Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Морфологическая характеристика плоскоклеточного рака гортани 12
1.2 Механизмы инвазивного роста плоскоклеточного рака 14
1.3 Закономерности и особенности лимфогенного и гематогенного метастазирования плоскоклеточного рака гортани 19
1.4 Характеристика ММП и их ингибиторов. Роль в инвазивном росте и лимфогенном метастазировании 21
1.5 Опухолевые клетки как источник ММП 27
1.6 Клетки стромы как источник ММП 29
1.7 Современные методы лечения больных раком гортани 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
Глава 3. Результаты собственных исследований 47
3.1 Гетерогенность экспрессии металлопротеиназ в опухолевых структурах плоскоклеточного рака гортани 47
3.1.1 Характеристика экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов в опухолевых элементах разных типов структур рака гортани
у пациентов без и после предоперационного лечения 47
3.1.2 Экспрессия металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147 в разных структурах новообразования при раке гортани в зависимости от степени дифференцировки опухоли в группе без и после предоперационного лечения 48
3.1.3 Характер экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147 в стромальных элементах опухоли у пациентов без и после предоперационного лечения 49
3.1.4 Характер экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов в стромальных элементах в зависимости от степени дифференцировки плоскоклеточного рака гортани у пациентов без- и после предоперационного лечения
3.1.5 Выраженность экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов в зависимости от сочетания структур разной степени дифференцировки при раке гортани в группе больных без предоперационного лечения 51
3.1.6 Выраженность экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов в клетках воспалительного инфильтрата стромы новообразования с учетом сочетания структур разной степени дифференцировки при раке гортани в группе больных без предоперационного лечения 52
3.1.7 Взаимосвязь плотности сосудистого русла с экспрессией металлопротеиназ, их ингибиторов, а также CD147 при плоскоклеточном раке гортани разной степени дифференцировки 52
3.1.8 Взаимосвязь между экспрессией металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147 в паренхиматозных элементах опухоли и в клетках воспалительного инфильтрата стромы у больных раком гортани, не получавших предоперационной терапии 56
3.1.9 Экспрессия металлопротеиназ в зависимости от распространенности плоскоклеточного рака гортани 59
3.1.9.1 Связь экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза протеиназы CD 147 в опухолевых элементах разных структур с распространенностью опухоли (Т)
у пациентов без и после предоперационного лечения 59
3.1.9.2. Связь экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза протеиназ CD 147 в стромальных элементах с распространенностью опухоли (Т) у пациентов без предоперационного лечения 59
3.1.9.3 Зависимость степени распространенности плоскоклеточного рака гортани (Т) от сочетания высоко и низкодифференцированных структур в первичной опухоли у больных без предоперационного лечения 60
3.1.9.4 Плотность сосудов в строме и распространенность плоскоклеточного рака гортани (Т) у пациентов без и после
предоперационного лечения
3.2 Экспрессия металлопротеиназ и лимфогенное метастазирование 63
3.2.1 Плотность сосудов в строме плоскоклеточного рака гортани и лимфогенное метастазирование 63
3.2.2 Характер экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза металлопротеиназ CD 147 в опухолевых элементах разных структур в зависимости от развития лимфогенных метастазов у пациентов без и после предоперационной терапии 64
3.2.3 Характер экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза металлопротеиназ CD 147 в стромальных элементах в зависимости от развития лимфогенных метастазов
у пациентов без и после предоперационной терапии 65
3.2.4 Взаимосвязь локализации опухоли и уровня ее дифференцировки с лимфогенным метастазированием 66
3.2.5 Зависимость экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147 в клеточных элементах разных опухолевых структур плоскоклеточного рака в опухолях с сочетанием высоко- и низкодифференцированных структур от локализации опухоли и развития лимфогенных метастазов у пациентов без предоперационного лечения 69
3.2.6 Зависимость экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147 в стромальных элементах плоскоклеточного рака в опухолях с сочетанием высоко и низкодифференцированных структур от локализации опухоли и развития лимфогенных метастазов у пациентов без предоперационного лечения 70
Заключение 71
Выводы 84
Практические рекомендации 87
Список сокращений 88
Список литературы
- Закономерности и особенности лимфогенного и гематогенного метастазирования плоскоклеточного рака гортани
- Современные методы лечения больных раком гортани
- Экспрессия металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147 в разных структурах новообразования при раке гортани в зависимости от степени дифференцировки опухоли в группе без и после предоперационного лечения
- Взаимосвязь локализации опухоли и уровня ее дифференцировки с лимфогенным метастазированием
Введение к работе
Актуальность проблемы
Доля рака гортани среди опухолей верхних дыхательных путей равна 65-70% (Писарева Л.Ф., 2003, Решетов И.В. с соавт., 2005, Жуйкова Л.Д., 2011, Джафаров К.Г. с соавт., 2014, Allam Е., 2011). Удельный вес этой патологии в структуре онкологической заболеваемости составляет 2 % в мужской популяции и 0,3 % в женской. Чаще раком гортани страдают мужчины в работоспособном возрасте. Среди впервые выявленных больных раком гортани I—II стадия регистрируется в 33,7 % случаев, III стадия - в 48,4 % и IV стадия - у 17,9 % больных. Локализация опухолевого процесса в пределах гортани имеет свои особенности. Наиболее часто (56,1 %) при раке гортани поражается надскладочный отдел, складочный отдел - в 41,4 % и в 2,5 % случаев - подскладочный (Пачес А.И., 2000). Поиск новых прогностических маркеров, определяющих характер и темп опухолевой прогрессии, включая вероятность метастазирования, является одной из важных задач современной онкологии (Чиссов В.И. с соавт., 2000, Ольшанский В.О., 2001, Чойнзонов Е.Л. с соавт., 2013, Bajracharya D. et al, 2014).
При инвазивном росте опухоли и её метастазировании ключевую роль играет взаимодействие клеток опухоли и стромы (David Н. 2005, Condeelis J. et al, 2006, Del Casar J.M. 2009, Escaff S. et al, 2011, Fan H.X., 2012). Опухолевые клетки продуцируют ферменты - металлозависимые протеиназы, которые разрушают экстрацеллюлярный матрикс, базальные мембраны, стенки кровеносных и лимфатических сосудов. Регуляция экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММП) происходит на трех уровнях: при изменении экспрессии гена, путем активации латентных зимогенов или при ингибиции тканевыми ингибиторами (Соловьева Н.И., 2000). В нормальных условиях ММП содержатся в тканях в незначительных количествах в везикулах размером 300-600 нм, которые локализованы вблизи плазматической мембраны клетки. В норме миграция везикул из клетки происходит в ответ на специфические ангиогенные стимулы и лишь на определенном участке клеточной мембраны, а в клетках опухоли непрерывно и по всей поверхности клетки (Соловьева Н.И., 2000, 2004, Снарская Е.С., 2005). Металлопротеи-назы способны индуцировать ангиогенез путем расщепления экстрацеллюлярного матрикса (Соловьева Н.И., 2000, Danilewicz М., 2003). Тканевые ингибиторы ММП играют роль регуляторов активности ММП (Christopoulos Т.А., 2007, Groblewska М., 2012). При прогрессировании плоскоклеточного рака отмечали гиперэкспрессию ММП2 и 9 в зоне инвазии опухоли (Bordador L.C., 2000, Ondruschka С, 2003). По данным Ishibashi Y. et al. (2004), CD147 экспрессировал-ся в злокачественных и диспластически измененных тканях, но не в нормальной слизистой гортани, а экспрессия ММП2 наблюдалась в нормальных фибробластах и лишь в некоторых случаях в клетках плоскоклеточного рака.
В доступной литературе крайне скудны сведения об экспрессии металлопротеиназ опухолевыми структурами разного строения при плоскоклеточном раке гортани, а также стромальными элементами опухоли и о значимости такой экспрессии в распространенности и лимфогенном метастазировании.
Цель исследования
Целью настоящей работы является изучение прогностического значения гетерогенности экспрессии матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов клеточными элементами опухоли и стромы у больных раком гортани.
Задачи исследования
-
Оценить экспрессию ММП1, ММП2, ММП9 и тканевых ингибиторов TIMP1, TIMP2 и CD 147 (EMMPRIN) в различных тканевых структурах рака гортани.
-
Оценить экспрессию ММП1, ММГТ2, ММП9 и тканевых ингибиторов ТГМР1,ТГМР2 и CD 147 (EMMPRIN) в стромальных элементах опухоли.
-
Сравнить экспрессию ММП, их тканевых ингибиторов и клинико-морфологические показатели течения опухолевого процесса.
-
Определить экспрессию CD31 как маркера ангиогенеза в опухолевой ткани и выявить связь с экспрессией металлопротеиназ, их ингибиторов и активатора.
-
Определить значимые маркеры, связанные с регионарным метастазиро-ванием рака гортани.
Научная новизна работы
Впервые обнаружено, что при плоскоклеточном раке гортани экспрессия металлопротеиназ, индуктора синтеза и ингибиторов их активности зависит от степени дифференцировки опухолевых структур и наиболее выражена в дискретных опухолевых клетках. Гетерогенность экспрессии металлопротеиназ в плоскоклеточном раке гортани подчеркивается ее изменением после неоадъювантной терапии. Она подчиняется «правилу исходного уровня»: экспрессия повышается в вы-сокодифференцированных структурах, где исходно она была низкой, и снижается в низкодифференцированных, где она была высокой.
Впервые показано, что распространенность плоскоклеточного рака гортани независимо от локализации опухоли выражена в большей степени, если опухоль имеет выраженный гетерогенный характер: построена структурами высокой и низкой степени дифференцировки. Причем распространенность таких опухолей связана в большей степени не с экспрессией металлопротеиназ клетками опухоли, а с экспрессией ММП2 в мононуклеарных лейкоцитах и фибробластах.
Впервые обнаружено, что лимфогенное метастазирование плоскоклеточного рака гортани независимо от локализации опухоли сопряжено с экспрессией ММП9 в более дифференцированных опухолевых структурах 1, 2 и 3-го типов.
Впервые установлено, что более частое лимфогенное метастазирование плоскоклеточных карцином, располагающихся преимущественно в надскладоч-ном отделе гортани, в сравнении с опухолями голосовых складок связано с наличием высоко- и низкодифференцированных структур. Причем это сопряжено с более выраженной экспрессией ММП9 в сегментоядерных лейкоцитах, инфильтрирующих строму.
Впервые обнаружено: при опухолях смешанного строения с наличием высоко- и низкодифференцированных структур, локализующихся в надскладочной области гортани, неоадъювантная терапия оказывается эффективной в отношении реализации лимфогенных метастазов.
Впервые показано, что опухолевые структуры низкой дифференцировки в опухолях в группе с лимфогенными метастазами обладают выраженной чувствительностью к неоадъювантной терапии.
Практическая значимость
Для определения прогностической значимости экспрессии металлопротеиназ, прежде всего ММП2 и ММП9, а также молекул, регулирующих их экспрессию и активность, необходимо учитывать гетерогенность морфологического строения плоскоклеточного рака гортани и оценивать экспрессию металлопротеиназ раздельно в разных морфологических структурах опухоли.
Для оценки распространенности плоскоклеточного рака гортани и риска лимфогенного метастазирования целесообразно определять экспрессию металлопротеиназ не только клетками опухоли, но и нейтрофильными и мононуклеарны-ми лейкоцитами и фибробластами.
Необходимо учитывать, что частота лимфогенного метастазирования плоскоклеточного рака гортани зависит от локализации опухоли и от принадлежности к трем группам, выделенным нами по характеру дифференцировки и гетерогенности. Это опухоли с преимущественно высоко- или низкодифференцированными структурами, а также наиболее гетерогенные опухоли с сочетанием высоко- и низкодифференцированных структур. Опухоли третьей группы при локализации в надскладочной области имеют высокую частоту лимфогенного метастазирования, а при локализации на голосовых связках - минимальный риск метастатического поражения лимфоузлов.
Неоадъювантная терапия опухолей третьей группы с локализацией в надскладочной области может быть эффективной в отношении лимфогенных метастазов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При плоскоклеточном раке гортани экспрессия металлопротеиназ, индуктора синтеза и ингибиторов их активности характеризуется выраженной внут-риопухолевой гетерогенностью, зависимой от типа опухолевых структур, различающихся степенью дифференцировки, и максимальна в дискретных опухолевых клетках. Влияние предоперационной терапии на экспрессию металлопротеиназ подчиняется «правилу исходного уровня»: экспрессия повышается в высоко дифференцированных структурах, где исходно она была низкой, и снижается в низко-дифференцированных, где она была высокой.
-
Лимфогенное метастазирование сопряжено с экспрессией ММП9 в более дифференцированных опухолевых структурах 1, 2 и 3-го типов. Значительно большая частота лимфогенного метастазирования карцином надскладочной области в сравнении с опухолями голосовых связок связана с опухолями, построенными высоко- и низкодифференцированными структурами, и более выраженной экспрессией ММП9 в сегментоядерных лейкоцитах, инфильтрирующих строму.
-
При плоскоклеточных карциномах надскладочной области гетерогенного строения с сочетанием высоко- и низкодифференцированных структур неоадъювантная терапия уменьшает частоту реализации лимфогенных метастазов. Структуры низкой дифференцировки в опухолях с лимфогенными метастазами встре-
чаются значительно реже после неоадъювантной терапии и, по видимому, являются более чувствительными к предоперационной терапии.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН, «Современная онкология: достижения и перспективы развития», 10-11 сентября 2009 года; на шестой Российской конференции по фундаментальной онкологии в 2010 году; конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева, «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» в 2007, 2009 и 2010 годах, Томск.
Внедрение результатов исследования
Обнаруженные морфологические прогностические критерии лимфогенного метастазирования плоскоклеточного рака гортани внедрены в практику работы отделения патологической анатомии и цитологии, отделения опухолей головы и шеи Томского НИИ онкологии, а также используются в преподавании раздела «Эпителиальные злокачественные опухоли» на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.
Личный вклад автора в получение новых результатов исследования
Автором проанализированы клинические данные по теме диссертации, выполнены морфологические исследования первичной карциномы гортани и удаленных лимфатических узлов. Проведено иммуногистохимическое исследование экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147. Создана электронная база данных клинических, гистологических и имму-ногистохимических исследований. Результаты подвергнуты статистической обработке. Самостоятельно проанализированы результаты работы, сформулированы выводы и положения, выносимые на защиту.
Публикации
По теме проведенного исследования опубликовано 15 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 6 журнальных статей в рекомендованных ВАК изданиях.
Объем и структура диссертации
Закономерности и особенности лимфогенного и гематогенного метастазирования плоскоклеточного рака гортани
Опухолевая ткань постоянно изменяется: происходит прогрессия, как правило, в сторону повышения ее злокачественности, которая проявляется инвазивным ростом и развитием метастазов [111, 215]. Стадия инвазивной опухоли характеризуется возникновением инфильтрирующего роста. В опухоли появляется развитая сосудистая сеть и строма, выраженная в различной степени. Границы с прилежащей неопухолевой тканью отсутствуют из-за прорастания в нее опухолевых клеток. Инвазия опухоли протекает в три фазы и обеспечивается определенными генетическими перестройками [129, 244].
Первая фаза инвазии опухоли характеризуется ослаблением контактов между клетками, о чем свидетельствует уменьшение количества межклеточных контактов, снижение концентрации некоторых адгезивных молекул из семейства CD44 и других и, наоборот, усиление экспрессии прочих, обеспечивающих локомоторный фенотип опухолевых клеток и их контакт с экстрацеллюлярным матриксом [151]. На клеточной поверхности снижается концентрация ионов кальция, что приводит к повышению отрицательного заряда опухолевых клеток [129]. Усиливается экспрессия интегриновых рецепторов, обеспечивающих прикрепление клетки к компонентам экстрацеллюлярного матрикса - ламинину, фибронектину, коллагенам [212, 214, 232, 236].
Затем опухолевая клетка секретирует протеолитические ферменты и их активаторы, которые обеспечивают деградацию экстрацеллюлярного матрикса, освобождая тем самым ей путь для инвазии [176, 217, 220, 223, 245]. В то же время продукты деградации фибронектина и ламинина являются хемоаттрактантами для опухолевых клеток, которые мигрируют в зону деградации в ходе инвазии [108, 111, 121, 201]. Стадия метастазирования -заключительная стадия прогрессии опухоли, сопровождающаяся ее определенными гено- и фенотипическими перестройками [249]. Опухолевые клетки мигрируют через экстрацеллюлярный матрикс, прикрепляясь интегриновыми рецепторами к ламинину, фибронектину, коллагеновым молекулам базальной мембраны сосуда, осуществляют ее протеолиз за счет выделения коллагеназ, катепсина, эластазы, гликозаминогидролазы, плазмина и др. Это позволяет опухолевым клеткам инвазировать базальную мембрану сосуда, прикрепляться к его эндотелию, а затем, изменяя свои адгезивные свойства (супрессия адгезивных молекул семейства cell adhesiv molecules - САМ), отделяться как от опухолевого пласта, так и от эндотелия сосуда [132, 176, 182, 184, 214]. На следующем этапе формируются опухолевые эмболы, которые могут состоять только из опухолевых клеток или же в сочетании с тромбоцитами и лейкоцитами [128, 129]. Фибриновое покрытие таких эмболов может защищать опухолевые клетки от элиминации клетками иммунной системы и действия неспецифических факторов защиты [82].
На заключительном этапе происходит взаимодействие опухолевых клеток с эндотелием венул за счет рецепторов и молекул CD44, прикрепление и протеолиз базальной мембраны, инвазия в периваскулярную ткань и рост вторичной опухоли [60, 87, 100, 111]. В период прогрессии опухоли может происходить ее клональная эволюция, то есть могут появляться новые клоны опухолевых клеток, возникающие в результате вторичных мутаций, что приводит к поликлоновости опухоли и доминированию наиболее агрессивных клонов как итог клональной селекции [84, 92].
Теория клональной эволюции может помочь в объяснении не только прогрессии злокачественной опухоли и метастазирования, но и понять такие особенности опухоли, как изменения дифференцировки клеток на отдельных участках, усиление злокачественности опухоли после противоопухолевой терапии и феномен множественной лекарственной устойчивости опухоли [81, 101, 102, 112,115].
Одним из важных структурных компонентов опухоли является ее строма. Строма в опухоли, как и строма в нормальной ткани, в основном выполняет трофическую, модулирующую и опорную функции. Стромальные элементы опухоли представлены клетками и экстрацеллюлярным матриксом соединительной ткани, сосудами и нервными окончаниями. Экстрацеллюлярный матрикс опухолей представлен двумя структурными компонентами: базальными мембранами и интерстициальным соединительно-тканным матриксом. В состав базальных мембран входят коллагены IV, VI и VII типа, гликопротеиды (ламинин, фибронектин, витронектин), протеогликаны (гепаран сульфат и др.). Интерстициальный соединительно-тканный матрикс содержит коллагены I и III типа, фибронектин, протеогликаны и гликозаминогликаны [54, 62, 230]. Получены убедительные экспериментальные данные о возникновении клеточных элементов стромы опухолей из пред существующих нормальных соединительнотканных предшественников окружающих опухоль тканей [91, 115]. В 1971 г. J. Folkman показал, что клетки злокачественных опухолей продуцируют некий фактор, стимулирующий пролиферацию элементов сосудистой стенки и рост сосудов. Это сложное вещество белковой природы назвали фактором Фолькмана. Как впоследствии было установлено, фактор Фолькмана представляет собой группу факторов роста фибробластов, которых уже известно более 11 [129, 130, 146]. Фолькман первым убедительно показал, что стромообразование в опухоли является результатом сложных взаимодействий между опухолевой клеткой и клетками соединительной ткани.
Важную роль в стромообразовании в неоплазме выполняют соединительнотканные клетки как местного, гистиогенного, так и гематогенного происхождения. Стромальные клетки продуцируют разнообразные факторы роста, стимулирующие пролиферацию клеток мезенхимального происхождения (факторы роста фибробластов, фактор роста тромбоцитов, фактор некроза опухоли альфа, фибронектин, инсулиноподобные факторы роста и др.) [104, 135, 168, 171, 179, 188, 205, 228]. Одновременно экспрессируют рецепторы, связывающие факторы роста и онкобелки, что позволяет стимулировать их пролиферацию как по аутокринному, так и по паракринному пути. Кроме того, сами клетки стромы способны выделять разнообразные протеолитические ферменты, приводящие к деградации экстрацеллюлярного матрикса. Опухолевые клетки активно участвуют в образовании стромы.
Во-первых, трансформированные клетки стимулируют пролиферацию соединительно-тканных клеток по паракринному регуляторному механизму, продуцируют факторы роста и онкопротеины. К таким молекулам можно отнести интерлейкины, в норме участвующие в воспалении, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и сами продукты распада экстрацеллюлярного матрикса, являющиеся аттрактантами для ферментов и трансформированных клеток [82, 206].
Во-вторых, они способны стимулировать и контролировать синтез и секрецию соединительно-тканными клетками компонентов экстрацеллюлярного матрикса, определять профиль его компонентов [59].
В-третьих, сами опухолевые клетки способны секретировать определенные компоненты экстрацеллюлярного матрикса. Причем тип таких компонентов имеет характерный состав в некоторых опухолях, что можно использовать при их дифференциальной диагностике [80, 111,230].
В-четвертых, опухолевые клетки продуцируют ферменты (коллагеназы и др.), их ингибиторы и активаторы, способствующие или, напротив, препятствующие инвазивному росту злокачественных опухолей [28, 29, 58, 109, 115, 162, 163]. Динамическое равновесие между активаторами коллагеназ и их ингибиторами обеспечивает стабильное состояние опухоли и препятствует прорастанию в прилежащие ткани. В момент роста опухолевые клетки активно синтезируют коллагеназы, эластазы и их ингибиторы [20, 54, 55, 105, 114]. Злокачественые опухоли часто формируют строму, в которой доминирует тип коллагена стромы соответствующего органа на стадии эмбрионального развития. Так, например, в строме рака легкого преобладающим типом коллагена является коллаген III, характерный для эмбрионального легкого [144]. Разные опухоли могут отличаться по составу коллагенов стромы. В карциномах, как правило, доминируют коллагены III типа (рак легкого), IV типа (почечно-клеточный рак и нефробластомы), в саркомах - интерстициальные коллагены, но в хондросаркоме - коллаген П. В синовиальной саркоме много коллагена IV [119, 123, 132, 144].
Рост опухолей зависит от степени развитости в них сосудистой сети. В новообразованиях диаметром менее 1-2 мм питательные вещества и кислород поступают из тканевой жидкости окружающих тканей путем диффузии. Для питания же более крупных новообразований необходима васкуляризация их ткани. Формирование сосудов в опухолях происходит на фоне усиленной митогенетической стимуляции и измененного экстрацеллюлярного матрикса [119, 128, 176, 199]. Это приводит к развитию неполноценных сосудов преимущественно капиллярного типа, имеющих нередко прерывистую базальную мембрану и нарушенную эндотелиальную выстилку [229]. Эндотелий может замещаться опухолевыми клетками, а иногда и вовсе отсутствовать [108].
Современные методы лечения больных раком гортани
В настоящее время применяются различные режимы фракционирования дозы самостоятельной и предоперационной лучевой терапии в комплексе с радиомодифицирующими средствами при консервативном и комбинированном лечении местно-распространенного рака гортани. Панкратов В.А. с соавт. (2008) проводили лучевую терапию больным раком гортани T3-4N0-3M0 в различных режимах фракционирования дозы: традиционном - по 2 Гр ежедневно, суперфракционирования - по 1+1 Гр ежедневно, неравномерном - 1+1 Гр и 1+3 Гр в дни проведения локальной гипертермии, предоперационно-концентрированном - по 5 Гр 2 раза в неделю до суммарной очаговой дозы (СОД) 20 Гр с последующим неотсроченным хирургическим вмешательством [40]. При комбинированном лечении рецидивных опухолей гортани описано интенсивное предоперационное облучение крупными фракциями по 6 Гр накануне и в день операции, СОД = 12 Гр [53].
Сообщается о способе лечения больных раком гортани с распространенностью опухолевого процесса T3-4N0-3M0, который заключается в одновременном проведении лучевой терапии и системной полихимиотерапии. Всем больным одновременно с началом лучевой терапии проводился 8-дневный цикл полихимиотерапии по схеме: винкристин 1,4 мг/м в 1-й день, цисплатин 20 мг/м во 2, 3, 4-й дни, блеомицетин 10 мг/м в 5-й, 6-й дни, циклофосфан 200 мг/м в 7-й, 8-й дни. После подведения дозы 30-40 Гр и двухнедельного перерыва осуществлялась оценка эффективности лучевой терапии. При сокращении опухоли более чем на 50 % или полной регрессии лучевая терапия продолжалась до дозы 60-65 Гр. В случае слабой эффективности консервативного лечения осуществлялось хирургическое вмешательство, в том числе и органосохраняющее. Лучевая терапия осуществлялась на гамма-терапевтических аппаратах методом дробления дозы (1+1 Гр) ежедневно с интервалом между фракциями 4-5 ч. Трехлетняя безрецидивная выживаемость составила 69,6 %, общая - 82,6 % [39].
Одним из перспективных направлений является лучевая терапия в режиме мультифракционирования дозы. Режим фракционирования дозы назначается с целью максимального повреждения наиболее резистентных компонентов опухоли у больных местно-распространенными формами рака гортани. Проведение расщепленного курса лучевой терапии позволяет довести суммарную очаговую дозу до 70,0-72,0 Гр, не увеличивая процент лучевых осложнений [57].
Предложен и клинически апробирован усовершенствованный способ комбинированного лечения рака гортани, включающий неоадъювантную химиотерапию по схеме паклитаксел/карбоплатин с последующей лучевой терапией в режиме мультифракционирования дозы (1,3 Гр 2 раза в день с перерывом 4 ч, СОД = 40 изоГр) и радикальное хирургическое вмешательство. Применение указанного метода позволяет статистически значимо увеличить общую и безрецидивную 5-летнюю выживаемость соответственно до 68,3±5,4 % и 65,4±5,3 % относительно группы контроля - 33,6±5,7 % и 26,4±5,3 % соответственно (р 0,05) [73].
В настоящее время большое значение придается совершенствованию хирургического этапа комбинированного лечения при местно-распространенных опухолях гортани и гортаноглотки. С этой целью разрабатываются новые варианты расширенных резекций, а также методики реконструкции оперируемых органов [7, 11, 24, 25, 45, 56, 77].
В Санкт-Петербургском НИИ уха, горла, носа и речи применяется методика контурной пластики гортани имплантацией синтетического полимера «Формакрил» у больных, перенесших реконструктивно-восстановительные операции по поводу рака гортани. Этот способ позволил добиться улучшения голосовой функции у 82 % больных, в том числе перенесших расширенные резекции гортани [67].
Опыт работы РОНЦ им. Н.Н. Б лохина позволил накопить клинический материал по органосохраняющему лечению 105 больных раком гортани T3.4N0M0, которым выполнены переднебоковые, субтотальные и надскладочные резекции. Получены удовлетворительные функциональные результаты. Голосовая функция восстановлена у 89 % больных, дыхательная - у 85 %, защитная - у 77 %. Однако 23 % больных остались канюленосителями. Пятилетняя выживаемость составила 78 % [4].
На большом клиническом материале в МНИИО им. П.А. Герцена разработаны функционально-щадящие операции при раке гортаноглотки, которые предусматривают резекцию гортаноглотки с сохранением гортани при Т3 либо ее удаление при распространенном поражении обоих органов (Т4). Выживаемость в первый год составила 81,8 % [52].
Большой интерес у специалистов по опухолям головы и шеи вызывает проблема эндопротезирования гортани. С 1998 года в Томском НИИ онкологии накоплен определенный опыт и применяются эндопротезы оригинальной конструкции из пористого никелида титана [36]. После органосохранного лечения рака гортани с одномоментным эндопротезированием дыхательная функция восстановлена у 94,2 % больных, голосовая функция - у 90,1 %, защитная функция - у 96 % [79].
В проанализированной литературе авторы в основном рассматривают плоскоклеточные карциномы головы и шеи как общую группу заболеваний, зачастую не выделяя отдельные анатомические области. Опухолевая ткань исследуется в целом, без выделения морфологических структур. Основной морфологической характеристикой служит степень дифференцировки опухоли. Большой объем работ по изучению активности ММП и ТИМП проводится на более тонком молекулярном уровне, что связано с менее инвазивным способом получения материала от пациента, однако не позволяет оценить реальную экспрессию маркеров в конкретных исследуемых клетках.
Экспрессия металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза ферментов CD 147 в разных структурах новообразования при раке гортани в зависимости от степени дифференцировки опухоли в группе без и после предоперационного лечения
Так, для первого типа структур выявлены только две положительные корреляции между экспрессией ММП1 в опухоли и экспрессией этого же фермента в фибробластах, а также экспрессией CD 147 в мононуклеарных элементах. Во втором типе структур обнаружены четыре корреляционные связи. Экспрессия ММП1 в опухоли напрямую связана с экспрессией ММП1 и ММП2 и имеет отрицательную связь с экспрессией ММП9 в мононуклеарных лейкоцитах.
В третьем типе структур из четырех связей три касаются экспрессии ММП1 в опухолевых клетках. Она оказалась напрямую связана с экспрессией в мононуклеарных лейкоцитах ММП1 и ММП2 и имела обратную связь с экспрессией в этих же клетках ММП9. Выраженность экспрессии CD147 в опухолевых клетках имела прямую связь с экспрессией ММП9 в фибробластах.
Максимальное количество корреляционных связей (восемь) относится к четвертому типу опухолевых структур. В отличие от других структур, экспрессия ММП1 опухолевыми клетками имела прямую корреляционную связь с экспрессией этого же фермента в нейтрофильных лейкоцитах. Экспрессия ММП9 в опухолевых элементах четвертого типа структур имела прямую корреляцию с экспрессией в нейтрофильных лейкоцитах ММП1, ММП2 и CD147, в мононуклеарных лейкоцитах - ММП2 и CD 147. Кроме этого, экспрессия CD 147 в опухолевых клетках структур четвертого типа имела прямые корреляционные связи с экспрессией ММП2 в мононуклеарных и нейтрофильных лейкоцитах. В пятом типе опухолевых структур обнаружены три корреляционные связи. Экспрессия ММП2 в опухоли и нейтрофильных лейкоцитах была взаимосвязана напрямую. Экспрессия ММП9 также имела прямую связь с экспрессией ММП9 в мононуклеарных лейкоцитах и с ММГТ2 в фибробластах.
Анализ корреляционных связей свидетельствует о том, что из всех опухолевых структур экспрессия металлопротеиназ опухолевыми клетками структур 4-го типа в максимальной степени связана с экспрессией этих ферментов клетками стромы: если в клетках первого типа таких связей две, то в клетках опухоли структур 4-го типа - 8. Вторая закономерность заключается в том, что если в большинстве случаев экспрессия металлопротеиназ в высокодифференцированных структурах опухоли связана с экспрессией ферментов этой группы в мононуклеарных лейкоцитах (5 из 6 связей), то в низко дифференцированных структурах их число меньше (7 из 15) и возникает большое количество связей с экспрессией металлопротеиназ в нейтрофильных лейкоцитах (6 из 15).
Среди экспрессированных в опухоли металлопротеиназ чаще всего корреляционные связи с экспрессией ферментов в стромальных элементах имела ММП1 (8 из 20) и ММП9 (8 из 20), реже возникали связи с экспрессией ММП2 в опухолевых клетках (1 из 20).
Экспрессия металлопротеиназ опухолевыми клетками не коррелировала с продукцией тканевых ингибиторов клеточными элементами воспалительного инфильтрата. Исключение составляла экспрессия ММП1 опухолевыми элементами 1-го типа. Она коррелировала с продукцией тканевого ингибитора ММП1 в фибробластах (г=0,32; р=0,03). 3.1.9 Экспрессия металлопротеиназ в зависимости от распространенности плоскоклеточного рака гортани
Связь экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза протеиназы CD 147 в опухолевых элементах разных структур с распространенностью опухоли (Т) у пациентов без и после предоперационного лечения Распространенность плоскоклеточного рака гортани (Т) не была существенно связана с выраженностью экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов в опухолевых элементах всех типов морфологических структур. Отсутствовала какая-либо связь распространенности опухоли и с индуктором синтеза металлопротеиназ CD 147 (таблица А. 11).
После предоперационной терапии не обнаружено связи выраженности экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора CD 147 со степенью распространенности рака гортани (таблица А. 12).
Таким образом, распространенность плоскоклеточного рака гортани существенно не влияла на активность металлопротеиназ и их ингибиторов в опухолевых клетках. Предоперационная терапия также не влияет на эти связи.
Связь экспрессии металлопротеиназ, их ингибиторов и индуктора синтеза протеиназ CD147 в стромальных элементах с распространенностью опухоли (Т) у пациентов без предоперационного лечения Экспрессия ММП1, ММП9, ТИМП2 и CD 147 в мононуклеарных и сегментоядерных лейкоцитах, а также фибробластах не связана со степенью распространенности опухоли в гортани. Вместе с тем, от ТІ к Т4 отмечена отчетливая тенденция к возрастанию экспрессии ММП2 в мононуклеарных лейкоцитах и в фибробластах. При этом в фибробластах уменьшается экспрессия ТИМП1 и ТИМП2 (таблица А. 13). Предоперационная терапия приводила к исчезновению описанных связей между экспрессией металлопротеиназ и их ингибиторов и распространенностью плоскоклеточного рака гортани, наблюдаемых в группе пациентов, не получавших лечение (таблица А. 14).
Таким образом, высокая степень распространения плоскоклеточного рака гортани связана с усилением экспрессии ММП2 в лейкоцитах и фибробластах и снижением экспрессии ТИМП1 в фибробластах. Предоперационная терапия привела к отмене этих связей.
Зависимость степени распространенности плоскоклеточного рака гортани (Т) от сочетания высоко- и низкодифференцированных структур в первичной опухоли у больных без предоперационного лечения Установлено, что степень распространенности первичного опухолевого процесса в гортани существенным образом не зависит от наличия в новообразовании опухолевых структур разной степени дифференцировки, но связана с вариантом их сочетания. Распространенность преимущественно высоко-или низкодифференцированных плоскоклеточных карцином гортани существенно не различалась, за исключением тенденции более частой встречаемости опухоли, соответствующей Т2. Распространенность гетерогенных опухолей с наличием высоко- и низкодиффернцированных структур, судя по меньшей доле ТІ и большему проценту ТЗ, оказалась более выраженной по отношению и к высоко-, и к низкодифференцированным опухолям (таблица 8). Таким образом, несмотря на наличие в гетерогенных опухолях и высоко-, и низкодифференцированных структур они характеризуются большей распространенностью, чем преимущественно низкодифференцированные опухоли.
Взаимосвязь локализации опухоли и уровня ее дифференцировки с лимфогенным метастазированием
Рак гортани является наиболее распространенной злокачественной опухолью верхних дыхательных путей и заболеваемость этим недугом имеет тенденцию к росту. Преимущественно он встречается у мужчин работоспособного возраста и составляет 80-95 % от общего числа больных. Ввиду особенностей клинического течения рака гортани, трудностей диагностики, характера роста опухоли и позднего обращения чаще встречаются больные с распространенными стадиями заболевания, что в свою очередь приводит к высокой смертности (до 40 %) уже на первом году с момента постановки диагноза [41, 51, 52, 73, 77, 79]. Это обусловлено не только низкой частотой выявления болезни на ранних стадиях, но и недостаточным использованием наиболее эффективных методов лечения с учетом биологических особенностей опухолевого процесса. Всего 20,8 % больных с местно-распространенным процессом получают комбинированное лечение, включающее не только хирургический и лучевой компонент, но и противоопухолевую терапию [73]. В последние годы подходы к лечению местно-распространенного рака гортани существенно изменились благодаря появлению новых противоопухолевых препаратов, а также широкому применению оптимальных вариантов химиотерапии в сочетании с хирургическим и лучевым лечением [3, 66].
Несмотря на достигнутые успехи в лечении больных со злокачественными опухолями гортани эффективность лечебных мероприятий все еще недостаточно высока. Поэтому поиск маркеров, способных предсказать течение заболевания, эффективность проводимой терапии и дальнейшее развитие опухоли гортани, остается всегда актуальным [65, 70, 73].
Матриксные металлопротеиназы представляют собой семейство кальций-зависимых цинксодержащих эндопротеаз. Матриксные металлопротеиназы секретируются как опухолевыми клетками, так и фибробластами, остеобластами, макрофагами, нейтрофилами, эндотелиальными клетками и лимфоцитами [237]. Субстратами для металлопротеиназ являются коллаген разных типов, эластин, желатин, гликопротеины межклеточного матрикса и протеогликаны [20, 237]. Исследования последних лет показывают существенное значение матриксных металлопротеиназ в регуляции воспаления в опухолях [224]. Матриксные металлопротеиназы играют ключевую роль в протеолитической деградации внеклеточного матрикса, в межклеточном и клеточно-стромальном взаимодействии. Эти функции определяют значение маталлопротеиназ в инвазивном росте и метастазировании злокачественных опухолей [18, 136, 200].
В соответствии с рекомендациями ВОЗ (2005) плоскоклеточный рак гортани делят на высоко-, умеренно и низко дифференцированный. Согласно описанию высокодифференцированные опухоли цитологически напоминают нормальный эпителий. Опухоли с умеренной дифференцировкой отличаются отчетливым ядерным полиморфизмом и менее выраженной кератинизацией. При низкой степени дифференцировки преобладают незрелые атипичные клетки, много нормальных и атипических митозов. Считается, что степень кератинизации, как и уровень дифференцировки опухоли, не имеет существенного прогностического значения [12]. В противоположность этому полагают, что большее значение для прогноза имеет оценка инвазивного фронта опухоли. Если инвазивный фронт «экспансивный», с крупными гнездами опухолевых клеток и с давлением края опухоли - прогноз более благоприятен. Когда инвазивный фронт «инфильтративный» и представлен тяжами или отдельными опухолевыми клетками, то прогноз менее благоприятен [90].
Однако оценка степени дифференцировки опухоли нередко вызывает затруднения, поскольку в части случаев наблюдается сочетание структур высокой и низкой дифференцировки. Столь же трудно в большинстве случаев оценить вариант инвазивного фронта опухоли, поскольку мелкие группы, тяжи и отдельные опухолевые клетки располагаются не только на границе с окружающей тканью, но и «внутри» опухоли среди более дифференцированных структур.
Плоскоклеточный рак гортани характеризуется выраженной гетерогенностью морфологического строения. Систематизация результатов оценки гетерогенности морфологического строения плоскоклеточных карцином позволила выделить структуры с ороговением (1-й тип), с клетками базалоидного и шиповатого вида без ороговения (2-й тип), с клетками базалоидного типа (3-й тип), структуры с выраженным клеточным полиморфизмом (4-й тип) и одиночные опухолевые клетки (5-й тип). Структуры 1-го и 2-го типа являются высоко дифференцированными, в то время как структуры 3, 4 и 5-го типа можно рассматривать как низкодифференцированные. Причем уменьшение степени дифференцировки нарастает от 3-й к 5-й структуре.
Гетерогенность морфологического строения опухоли проявляется сочетанием структур разной степени дифференцировки. В связи с этим целесообразно разделение плоскоклеточных карцином гортани на три варианта в зависимости от типа сочетающихся структур. Результаты исследования показали, что чаще встречающиеся опухоли смешанного строения (со структурами 1-го, и/или 2-го и 3-го, и/или 4-го, и/или 5-го типа) не идентичны ни высоко дифференцированным (со структурами 1-го и/или 2-го типа), ни низко дифференцированным (с сочетанием структур 3-го, и/или 4-го, и/или 5-го типа) карциномам.
В чем могут состоять различия трех вариантов плоскоклеточных карцином? По-видимому, в низкодифференцированных опухолях стволовые опухолевые клетки полностью потеряли способность к дифференцировке. В то же время клетки в этих опухолях имеют большие потенции к эпителиально-мезенхимальному переходу, поэтому в них чаще встречаются дискретно расположенные опухолевые клетки. В опухолях, построенных только дифференцированными структурами, наоборот, по-видимому, снижена способность к «коллективно-индивидуальному», включая эпителиально-мезенхимальный, переходу с появлением отдельных инвазивных клеток. В чаще встречающихся опухолях смешанного строения сочетаются обе потенции: к дифференцировке и к инвазии отдельными клетками. Разные потенции могут быть обусловлены клональной гетерогенностью опухоли. Обладают ли опухолевые клетки, строящие одинаковые структуры в опухолях мономорфного по дифференцировке или смешанного строения, одинаковыми или разными свойствами?
Мы обнаружили гетерогенный характер экспрессии металлопротеиназ в плоскоклеточных карциномах гортани. Выраженность экспрессии металлопротеиназ, индуктора их синтеза и ингибиторов этих ферментов зависела от степени дифференцировки опухолевых клеток, строящих разные структуры. В отличие от высоко дифференцированных структур, структуры 5-го типа -разрозненные опухолевые клетки - в наибольшей степени соответствующие инвазивному морфологическому фенотипу, демонстрировали наиболее выраженную экспрессию ММП1, ММП2 и ММП9, которые, как известно, играют существенную роль в мезенхимном варианте инвазивного роста изолированных клеток [131, 224]. Экспрессия индуктора синтеза металлопротеиназ в структурах 1-го типа связана с плотностью сосудов в плоскоклеточной карциноме. В литературе имеются данные, что ММР9 вместе с другими факторами сопряжены с промоцией ангиогенеза [140].
Результаты наших исследований показали, что неоадъювантная терапия привела к значительному уменьшению количества сосудов. Напротив, в опухолях со смешанным строением и в чисто высокодифференцированных опухолях эффекта предоперационной терапии по отношению к сосудистому руслу не было. Этот результат еще раз подчеркивает существенные различия опухолей относительно гомогенного по морфологии и гетерогенного строения и целесообразность предлагаемой классификации плоскоклеточных карцином гортани.