Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Клинико-эпидемиологические аспекты колоректального рака 13
1.2 Общая характеристика экзосом 15
1.3 Тетраспанины экзосом 17
1.4 Тетраспанины CD151 и Tspan8 и их роль в канцерогенезе 18
1.5 Протеазы экзосом 20
1.6 ADAM10 и ADAM17 и их роль в канцерогенезе 22
1.7 Роль тканевых и экзосомальных ММР и EMMPRIN в канцерогенезе 25
1.8 Тетраспанин-неассоциированные 20S протеасомы 28
1.9 Экзосомальные белки как перспективные прогностические факторы при злокачественных опухолях 30
Глава 2. Материал и методы исследования 34
2.1 Клиническая характеристика больных 34
2.2 Материал исследования 38
2.3. Методы исследования 38
2.3.1 Выделение экзосом из плазмы крови 38
2.3.2 Количественная оценка белка 39
2.3.3 Типирование экзосом плазмы крови 39
2.3.4 Определение уровня суммы альфа и бета субъединиц 20S протеасом в экзосомах 40
2.3.5 Анализ субпопуляций ADAM10/ADAM17 экзосом 41
2.3.6 Анализ субпопуляций ММР9/MMP2/EMMPRIN экзосом 42
2.3.7 Анализ субпопуляций тетраспанинов Tspan8/CD151 экзосом 42
2.3.8 Оценка общей и безрецидивной выживаемости 42
2.4. Методы статистической обработки результатов исследования 43
Глава 3 Результаты собственных исследований 45
3.1 Характеристика экзосом плазмы крови 45
3.2 Субпопуляции тетраспанинов и протеаз в экзосомах плазмы крови больных ПТК и больных КРР 49
3.3 Субпопуляционный состав экзосом и содержание тетраспанинов Tspan8 и CD151 в экзосомах во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами больных КРР 55
3.4 Уровень 20S протеасом и металлопротеиназ и их связь с клинико морфологическими параметрами больных КРР 59
3.5 Взаимосвязь экзосомальных тетраспанинов и протеаз у больных ПТК и больных КРР 63
3.6 Создание математической модели прогнозирования онкологического риска у больных ПТК с учетом особенностей субпопуляций тетраспанинов и протеаз экзосом 67
3.7 Дополнительные факторы прогноза местно-распространенного колоректального рака, а также факторы риска гематогенного метастазирования 72
Глава 4. Обсуждение 76
Заключение 88
Выводы 96
Практические рекомендации 98
Список литературы 99
- Клинико-эпидемиологические аспекты колоректального рака
- Экзосомальные белки как перспективные прогностические факторы при злокачественных опухолях
- Субпопуляции тетраспанинов и протеаз в экзосомах плазмы крови больных ПТК и больных КРР
- Дополнительные факторы прогноза местно-распространенного колоректального рака, а также факторы риска гематогенного метастазирования
Клинико-эпидемиологические аспекты колоректального рака
Колоректальный рак (КРР) занимает лидирующие позиции в распространенности, являясь во всем мире третьим среди онкологических заболеваний по частоте у мужчин и вторым по частоте у женщин [15]. Высокий уровень заболеваемости КРР более характерен для индустриализованных стран с высоким уровнем доходов: высокие ее показатели регистрируются в Америке, Австралии, Европе и Южной Корее, средние показатели - в Латинской Америке и низкие - в Африке и Азии [36].
В Российской Федерации также отмечается достаточно высокий уровень заболеваемости и смертности от КРР. В общей структуре онкологической заболеваемости рак толстой кишки составляет 11,9%. Среди мужчин этот показатель достигает 12,1%, занимая третье место после злокачественных новообразований дыхательных путей (16,9%) и предстательной железы (14,9 %). Среди женского населения КРР составляет 11,7% и занимает третье место после гинекологического рака (20,9%) и рака кожи (14,6%). В 2018 году в России зарегистрировано более 18 тысяч летальных случаев от КРР [6].
Проблема КРР также актуальна и для регионов РФ, например, в Томской области данная патология занимает второе место (без учета рака кожи). В течение 2005 – 2015 гг. число больных колоректальным раком в Томской области увеличилось на 39,9 %. Наибольшие показатели заболеваемости регистрируются в возрасте старше 55 лет. Средний возраст заболевших в 2015 г. составил 56,3 года, таким образом, КРР в Томской области болеет преимущественно трудоспособное активное население, что, несомненно влияет на социально-экономическое положение региона [18]. В настоящее время достаточно четко сформулированы факторы риска развития КРР, к ним, в первую очередь, относится генетическая предрасположенность, также определены патологические состояния, при которых КРР возникает гораздо чаще, чем в здоровой популяции. Также к факторам риска КРР относят: возраст старше 50 лет, курение, злоупотребление алкоголем, избыточное употребление красного мяса, гиподинамия, ожирение [141].
Наиболее значимым предраковым заболеванием являются полипы толстой кишки (ПТК), причем рак ободочной и прямой кишки в 90% случаев развивается из аденоматозных полипов, риск малигнизации других гистологических форм ПТК кратно ниже, в частности, малигнизация гиперпластических полипов наблюдается примерно в 1% случаев. Однако вопрос об уровне риска озлокачествления аденоматозных ПТК остается предметом дискуссий. Считается, что малигнизация железистых полипов наступает в среднем в 10%, а ворсинчатых — в 23-50% случаев. Такой разброс обусловлен неоднородностью контингента больных ПТК, включаемых в исследования. Неблагоприятными факторами являются множественные полипы, которые малигнизируются до 20 %, возраст – у пациентов старше 60 лет риск достигает 6-8%, размеры новообразования – при аденомах, диаметром 1-2 см злокачественная трансформация наблюдается в 20-50% и ряд других.
Согласно современным рекомендациям, все железистые полипы подлежат удалению. Несмотря на то, что удаление полипов позволяет снизить заболеваемость КРР на 20%, полипэктомия не гарантирует отсутствия рецидива ПТК и развития в дальнейшем злокачественных опухолей. Кроме того, среди оперированных по поводу аденом толстой кишки в 6 раз чаще развивается рак ободочной и толстой кишки, чем в общей популяции [38; 116]. Прогнозирование онкологического риска у больных с полипами толстой кишки в анамнезе явилось одной из задач нашего исследования. В программу скрининга КРР входят колоноскопия и тест на скрытую кровь в кале или иммуноцитохимический тест кала. Инвазивность, сложность, продолжительность эндоскопического исследования, низкая чувствительность теста, трудновыполнимая подготовка к анализу кала делают проведение скрининга трудновыполнимым. Ранние стадии рака толстой кишки обычно бессимптомны или малосимптомны, до 70% и более больных поступают в стационар на поздних стадиях заболевания [10].
Для колоректального рака характерно лимфогенное метастазирование, а также гематогенное метастазирование в печень. Около 20-22% колоректальных карцином изначально манифестируют как метастатический колоректальный рак [100].
Таким образом, рост заболеваемости и смертности КРР, высокий процент метастатических форм, сложность проведения скрининга, необходимость прогнозирования риска малигнизации у больных с полипами толстой кишки делают актуальным поиск неинвазивных прогностических маркеров КРР. В настоящее время большое значение придают циркулирующим внеклеточным везикулам как перспективным объектам для жидкостной биопсии опухолей.
Экзосомальные белки как перспективные прогностические факторы при злокачественных опухолях
Все больше доказательств свидетельствует об участии экзосом в прогрессировании опухоли [34], метастазировании [71] и развитии лекарственной устойчивости [163]. Было показано, что опухолевые клетки продуцируют как минимум в 10 раз больше экзосом, чем нормальные клетки, тем самым они локально модифицируют реципиентные клетки, обеспечивая определенные преимущества в микроокружении, способствуя прогрессированию опухоли и метастазированию. Экзосомы участвуют в инициации, росте, прогрессировании и лекарственной устойчивости злокачественных опухолей посредством прямого взаимодействия с поверхностно - экспрессированными лигандами или переносом мембранных рецепторов и генетического содержимого [96; 143]. Экзосомальные маркеры обладают уникальными свойствами по сравнению с обычными серологическими маркерами, имеют более высокую чувствительность, а также более высокую специфичность по сравнению, например, с белками, непосредственно обнаруживаемыми в крови. Кроме того, экзосомальные маркеры очень стабильны и защищены липидным бислоем от внешних ферментов, замороженные экзосомные образцы можно хранить до 5 лет [122; 165].
Содержимое экзосом могут рассматриваться как дополнительные биомаркеры для различных видов злокачественных опухолей, поскольку они несут груз, который отражает генетические или сигнальные изменения в опухолевых клетках [183]. Изменения в профилях белков или нуклеиновых кислот в экзосомах плазмы крови коррелируют с патологическими процессами многих заболеваний, включая злокачественные новообраования.
Многие исследования по изучению экзосом при опухолевых заболеваниях сосредоточены на микроРНК. Однако существуют ограничения в отношении экзосомных микроРНК как прогностических маркеров. Нормализация циркулирующих экзосомных микроРНК является одной из важных проблем, поскольку выбор подходящих нормализаторов имеет решающее значение для количественного определения микроРНК. В настоящее время нет единого мнения о стандартном методе нормализации в различных биологических жидкостях. Различия и неточность текущих эталонных контролей для нормализации в различных исследованиях еще более усложняют интерпретацию результатов [68]. До сих пор в профилировании микроРНК использовались разные платформы, включая секвенирование нового поколения (NGS), qRT-PCR и микроматричный анализ. Проведено сравнение 12 коммерчески доступных платформ для экспрессии микроРНК и сделан вывод, что каждый метод имеет специфические недостатки [66]. Было установлено, что уровень достоверности для дифференциально экспрессированных микроРНК между любыми двумя платформами составляет всего 54,6%. Сообщалось также о технологическом смещении профилирования микроРНК в NGS и микроматричном анализе, что может повлиять на прогноз количества обнаруженных микроРНК [35]. Таким образом, для будущего внедрения анализа микроРНК необходима точная платформа профилирования, которая применима в клиниках. Также необходимы дополнительные исследования для оптимизации методологий для характеристики всего спектра молекул РНК в экзосомах [67].
С развитием протеомных технологий и аналитических средств для изучения белков экзосом интерес исследователей смещается в сторону протеомики, увеличивается количество исследований протеинов экзосом, выделенных из различных биологических жидкостей. В настоящее время существуют исследования, которые описывают механизм действия экзосомальных белков в регуляции развития опухоли и обобщают их возможности в качестве опухолевых маркеров [139]. Однако все еще отсутствует понимание того, как реализовать клиническое применение экзосомальных белков в прогнозировании опухолей. В данной работе рассматриваются тетраспанины и протеазы экзосом плазмы крови больных колоректальным раком и их потенциальная возможность в клиническом применении.
Таким образом, колоректальный рак является второй по значимости причиной смертности от злокачественных новобразований у мужчин и женщин во всем мире. КРР обычно выявляют с помощью колоноскопии, теста на скрытую кровь в кале, измерения уровней раково-эмбрионального антигена и CA19-9. Золотой стандарт скрининга КРР - колоноскопия; хотя это очень чувствительный метод, он инвазивен и неудобен для пациентов, и его точность зависит от уровня квалификации и опыта оператора. Учитывая эти клинические проблемы, необходимы новые подходы для прогнозирования риска малигнизации и оперативного мониторинга прогноза пациентов.
В настоящее время активно разрабатываются тесты, в которых используются неинвазивные биомаркеры, и в большинстве случаев используются образцы кала или крови, также можно использовать другие биологические вещества, которые можно собирать неинвазивно (колоректальная слизь, моча, слюна, выдыхаемый воздух). Основными категориями исследованных в настоящее время биомаркеров КРР являются: белки (гемоглобин), ДНК (включая мутации и маркеры метилирования), РНК (в частности, микроРНК), низкомолекулярные метаболиты (содержащие летучие органические соединения) и изменения в составе кишечного микробиома [98]. Недавние исследования выдвинули на первый план роль экзосом в развитии и прогрессировании КРР, повышая тем самым интерес к этим наноразмерным везикулярным структурам в качестве возможных биомаркеров. Экзосомы содержат большое разнообразие молекул, которые обмениваются между клетками либо в микроокружении опухоли, либо в отдаленных местах от первичной опухоли, где они готовят подходящую почву для метастазов опухоли.
Экзосомальные маркеры обладают уникальными свойствами по сравнению с обычными серологическими маркерами, они более чувствительны и специфичны, кроме того, они стабильны, защищены от воздействия ферментов, а замороженные образцы экзосом можно хранить несколько лет в условиях низких температур [165].
Экзосомальный груз отражает изменения в опухолевых клетках, изменения генетического и протеомного профиля коррелируют с патологическими процессами многих заболеваний, включая онкологические. К настоящему времени в экзосомах идентифицированы тысячи микроРНК, мРНК, белки и. т.д.
Многие исследования по применению экзосом как прогностических маркеров злокачественных опухолей сосредоточены на микроРНК, однако существуют ограничения в профилировании и нормировании микроРНК в экзосомах. В последнее время возрастает интерес к протеомным исследованиям, т.к. активно развиваются протеомные технологии и аналитические средства для изучения экзосомальных белков различных биологических жидкостей при разных патологических состояниях.
Экзосомы плазмы крови содержат специфические белки с потенциальной прогностической ценностью, тем самым открывая новые возможности для их использования в качестве новых неинвазивных инструментов.
Субпопуляции тетраспанинов и протеаз в экзосомах плазмы крови больных ПТК и больных КРР
Вестерн-блот анализ показал, что уровень 20S протеасом в экзосомах плазмы больных КРР в 1,8 раза выше, чем в экзосомах больных ПТК (рисунок 10).
Результаты стандартизированы с учетом уровня CD63 в экзосомах и выражены в условных единицах целевого белка в экзосомах у больных с полипами толстой кишки. Вестерн-блот анализ экзосом.
Для обнаружения субпопуляций Tspan8/CD151 экзосом в плазме больных ПТК и больных КРР использовались латексные частицы с антителами против CD9. Распределение субпопуляций Tspan8/CD151 у больных ПТК и больных КРР оказалось сходным. Субпопуляция Tspan8-CD151- преобладала в обеих группах (КРР - 95,74±0,66 (%) и ПТК - 91,98±1,31 (%), р 0,05) по сравнению с другими субпопуляциями экзосом (рисунок 11).
Фенотипирование экзосом методом проточной цитометрии подразумевает анализ экзосом с использованием латексных частиц, покрытых антителом. Мы использовали латексные частицы с антителами против CD9 для обнаружения субпопуляций ADAM10/ADAM17 экзосом в плазме больных ПТК и больных КРР (рисунок 12 а).
Распределение субпопуляций ADAM10/ADAM17 у больных ПТК и больных КРР оказалось сходным (рисунок 12 б, в). Субпопуляция ADAM10-ADAM17- преобладала в обеих группах (КРР - 88±4,4 (%) и ПТК - 77±3,85 (%), р 0,05) по сравнению с другими субпопуляциями экзосом.
Выявлены статистически значимые различия в уровне ADAM10+ADAM17-экзосом у больных ПТК по сравнению с больными КРР: 12±0,6 (%) и 7±0,35 (%) соответственно, (р 0,05) (рисунок 13).
Для анализа субпопуляций ММР и EMMPRIN в экзосомах выполняли проточную цитометрию с использованием латексных частиц, покрытых антителами к CD9. Стратегия гейтирования представлена на рисунке 14.
Поскольку наиболее часто в экзосомах больных КРР и больных ПТК экспрессировалась ММР9, акцент в работе сделан на изучение субпопуляций ММР9-позитивных экзосом (таблица 2). Выявлено, что ММР9-позитивные экзосомы в плазме крови чаще встречались у больных КРР, однако трипл-позитивные экзосомы экпрессирующие как ММР9, так и ММР2 и EMMPRIN чаще встречались у больных ПТК. Как у больных ПТК, так и у больных КРР доминировала популяция ММР9+ММР2-EMMPRIN-экзосом (до 73)
Эффективность определения 20S протеасом, MMP9+, MMP9+MMP2+EMMPRIN+ и ADAM10+ADAM17- субпопуляций экзосом была оценена с помощью ROC-анализа. Наибольшей эффективностью в отношении прогноза онкологического риска у больных ПТК обладает процент MMP9+ экзосом среди всех экзосом плазмы крови с чувствительностью 95% и специфичностью 53% (AUC = 0.840±0.97, p 0,05, 95%ДИ = 0,650 – 1,000) (рисунок 15).
Дополнительные факторы прогноза местно-распространенного колоректального рака, а также факторы риска гематогенного метастазирования
Двухлетние результаты прослежены у 60 больных с локализованным и местно-распространенным КРР. Поскольку у больных локализованным КРР не было случаев прогрессирования заболевания, дополнительные прогностические факторы, ассоциированные с уровнем 20S протеасом и субпопуляциями тетраспанинов и протеаз, были выявлены только в группе больных местно-распространенным КРР. Среди 30 больных местно-распространенным КРР: живы 23 (76%) пациента, летальный исход зафиксирован в 7 (24%) случаях. У 9 (32%) пациентов наблюдался рецидив заболевания.
Сроки динамического наблюдения составили от 5 до 40 месяцев, средний срок наблюдения составил 20±2,3 месяца. Среднее время до рецидива составило 14±1,4 месяцев от момента окончания хирургического или комбинированного лечения.
В таблице 15 представлены результаты однофакторного анализа прогностических параметров у больных местно-распространенным КРР.
В отношении общей выживаемости информативными прогностическими признаками явились уровень 20S протеасом и MMP9+ субпопуляция (рисунок 21). Наибольшую информативную ценность для оценки безрецидивной выживаемости больных имели показатели содержания 20S протеасом, ADAM10+ADAM17- и MMP9+MMP2+EMMPRIN+ субпопуляций экзосом плазмы крови (рисунок 22).
Для оценки риска гематогенного метастазирования у больных КРР был использован многофакторный логистический регрессионный анализ. В анализ были включены следующие качественные и количественные признаки: возраст, пол больных, локализация и степень дифференцировки опухоли, уровень 20S протеасом, субпопуляции тетраспанинов и протеаз экзосом плазмы крови больных КРР. По результатам анализа выявлено, что риск возникновения гематогенных метастазов связан только со степенью дифференцировки опухоли, а субпопуляции тетраспанинов и протеаз экзосом не являются предикторами гематогенного метастазирования.