Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние проблемы индивидуализации лекарственной терапии злокачественных опухолей (обзор литературы) 18
1.1. Проблемы современной противоопухолевой терапии 18
1.2. Молекулярно-биологические маркеры, как прогностические факторы токсичности и эффективности противоопухолевого лечения 27
1.2.1.Молекулярно-биологические маркеры токсичности противоопухолевой терапии 28
1.2.2.Молекулярно-биологические маркеры эффективности противоопухолевой терапии 30
Статус гормональных рецепторов при раке молочной железы (РМЖ) 31
Рецептор эпидермального фактора роста (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) HER-2/neu 31
Мутации гена EGFR, как маркеры эффективности ингибиторов тирозинкиназ (гефитиниба, эрлотиниба) 34
Экспрессия C-kit, PDFGR-a, PDFGR-P, как маркеров эффективности ингибиторов тирозинкиназы С (иматиниба, сунитиниба) 38
K-RAS, как предиктивный маркер эффективности ингибиторов EGFR
(цетуксимаба, панитумумаба) 42
Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF) и ингибиторы ангиогенеза 43
Молекулярные маркеры эффективности фторпиримидинов 44
ERCC1, как маркер чувствительности опухоли к препаратам платины 47
В-Тубулин, как маркер эффективности таксанов 50 BRCAl, как маркер эффективности цитостатиков, повреждающих ДНК
(препаратов платины, антрациклиновых антибиотиков) 52
Топоизомераза 2-альфа (ТОР2А) - молекулярная мишень для антрациклиновых антибиотиков 53
Циклооксигеназа 2 (СОХ2), как маркер эффективности ингибиторов циклооксигеназы 55
Антиген mucl, как маркер эффективности моноклонального антитела (имутерана) 55
1.3. Фармакоэкономический анализ индивидуализации лекарственной терапии на основании молекулярных маркеров 56
1.4. Заключение 61
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 63
2.1. Исследуемая популяция больных по определению уровня экспрессии
генов DPD, TS, ТР, ERCC1, р-тубулина, СОХ2, muc-1, C-kit, VEGF, PDGFR a, PDGFR-p, BRCAl, TOP2A, мутации EGFR, k-ras, BRCAl, амплификации Her-2/neu, TOP2A в опухолевой ткани 63
2.1.1. Клиническая характеристика больных НМРЛ, обследованных на наличие мутации гена EGFR 65
2.1.2. Основная клиническая характеристика больных НМРЛ, включенных в исследование частоты экспрессии ERCC1 и ріП-тубулина и их предиктивной значимости 66
2.1.3. Характеристика больных диссеминированным раком желудка, включенных в анализ молекулярных маркеров (TS, ТР, DPD, ERCC1, BRCA, ТОР2) 70
2.1.4. Характеристика больных колоректальным раком, включенных в исследование предиктивной роли TS, ТР и DPD 72
2.2. Методы определения уровня экспрессии TS, ТР и DPD, Р-тубулина,
ERCC1, СОХ2, mucl, VEGF, EGFR, C-kit, PDFGR-a, PDFGR-P, BRCAl,
TOP2A, амплификации Her-2/neu, TOP2A, мутаций EGFR, BRCAl, k-ras в
опухолевой ткани больных с различными солидными опухолями 74 2.2.1.Методика проведения количественной ПЦР в реальном времени...75
Выделение РНК из архивных патоморфологических образцов 75
Проведение реакции обратной транскрипции 76
Выделение ДНК из парафиновых блоков 76
Изучение уровня экспрессии мРНК генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени 77
Определение наличия/отсутствия мутации EGFR и k-ras с помощью ПЦР 79
Исследование амплификации гена ТОР2А 80
Определение мутации 5382insC гена BRCA1 81
2.2.2. Обследование больных и оценка эффективности лечения 82
2.2.3. Анализ токсичности лечения 86
2.3. Фармакоэкономический анализ лечения гефитинибом и стандартной химиотерапией при НМРЛ 86
ГЛАВА 3. Оценка уровней экспрессии молекулярно генетических маркеров у больных различными солидными опухолями 90
3.1. Чувствительность к фторпиримидинам (уровни экспрессии DPD, ТР, TS) у больных различными солидными опухолями 90
3.2. Уровень экспрессии СОХ2, как маркера чувствительности к ингибиторам циклооксигеназы 97
3.3. Определение экспрессии mucl, как маркера чувствительности к
моноклональному антителу - имутерану 98
3.4. Уровень экспрессии ERCC1, как маркера чувствительности опухолей
различных локализаций к препаратам платины 100
3.5. Уровень экспрессии VEGF у больных различными солидными опухолями 101
3.6. Уровень экспрессии C-kit, PDGFR-a, PDGFR-p\ как маркеров чувствительности к ингибиторам тирозинкиназы 103
3.7. Уровень экспрессии b-тубулина III типа, как маркера чувствительности к препаратам таксанового ряда 106
3.8. Частота мутации гена EGFR, как маркера эффективности тирозинкиназных ингибиторов (гефитиниба и эрлотиниба) 107
3.9. Определение частоты амплификации Her-2/neu у больных опухолями различных локализаций 108
3.10. Частота мутации k-ras, как маркера резистентности к ингибиторам EGFR (цетуксимабу, панитумумабу) 109
3.11. Частота экспрессии молекулярно-генетических маркеров чувствительности к лекарственной терапии у больных опухолями различных локализаций 110
ГЛАВА 4. Молекулярно-генетические особенности немелкоклеточного рака легкого и их значение для определения эффективной лекарственной терапии 113
4.1. Частота мутаций в гене EGFR у больных НМРЛ 113
4.2. Эффективность гефитиниба у больных неоперабельным НМРЛ с наличием мутации в гене EGFR 115
4.3. Токсичность гефитиниба у больных НМРЛ с мутацией гена EGFR 120
4.4. Алгоритм обследования и лечения больных неоперабельным неплоскоклеточным НМРЛ
ГЛАВА 5. Предиктивное значение ercc1 и ВШ-тубулина у больных немелкоклеточным раком легкого 126
5.1. Исследование частоты экспрессии ERCC1 и рііі-тубулина в опухолевой ткани больных НМРЛ 126
5.2. Оценка влияния внутриопухолевой экспрессии ERCC1 и ріП-тубулина на эффективность химиотерапии у больных НМРЛ 127
ГЛАВА 6. Индивидуализация лекарственного лечения больных колоректальным раком препаратами фторпиримидинового ряда 136
6.1. Влияние молекулярно-биологических маркеров опухоли (TS, ТР, DPD)
на эффективность лекарственной терапии больных метастатическим
колоректальным раком 136
6.1.1. Тимидилат синтетаза (TS) 137
6.1.2. Тимидин фосфорилаза (ТР) 140
6.1.3. Дигидропиримидин дегидрогеназа (DPD) 142
6.1.4. Комбинации различных уровней экспрессии TS, ТР и DPD 145
ГЛАВА 7. Индивидуализация лекарственного лечения больных раком желудка на основе молекулярно генетических маркеров 155
7.1. Анализ экспрессии генов TS, DPD, ERCC1, BRCA1 и ТОР2А у больных диссеминированным раком желудка 155
7.2. Анализ частоты мутаций гена BRCA1 у больных диссеминированным раком желудка 158
7.3. Анализ влияния экспрессии маркеров TS, DPD, ERCC1, BRCA1 и ТОР2А на эффективность химиотерапии больных диссеминированным раком желудка 159
7.4. Анализ амплификации гена ТОР2А 167
7.5. Алгоритм выбора терапии первой линии больных диссеминированным раком желудка на основании анализа молекулярных маркеров 168
ГЛАВА 8. Фармакоэкономический анализ терапии гефитинибом больных немелкоклеточным раком легкого 172
Глава 9. Обсуждение полученных результатов 181
Выводы 209
Практические рекомендации 211
Список литературы
- Мутации гена EGFR, как маркеры эффективности ингибиторов тирозинкиназ (гефитиниба, эрлотиниба)
- Клиническая характеристика больных НМРЛ, обследованных на наличие мутации гена EGFR
- Уровень экспрессии СОХ2, как маркера чувствительности к ингибиторам циклооксигеназы
- Алгоритм обследования и лечения больных неоперабельным неплоскоклеточным НМРЛ
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Проблема лекарственного лечения злокачественных опухолей остается на сегодняшний день весьма значимой. Рост онкологической заболеваемости, большой удельный вес больных с распространенными формами опухолей ведут к увеличению количества пациентов, нуждающихся в лекарственной терапии. В 2009г. в Российской Федерации впервые выявлено 504 975 случаев злокачественных новообразований. Прирост данного показателя по сравнению с 2008 г. составил 2,9%. В 2009 г. 46,6% злокачественных новообразований были диагностированы в I-II стадии заболевания, 23,2% - III стадии, у 24,7% больных заболевание выявлено в IV стадии опухолевого процесса. Реальный показатель запущенности еще выше (29,5 %), так как следует учитывать больных с новообразованиями визуальных локализаций, диагностированных в III стадии (Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2010).
Последние десятилетия ознаменовались несомненным прогрессом в лекарственной терапии злокачественных новообразований. С появлением новых противоопухолевых препаратов расширился контингент больных, получающих специфическую терапию, улучшилось качество их жизни, а по некоторым нозологическим формам увеличилась ее продолжительность (Гершанович М.А., Пайкин М.Д., 1986; Мерабишвили В.М., 2006; Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009; Переводчикова Н.И., 2010; Lesko L., 2007). Несмотря на достигнутые успехи, результаты лечения в большинстве случаев остаются неудовлетворительными. К сожалению, современная противоопухолевая терапия имеет ряд существенных недостатков, основным из которых является стандартный эмпирический характер ее назначения, не учитывающий индивидуальные особенности организма и опухоли, что неизбежно сопровождается снижением ожидаемой эффективности, увеличением токсичности и нередко необоснованным использованием дорогостоящих лекарств (Imyanitov E. et al., 2007).
Важной особенностей солидных опухолей является биологическая неоднородность или гетерогенность (Копнин Б.П., 2002; Моисеенко В.М., 2004). Клиническое течение опухолевого заболевания различно даже в пределах однородной группы пациентов, под видом одного и того же морфологического типа опухоли скрывается несколько разновидностей заболевания, отличающихся по своему молекулярному патогенезу (Houlston R., 2001). «Молекулярный портрет» является уникальной характеристикой опухоли конкретного больного, по мере прогрессирования заболевания он меняется, появляются новые «мишени», что требует дифференцированного подхода в каждом конкретном случае. Таким образом, молекулярно-генетическая характеристика опухоли
становится необходимым компонентом при выборе оптимальной терапии наравне с морфологической верификацией и основными методами обследования. Очевидна целесообразность перехода к персонализированной медицине, подразумевающей назначение конкретного лекарственного препарата конкретному больному, исходя из фармакокинетических данных и генетических особенностей пациента, обусловливающих эффективность и токсичность применяемых противоопухолевых средств (Сычев Д.А. и др., 2010; Jain K., 2002; Nair S., 2010).
К сожалению, на сегодняшний день отсутствуют абсолютные признаки чувствительности и резистентности опухоли к лекарственным препаратам, без учета которых вероятность ошибки при выборе терапии для конкретного больного достаточна высока. В настоящее время известно несколько десятков диагностических и прогностических показателей, используемых в клинической практике, некоторые из них уже получили обязательный статус. Молекулярно-генетические маркеры, как прогностические факторы эффективности лечения (предиктивные маркеры), делятся на стандартные и экспериментальные. Исследование таких стандартных предиктивных маркеров, как рецепторы стероидных гормонов, HER-2/neu при раке молочной железы (РМЖ), CD20 - при злокачественной лимфоме, C-kit - при гастроинтестинальных стромальных опухолях (GIST), при выборе противоопухолевой терапии является обязательным. До недавнего времени определение мутации гена EGFR при выборе лечебной тактики при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) носило экспериментальный характер. В настоящее время назначение гефитиниба неоперабельным больным НМРЛ с мутацией EGFR признано стандартом, учитывая высокую эффективность препарата при данной локализации (Keedy V. et al., 2011).
К наиболее изученным экспериментальным молекулярным маркерам относятся: DPD (дигидропиримидин-дегидрогеназа); TP (тимидин-фосфорилаза); TS (тимидилат- синтетаза); ERCC1 (фермент репарации ДНК); Р-тубулин (субъединица димерного белка тубулина); СОХ2 (циклооксигеназа 2); VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста); PDGFRа и P (рецептор тромбоцитарного фактора роста альфа и бета); BRCA1 (breast cancer 1); TOP2A (топоизомераза 2-альфа) и др.
Данные, полученные в исследованиях по изучению уровня экспрессии экспериментальных предиктивных маркеров при различных солидных опухолях, зачастую противоречивы ввиду их немногочисленности, статистических погрешностей и небольшого количества наблюдений и свидетельствуют о важности продолжения исследований в этом направлении. Остаются неразрешенными вопросы о том, насколько широк спектр молекулярно-генетических маркеров при различных солидных опухолях и какова корреляция между их уровнем и эффективностью лечения, а также возможно ли создание алгоритма тактики и последовательности противоопухолевой терапии на основании результатов исследования.
Таким образом, вышеизложенные данные свидетельствуют об актуальности проблемы лекарственного лечения больных злокачественными новообразованиями и целесообразности поиска путей индивидуализации противоопухолевой терапии на основании молекулярных маркеров.
Еще одной из важнейших проблем при выборе противоопухолевой терапии является финансово-экономическая. Высокая стоимость большинства современных противоопухолевых препаратов становится препятствием для их назначения. Насколько приемлемым является уровень эффективности затрат - основной вопрос для фармакоэкономических исследований. Фармакоэкономический анализ, проведенный в рамках исследования INTEREST, подтверждает целесообразность применения гефитиниба в качестве второй линии лекарственной терапии при метастатическом НМРЛ (Horgan A. et al., 2011). К сожалению, отечественные фармакоэкономические исследования в клинической онкологии немногочисленны. Безусловно, актуальность исследований, свидетельствующих об экономической целесообразности индивидуализации лечения на основании молекулярно-генетического тестирования в нашей стране, не вызывает сомнений.
Цель исследования
Основной целью исследования является повышение эффективности лекарственного лечения путем его индивидуализации на основании молекулярных маркеров.
Задачи исследования
-
Определить уровень экспрессии генов DPD, TS, TP, ERCC1, в-тубулина, СОХ2, mucl, С kit, VEGF, PDGFR^ PDGFR в, BRCA1, TOP2A, мутации EGFR, BRCA1, k- ras, амплификации HER-2, TOP2A, как маркеров чувствительности к противоопухолевым препаратам при различных солидных опухолях.
-
Изучить корреляцию между уровнем молекулярных маркеров и эффективностью лечения противоопухолевыми препаратами при наиболее частых солидных опухолях: немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ), раке желудка (РЖ), колоректальном раке (КРР).
-
Разработать алгоритм индивидуализации лекарственного лечения у больных с изученными локализациями солидных опухолей на основе молекулярно- генетических маркеров.
-
Провести фармакоэкономический анализ индивидуализации лекарственной терапии на основании молекулярных маркеров и стандартной химиотерапии при НМРЛ.
Научная новизна работы
Впервые на большом клиническом материале (1582 пациента) изучены возможности использования молекулярных маркеров с предиктивной целью при выборе лекарственной терапии метастатических солидных опухолей:
-
НМРЛ (экспрессия Р-тубулина при назначении таксанов и платиносодержащих препаратов, мутации EGFR при применении тирозинкиназных ингибиторов EGFR);
-
РЖ (экспрессия BRCA1, TOP2A при назначении платиносодержащих препаратов и антрациклиновых антибиотиков; мутации BRCA1 при применении препаратов платины);
-
КРР (экспрессия DPD, TS, TP при назначении фторпиримидинов).
Впервые на значительном клиническом материале показано, что индивидуализация лекарственного лечения на основе молекулярно-генетических маркеров обеспечивает увеличение ожидаемой ее эффективности в 2-7 раз по сравнению с традиционным эмпирическим подходом.
Проведенный фармакоэкономический анализ впервые доказал экономическую целесообразность индивидуализации лечения злокачественных опухолей на основе молекулярно-генетических маркеров.
Впервые проведен анализ частоты носительства мутации BRCA1 среди больных раком желудка.
Установлены новые высокоинформативные предиктивные маркеры: мутации в гене BRCA1 5382insC и экспрессия BRCA1 у больных РЖ, прогнозирующие высокую чувствительность к препаратам платины.
Практическая значимость работы
Доказано, что индивидуализация противоопухолевого лечения на основе молекулярно-генетических маркеров является реальной альтернативой стандартному эмпирическому подходу к выбору лекарственной терапии и обеспечивает увеличение ожидаемой эффективности в 2-7 раз.
Доказана экономическая целесообразность молекулярно-генетического тестирования для выбора лекарственной терапии злокачественных солидных опухолей.
Впервые разработаны алгоритмы для определения тактики и последовательности лекарственной терапии для НМРЛ, РЖ.
Доказано возможное использование молекулярных маркеров, как факторов чувствительности к лекарственной терапии, у больных с диссеминированными формами солидных опухолей: НМРЛ (экспрессия Р-тубулина, ERCC1, мутации EGFR); РЖ (экспрессия BRCA1, TOP2A; мутации BRCA1); КРР (экспрессия DPD, TS, TP).
Положения, выносимые на защиту
-
-
Индивидуализация лекарственного лечения на основе молекулярных маркеров является высокоинформативным подходом, который повышает ожидаемую эффективность лекарственного лечения по сравнению со стандартным эмпирическим.
-
Все солидные опухоли, независимо от первичной локализации, характеризуются крайней гетерогенностью с точки зрения экспрессии предиктивных молекулярно- генетических маркеров.
-
Индивидуализация лечения больных НМРЛ, РЖ, КРР на основе определения молекулярно-генетических маркеров (экспрессии генов Р-тубулина, ERCC1, BRCA1, TOP2A, DPD, TS, TP, мутации генов EGFR, BRCA1 5382insC) позволяет оптимизировать выбор терапии и получить максимальный лечебный эффект.
-
Индивидуализация лечения больных НМРЛ на основании молекулярно-генетического тестирования экономически обоснована (величина коэффициента эффективности затрат при назначении гефитиниба больным НМРЛ с мутацией EGFR характеризуется приемлемым уровнем эффективности затрат; назначение гефитиниба всем больным НМРЛ без учета определения мутации EGFR является крайне затратным и неприемлемым с экономической точки зрения).
Апробация работы
Основные результаты диссертации обсуждались 06.03.2012 г. на научной конференции ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздравсоцразвития России совместно с кафедрой онкологии с курсом клинической радиологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, кафедрой онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии, Лечебно-диагностическим центром МИБС им. С.М. Березина.
Результаты работы были представлены на Отечественной школе онкологов (Санкт-
Петербург, 2007, 2010.), Научно-практической конференции онкологов «Лекарственное
лечение злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта» (Санкт-Петербург, 2009), Научном обществе онкологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области (2011, 2012), VII съезде онкологов России (Москва, 2009), XII, ХІУ Всероссийских онкологических конгрессах (Москва, 2008, 2010), VI международном конгрессе «Рациональная фармакотерапия - 2011» (Санкт-Петербург, 2011).
По теме диссертации опубликовано 65 печатных работ, в том числе 54 - в отечественной и 11 - в зарубежной печати, включая 25 работ в журналах, реферируемых ВАК.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты работы внедрены и используются в практической и научно- исследовательской работе ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова» Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербургском городском клиническом онкологическом диспансере, Ленинградском областном онкологическом диспансере, Санкт-Петербургском клиническом научно-практическом центре специализированных видов медицинской помощи (онкологической), Лечебно-диагностическом центре МИБС им. С.М. Березина, учебном процессе на кафедре онкологии с курсом клинической радиологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, кафедре онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии Санкт- Петербургской государственной педиатрической медицинской академии.
Структура и объем диссертации
Мутации гена EGFR, как маркеры эффективности ингибиторов тирозинкиназ (гефитиниба, эрлотиниба)
Молекулярно-биологические маркеры, как прогностические факторы эффективности противоопухолевой терапии (или предиктивные маркеры) следует разделить на стандартные и экспериментальные.
К стандартным относятся широко применяемые в клинической практике и получившие обязательный статус при выборе лекарственной терапии, такие молекулярно-биологические маркеры, как: рецепторы стероидных гормонов (эстрогенов и прогестеронов), рецепторы эпидермального фактора роста HER-2/neu, CD20, C-kit, мутации K-ras, EGFR и др. Экспериментальные маркеры эффективности противоопухолевой терапии не используются в клинике, как стандарт, изучение их, как предиктивных факторов, продолжается. Наиболее изученными на сегодняшний день являются следующие: экспрессия ERCC1, DPD, TS, ТР, b-тубулина, микросателитная нестабильность, мутации BRCA, ALK, BRAF и др. [ImyanitovE. et al. 2007].
Статус гормональных рецепторов при раке молочной железы (РМЖ). Как и для многих таргетных препаратов назначение гормонотерапии при РМЖ допустимо только при наличии мишени в опухолевой ткани: эстрогеновых (ER) и прогестероновых рецепторов (PR). Наибольшая эффективность антиэстрогеновой терапии наблюдается, если опухоль экспрессирует и ER и PR [Di Leo A. et al., 2002]. Однако известно, что до 15% ER-позитивных опухолей молочной железы не отвечают на лечение тамоксифеном, а, наоборот, при приеме препарата отмечается бурный рост опухоли. Благодаря достижениям современной фармакогенетики доказано, что помимо статуса мишени как таковой, ответ на лечение препаратами может опосредоваться другими молекулярными характеристиками опухоли. Так, гиперэкспрессия онкогена HER-2 ассоциирована с пониженным эффектом антиэстрогеновой терапии даже в случае ER(+)PR(+) РМЖ [De Laurentiis М. et al., 2005].
Исследование К. Jirstrom и соавт. (2005) доказало, что прогрессирование заболевания на фоне гормонотерапии тамоксифеном строго коррелирует с присутствием амплификации онкогена cyclin D1. Больные с увеличенной копийностью гена cyclin D1 должны либо получать в качестве гормональной терапии антиэстрогеновые препараты альтернативного механизма действия (например, ингибиторы ароматазы), либо вовсе воздерживаться от применения антагонистов эстрогенового сигнального каскада [Jirstrom К. et al., 2005].
Рецептор эпидермального фактора роста (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) HER-2/neu играет ключевую роль в процессах клеточного деления, апоптоза, метастазировании, ангиогенеза. EGFR присутствует в нормальных или избыточных количествах на поверхности опухолевых клеток при РМЖ, НМРЛ, КРР, плоскоклеточном раке головы и шеи, раке желудка, пищевода и др. Гиперэкспрессия/амплификация HER-2/neu обнаруживается у 20-30% больных РМЖ и является признаком высоко агрессивного течения и плохого прогноза, а также резистентности к лекарственной (химиотерапии, гормонотерапии) и лучевой терапии [Моисеенко В.М., 2002; Тюляндин С.А., 2002; Ross J. et al., 2003]. На сегодняшний день определение уровня экспрессии HER-2/neu при РМЖ является стандартом [Ross J. et al., 2003].
Трастузумаб (герцептин) - гуманизированное моноклональное антитело против белковых трансмембранных рецепторов факторов роста HER-2/neu или с-егЬВ2. Целесообразность назначения трастузумаба определяется на основании повышенной экспрессии рецепторов HER-2/neu на поверхности опухолевой клетки или амплификации гена. Обладая небольшой самостоятельной противоопухолевой активностью, трастузумаб показал способность увеличивать выживаемость больных метастатическим раком молочной железы с гиперэкспрессией HER-2/neu. Одно из первых проведенных рандомизированных исследований с включением 469 больных метастатическим РМЖ с гиперэкспрессией HER-2/neu показало, что добавление трастузумаба повышает эффективность химиотерапии. Общий ответ на лечение составил 49% против 32% (р=0,0002), медиана времени до прогрессирования увеличилась с 4,6 месяцев до 7,6 месяцев (р=0,0001) и медиана общей выживаемости с 20,3 месяцев до 25,4 месяцев (р 0,025) [Eiermann W. et al., 2001]. В настоящее время комбинация паклитаксел + трастузумаб рекомендована FDA (Food and Drug Administration) в качестве химиотерапии I линии метастатического РМЖ с гиперэкспрессией HER-2/neu [Imyanitov Е. et al., 2007]. Проведенные экспериментальные и клинические исследования показали, что Her-2-статус (гиперэкспрессия или амплификация) является главным предиктивным фактором эффективности лечения трастузумабом [Jackisch С. et al., 2006; Limentani S. et al., 2007; Wardiey A. et al., 2010; Perez E. etal., 2012].
Клиническая характеристика больных НМРЛ, обследованных на наличие мутации гена EGFR
Определение уровней экспрессии ферментов TS, ТР и DPD в опухолевой ткани, анализ их корреляции с эффективностью лекарственной терапии на основании фторпиримидинов были изучены в группе 44 больных КРР в стадии Dukes B-D, находящихся под наблюдением и на лечении в ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздравсоцразвития России.
Все больные имели гистологическую верификацию диагноза. В работе использовался архивный гистологический материал (парафиновые блоки опухоли пациентов). Основные характеристики пациентов представлены в таблице 6. Средний возраст больных составил 55,5 лет (от 29 до 75 лет). Пациентов мужского пола было 21, женского - 23. Общее состояние больных оценивалось по шкале ECOG и не превышало 2-х баллов. Распределение пациентов в зависимости от распространенности опухолевого процесса представлено следующим соотношением: Dukes В : Dukes С : Dukes D= 14: 12: 18 больных. Частота локализации опухоли в сигмовидной кишке составила 45,5%, в поперечно-ободочной кишке - 29,5%, в прямой кишке - 25%.
Морфологический тип КРР представлен в основном аденокарциномой 93,2%), муцинозные опухоли наблюдались в 6,8% случаев. По степени дифференцировки большинство опухолей относились к умереннодифференцрованным (77,3%), и только в единичных случаях наблюдалась низкая (13,6%) и еще реже высокая (2,3%) степень дифференцировки. Хирургическое лечение на первом этапе проведено 41 больному. До операции никто из больных не получал специфическую терапию. Таблица 6 - Клинико-морфологическая характеристика больных КРР, включенных в исследование предиктивной значимости TS, ТР и DPD Характеристика Число больных/ % (п=44) Возраст (лет): средний Диапазон 55,3 29-75 Пол: мужской Женский 21 (47,7%) 23 (52,3%) ECOG 012 11(25,0%)25 (56,8%)8(18,2%) Локализация первичной опухоли ободочная кишка сигмовидная кишка прямая кишка 13 (29,5%)20 (45,5%)11 (25%) Распространенность опухолевого процесса Dukes В Dukes С Dukes D 14(31,8%) 12 (27,3%) 18(40,9%) Гистологический тип опухоли аденокарцинома аденокарцинома со слизеобразованием 41 (93,2%) 3 (6,8%) Степень дифференцировки первичной опухоли низкая умеренная высокая не определена 6 (13,6%)34 (77,3%)1 (2,3%)3 (6,8%) Объем хирургического вмешательства не проводилось радикальная операция паллиативная/симптоматическая операция 3 (6,8%) 26(59,1%) 15(34,1%) Адъювантная химиотерапия 14(31,8%) Частота локорегионарных рецидивов 11(25%) Распространенность опухолевого процесса поражение одного органа полиорганное поражение 15 26 Зоны метастазирования: только печень печень + легкие печень + другие органы только легкие другие органы 1111 5 4 6
Системная противоопухолевая терапияI линия химиотерапии, в том числе:- 5-ФУ и его производные в монорежиме- комбинации с фторпиримидинами- другие цитостатикиII линия химиотерапииIII линия химиотерапии 35 (79,5%) 17 (48,6%)14 (40%) 4(11,4%)22 (50%) 7(15,9%) Адъювантную химиотерапию с использованием 5-ФУ или его производных получали 14 больных. Паллиативная химиотерапия проводилась 35 больным: 18 ранее радикально леченным больных и 17 пациентам с изначально генерализованной формой заболевания.
Метастатическое поражение носило преимущественно полиорганный характер, локализация очагов чаще отмечалась в печени и легких, у четверти больных наблюдалось появление локорегионарных рецидивов.
В плане комплексного лечения 35 пациентам с диссеминированной формой КРР проведено 278 циклов химиотерапии, среднее количество циклов составило 7,9 (диапазон от 1 до 12). Первую линию химиотерапии получили все 35 больных, вторую - 22, третью - только 7 человек.
Методы определения уровня экспрессии TS, ТР и DPD, р-тубулина, ERCC1, СОХ2, mucl, VEGF, EGFR, C-kit, PDFGR-a, PDFGR-p, BRCA1, TOP2A, амплификации Her-2/neu, TOP2A, мутаций EGFR, BRCA1, k-ras в опухолевой ткани больных с различными солидными опухолями Определение уровня экспрессии молекулярных маркеров чувствительности к лекарственной терапии в опухолевой ткани проводилось с помощью обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Для молекулярно-генетического анализа использованы парафиновые блоки, полученные из первичной опухоли или ее метастазов. Использование ПЦР в реальном времени обеспечивает наиболее точную оценку концентрации мРНК изучаемых ферментов в небольшом объеме ткани. Основным требованием к исследуемому материалу являлось наличие в образце более 80% опухолевых клеток. Для этого применялся определенный метод обработки срезов с парафиновых блоков путем микродиссекции с последующим проведением количественной ПЦР, что позволило определять уровень экспрессии генов с высокой точностью. Подобный анализ признан наиболее точным, доступным по стоимости и проводится в большинстве современных лабораторий.
Выделение РНК из архивных патоморфологических образцов Выделение РНК из архивных патоморфологических блоков производилось по модифицированному методу К. Specht et al. (2001). Гистологические срезы с целью получения участка опухоли и во избежание контаминации нормальной ткани подвергались микродиссекции. Полученные таким способом срезы толщиной 10-15 мкм депарафинизировались с помощью двухкратной обработки ксилолом при комнатной температуре. Затем фрагменты ткани регидратировались с помощью последовательной промывки в 96%, затем в 85% и 75% растворах этанола - по 10 минут в каждом. После тщательного удаления этанола в пробирку добавляли 180 мкл лизирующего буфера: IxTE (Юммоль Tris-HCl (рН=8,0), 0,1 ммоль ЭДТА; рН=8,0), 2% натрия додецилсульфат и 20 мкл протеиназы К (20 мг/мл). Пробирки подвергались инкубированию при t=60C в течение 16 часов до полного растворения ткани.
К полученным лизатам добавляли однократный объем кислого сатурированного фенола и 0,3 объема хлороформа. После интенсивного встряхивания пробирки в течение 10 минут при комнатной температуре пробы подвергались центрифугированию при 15000 g в течение 15 минут при температуре ротора 0-2С (Centrifuge 5415 R, Eppendorf).
После центрифугирования осторожно отбирали суперфазу в новые эппендорфы и добавляли 0,3 объема хлороформа с последующим интенсивным перемешиванием и центрифугированием аналогично описанному выше.
К осторожно отобранной верхней фазе прибавляли 0,1 объема ЗМ ацетата натрия (рН=4,0), 1 мкл раствора гликогена (20мг/мл) в качестве коосадителя и 1 объем охлажденного до -20С изопропанола. После перемешивания растворов пробы оставлялись не менее чем на 3 часа при-20С. Преципитат РНК осаждали центрифугированием пробы при 15000 g в течение 30 минут при температуре ротора 0-2С. После центрифугирования на дне пробирок образуется небольшое количество белого осадка. После удаления изопропанола промывали осадок в 500 мкл 70% этанола в течение 10 минут при комнатной температуре, слегка встряхивая пробирку. Тщательно удаляли этанол. После подсушивания в термостате при 40С осадок растворяли в 25 мкл стерильной воды при 65 С в течение 10 минут. Раствор РНК хранили при - 20С до использования для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в реакции обратной транскрипции, но не более 2-х суток.
Уровень экспрессии СОХ2, как маркера чувствительности к ингибиторам циклооксигеназы
На основании полученных данных о низкой экспрессии DPD (70,6%) и TS (54,6%) у пациентов КРР, можно ожидать высокую эффективность фторпиримидинов. Это подтверждается клиническими данными: фторпиримидины входят в стандарт лечения больных с опухолями желудочно-кишечного тракта [Корман Д.Б., 2006]. Комбинация низких уровней DPD и TS при РЖ наблюдалась в 42,5% случаев. У больных ПРГШ, низкий уровень DPD составил 42,9%, TS 35,7%, а комбинация была отмечена в 14,3% случаев. Около трети больных МК (39,5%) имели низкий уровень экспрессии DPD и TS, что косвенно могло бы говорить о чувствительности опухоли к фторпиримидинам. Для больных РМЖ отмечалось преобладание низкого уровня DPD (73,3%) и TS (51,1%), а комбинация низких уровней данных маркеров была выявлена в 31,1% случаев. Препараты фторпиримидинового ряда достаточно широко используются для лечения больных РМЖ.
Терапия РП не предусматривает использование цитостатиков ввиду их неэффективности, однако в нашем исследовании у 41,9% пациентов отмечена низкая экспрессия DPD и TS. У половины больных РЯ (50,0%) выявлена низкая экспрессия DPD и TS.
Итак, анализ маркеров чувствительности к фторпиримидинам, с одной стороны, показал, что популяция больных представляется с этой точки зрения крайне гетерогенной, а с другой, существующие стандартные подходы к выбору терапии на основании имеющегося перечня препаратов при определенных опухолях могут быть не всегда эффективны. Из представленных данных следует, что опухоли легкого и меланомы кожи, вероятно, могут проявлять чувствительность к препаратам фторпиримидинового ряда. Между тем в клинике они практически не используются.
3.2. Уровень экспрессии СОХ2, как маркера чувствительности к ингибиторам циклооксигеназы
В нашем исследовании проведен анализ уровня экспрессии СОХ2, как маркера чувствительности к ингибиторам циклооксигеназы, у 415 больных с различными солидными опухолями (таб. 13).
Статистически значимые различия получены между уровнем экспрессии маркера у больных НМРЛ и КРР, у которых отмечалось преобладание высокого уровня экспрессии СОХ2 (34,8% и 32,1% соответственно) по сравнению с пациентами РМЖ (15,4%; р=0,035 и р=0,032), РП (11,1%; р=0,021 и р=0,020), МК (8,9%; р=0,002 и р=0,001) и СМТ (8,1%; р=0,005 и р=0,004).
Кроме больных НМРЛ и КРР, высокий уровень экспрессии маркера СОХ2 выявлен у больных РЖ (37,0%) и ПРГШ (33,3%).
Полученные нами данные свидетельствуют, что уровень распределения СОХ2 у пациентов с солидными опухолями носит гетерогенный характер.
У более трети больных НМРЛ (34,8%) отмечена высокая экспрессия СОХ2, что свидетельствует о целесообразности использования ингибиторов СОХ2 (целекоксиба, рофекоксиба) в лечении данной патологии, что подтверждено результатами проведенных в мире исследования [Saha D. et. al., 2003; Harris R., 2008; Kaur B. et al., 2002].
У 32,1% больных КРР в нашем исследовании отмечается высокая экспрессия СОХ2, что может свидетельствовать о возможно незаслуженном исключении ингибиторов СОХ2 из списка эффективных.
Высокий уровень исследуемого маркера отмечен также в 11,1% случаев при РП, что, вероятно, позволяет рассматривать возможность использования ингибиторов СОХ2 для лечения данной категории больных.
Определение экспрессии mucl, как маркера чувствительности к моноклональному антителу - имутерану
Нами проведено определение экспрессии mucl, как маркера чувствительности к моноклональным антимуциноподобным антителам (имутерану) у 170 больных различными солидными опухолями. Результаты данного исследования представлены в таблице 14.
Из представленных данных следует, что большинство больных имели низкий уровень экспрессии mucl, за исключением больных РЯ, у которых преобладал высокий уровень маркера (50,0%).
У пациентов с НМРЛ высокая экспрессия встречалась в 41,7% случаев, КРРв31,5%. Статистически значимой зависимости между различными нозологиями уровнем экспрессии mucl не выявлено. Нами установлено, что наиболее часто высокий уровень экспрессии отмечен для больных РЯ (50,0%) и НМРЛ (41,7%), что может свидетельствовать об эффективности имутерана у больных с данной локализацией опухолевого процесса [Иванов П.К и соавт., 2006; Манзюк Л.В. и соавт., 2008]. 3.4. Уровень экспрессии ERCC1, как маркера чувствительности опухолей различных локализаций к препаратам платины В нашем исследовании проведен анализ уровня экспрессии ERCC1, как маркера чувствительности солидных опухолей различных локализаций к препаратам платины у 571 больного. Результатом проведенного анализа стали выявленные статистически значимые отличия между уровнем экспрессии ERCC1 в различных опухолях (таб. 15). Таблица 15 - Уровень экспрессии ERCC1 у больных различными солидными опухолями
Алгоритм обследования и лечения больных неоперабельным неплоскоклеточным НМРЛ
Побочные явления той или иной степени наблюдались у всех больных, получавших лечение в рамках исследования (100%). Летальных исходов токсичности лечения не было. Максимальная, 3 степень токсичности отмечена у 5 из 25 пациентов (20%). Лечение гефитинибом отличалось хорошей переносимостью, наиболее часто сопровождалось осложнениями 1 и 2 степени (48% и 36% соответственно).
Наиболее частым побочным эффектом в нашем исследовании была кожная токсичность в виде угревидной сыпи: у 19 из 25 больных (76% ). Степень выраженности ее была от легкой до умеренной. У большинства больных: 16 из 25 (64%) кожная сыпь проявлялась в 1-2 степени и не требовала медикаментозной коррекции. Более тяжелые степени токсичности, потребовавшие лекарственного лечения, наблюдались у 3 больных (12%). Согласно рекомендациям по лечению кожной токсичности для тирозин-киназных препаратов больным проводилось лечение антибактериальными препаратами (тетрациклин - системно и местно, глюкокортикоидные препараты - локально), при наличии зуда - системные антигистаминные препараты.
Вторым наиболее частым осложнением являлась диарея, частота его составила - 56%. Степень проявления этого побочного эффекта носила умеренный характер (1 и 2 степени) и наблюдалась у 13 из 25 больных (52%). С целью коррекции диареи применялись стандартные противодиарейные препараты (лоперамид, диосмектит). Лишь у 1 больной отмечена 3 степень диареи, что потребовало перерыва в лечении. Изменение ногтей 1-2 степени наблюдалось у 6 из 25 больных (24%), не требовало специального лечения и прерывания лечения гефитинибом. У 1 больной отмечена гепатотоксичность в виде повышения уровня аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы 3 степени. После прекращения приема гефитиниба, наступала нормализация печеночных показателей без дополнительной терапии в течение 7-10 дней. Описанные в других аналогичных исследованиях жизнеугрожающие осложнения в виде пульмонитов, требующие интенсивной терапии, ни у одного из наблюдаемых нами больных не отмечены.
Итак, терапия гефитинибом отмечена удовлетворительной переносимостью. Степень побочных эффектов в большинстве случаев легкая или умеренная. Осложнений, угрожающих жизни больных не отмечено.
На основании полученных в результате исследования данных следует, что гефитиниб, пероральный ингибитор EGFR, показал значительную эффективность и умеренную токсичность у больных НМРЛ с наличием мутации гена EGFR в первой линии лекарственного лечения. Следует отметить, что данное исследование является первым, проведенным в странах восточной Европы.
Выявленная в нашем исследовании частота изменений гена EGFR составила 19,8% (38/192), что позволяет говорить о сходстве в частоте возникновения больше с белым населением Европы и Северной Америки, чем с больными азиатского происхождения. Наблюдаемая в нашем исследовании частота объективных ответов оказалась несколько ниже, чем в аналогичных западных исследованиях: 48% против 55%-80%. Однако, частота клинического эффекта, включившего в себя также и стабилизацию заболевания, и составившая 100%, сопоставима с результатами других западных, а также азиатских авторов [Sandler A.et al., 2006, Kosmidis P. et al., 2008, Mok T. et al., 2010; Rosell R. et al., 2011]. Значение полученных результатов сложно переоценить, так как частота объективных ответов при применении цитостатиков не превышает 39% [Bunn Р.А., 2008].
Важнейшей особенностью эффективности гефитиниба является быстрое симптоматическое улучшение состояния большинства больных, частота которого в нашей работе составила 76%. Учитывая агрессивность течения НМРЛ, стремление улучшить качество жизни больных, данное исследование подтверждает необходимость изменения стандартов лечения и внедрение использования ингибиторов тирозинкиназ в первой линии у больных с высокой ожидаемой эффективностью терапии.
В нашем исследовании мы подтвердили, показанное ранее для европейской популяции больных, значительное увеличение времени до прогрессирования опухоли на фоне лечения гефитинибом относительно химиотерапии: 7,9 месяцев против 5,0 - 5,7месяцев [Robert F. et al., 2001]. Аналогичные результаты по преимуществу времени до прогрессирования в группе больных, получавших лечение гефитинибом, продемонстрированы в рандомизированном исследовании III фазы IPASS: 9,5 месяцев против 6.3 месяцев в группе химиотерапии [Yang С. et al., 2010].
Медиана общей выживаемости в нашем исследовании составила 14,0 месяцев против 7-8 месяцев на фоне стандартной химиотерапии, согласно литературным данным. В исследовании IPASS отмечено о более благоприятном течении заболевания у носителей мутации EGFR. Медиана общей выживаемости больных с мутацией EGFR в независимости от проводимой терапии (гефитиниб или химиотерапия карбоплатином с паклитакселом) составляет около 21 месяца против 12 месяцев в группе пациентов с негативным EGFR- статусом [Yang С, 2010].
К сожалению, на сегодняшний день опубликованные результаты немногочисленных исследований по эффективности ингибиторов тирозинкиназных ингибиторов, применяемых в первой линии лечения, касаются, как правило, больных НМРЛ азиатской популяции. Возможно, данные для лиц европейской расы будут различные. Безусловно, полученные нами результаты представляют явный интерес.
Спектр токсичности при терапии гефитинибом в значительной степени отличается от такового при использовании цитостатиков. Основными видами побочных эффектов гефитиниба были кожная сыпь и диарея, в большинстве случаев легкой или умеренной степени, не требующие дорогостоящего лечения или госпитализации. Эти данные свидетельствуют о явном преимуществе гефитиниба по сравнению с химиотерапией.
Полученные нами данные о высокой эффективности гефитиниба в сочетании с удовлетворительной переносимостью, а также длительное время до прогрессирования опухоли и общей выживаемости на фоне лечения исследуемым препаратом у больных НМРЛ с наличием мутации в гене EGFR, свидетельствуют о перспективности данного направления.
Исследование опухолевого материала на наличие мутации гена EGFR должно быть стандартом в алгоритме обследования больных и выборе лекарственного лечения.
Выявленная достаточно высокая частота мутаций гена EGFR у больных неплоскоклеточным раком легкого позволяет за счет использования низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназных рецепторов, отказаться от проведения высокотоксичной химиотерапии в первой линии, продлить жизнь и время до прогрессирования опухоли, улучшить качество жизни.
Похожие диссертации на Принципы индивидуализации лекарственной терапии злокачественных опухолей
-
![Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия опухолей органа зрения с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда [Электронный ресурс]](/i/i/4602/185091.png "Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия опухолей органа зрения с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда [Электронный ресурс] Крупнов Роман Николаевич")