013; Khalil H. et al., 2014). Как и TNFa, каспаза 3 задействована при злокачественном росте. Так, активируясь в умирающих эндо-телиальных клетках, каспаза 3 через образование и секрецию PGE2 индуцирует пролиферацию клеток глиомы. Все описанные эффекты снимаются при е блокировании (Mao P. et al., 2013). В этом аспекте интересно исследовать динамику факторов «апоптоза» – веществ, играющих неоднозначную роль в организме, в ткани первичного опухолевого узла и метастазах печени на этапах их развития.
Целью данной главы явилось изучение динамики факторов апоптоза: TNFa, каспазы 3 и цитохрома С в селезенке, первичных опухолях и их парату-моральных зонах, печени, метастазах печени и их параметастатических зонах на этапах злокачественного процесса с метастатическим поражением печени.
У контрольных крыс в 15,4 раза уменьшалось спленальное содержание TNF (таблица 10.1).
Через одну неделю после введения клеток С45 в селезенку (МТС1), низкий контрольный спленальный уровень TNF сохранялся – он был в 13,3 раза ниже, чем у интактных крыс (таблица 10.1). В печени впервые возрастало количество TNF – в 2,6 раза по сравнению с контрольными значениями и содержание цито-хрома С, которое становилось в 3,6 раза больше, чем у контрольных и интактных животных (таблица 10.2).
На второй неделе, перед выходом первичного опухолевого узла (МТС2), в селезенке нарастало содержание TNF – в 2,7 раза по сравнению с контролем, однако оно оставалось в 5,8 раза ниже интактных значений; двукратно, относительно крыс из группы МТС1, уменьшалась концентрация каспазы 3 (таблица 10.1). В печени на фоне высокого, как и у крыс на предыдущем этапе исследований, уровня TNF количество цитохрома С уменьшалось в 8,0 раз по сравнению с группой МТС1 и становилось в 2,2 раза меньше контрольных показателей (таблица 10.2).