Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы, молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы 12
1.1. Общие закономерности взаимодействия опухоли и иммунной системы 12
1.2. Причины иммуногенности опухолевых клеток и стратегии иммунного распознавания опухолей 15
1.3. Распознавание опухолей Т-лимфоцитами 21
1.4. Опухолевые антигены как мишень противоопухолевой иммунотерапии 24
1.4.1. Опухолевые антигены - продукты онкобелков и мутированных опухолевых супрессоров 25
1.4.2. Опухолевые антигены, происходящие из молекул, создающих селективное преимущество для опухолевой клетки 26
1.4.3. Опухолевые антигены, появляющиеся в результате нестабильности генома опухолевой клетки и опухолевой катаплазии 27
1.5. Формирование и реализация противоопухолевого иммунного ответа 28
1.6. Принципы рациональной иммунотерапии опухолей 37
1.7. Механизм действия цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих ГМ-КСФ 39
1.8. Разновидности цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих ГМ-КСФ 41
1.9. Комбинирование как способ повышения эффективности вакцинотерапии опухолей49
2. Материалы и методы 53
2.1. Клеточные линии и их культивирование 53
2.2. Трансфекция и получение стабильно трансфицированных клонов 54
2.3. Определение ГМ-КСФ в супернатантах клеточных линий 54
2.4. Инактивация клеток ионизирующим облучением 55
2.5. Определение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток 56
2.6. Экспериментальные животные 56
2.7. Схемы иммунизации мышей и трансплантации опухолевых клеток 57
2.8. Иммунизация мышей 58
2.9. Трансплантация опухолевых клеток и учет динамики роста опухоли 58
2.10. Статистическая обработка результатов 59
3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1. Получение и характеристика цельноклеточной вакцины 60
3.1.1. Получение стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы B16-F10 и меланомы Клаудмана891-М3 61
3.1.2. Изучение влияния гамма-облучения на пролиферативный потенциал стабильно трансфицированных клеток 62
3.1.3. Влияние гамма-облучения на секрецию ГМ-КСФ стабильно трансфицированными опухолевыми клетками 65
3.1.4. Влияние секреции рекомбинантного ГМ-КСФ на туморогенность клеток стабильно трансфицированных клонов 66
3.1.5. Обсуждение полученных результатов 68
3.1.6. Заключение по разделу 70
3.2. Сравнение эффективности иммунотерапии цельноклеточными ГМ-КСФ-
секретирующими вакцинами опухолей различной иммуногенности 71
3.2.1. Изучение эффективности противоопухолевой вакцинации клетками BG10 в сингенной системе 71
3.2.2. Изучение эффективности противоопухолевой вакцинации клетками BG10 в аллогенной системе 72
3.2.3. Изучение эффективности противоопухолевой иммунизации вакциной на основе клеток MG10 в сингенной системе 74
3.2.4. Изучение эффективности противоопухолевой иммунизации вакциной на основе клеток MG10 в аллогенной системе 75
3.2.5. Изучение противоопухолевого эффекта вакцин на основе клеток BG10 и MG10 на гибридных мышах BDF1 77
3.2.6. Обсуждение полученных результатов 79
3.2.7 Заключение по разделу 83
3.3. Изучение факторов, обуславливающих эффективность противоопухолевой иммунотерапии ГМ-КСФ-секретирующими клеточными вакцинами в режиме профилактического применения 84
3.3.1. Влияние кратности иммунизации на противоопухолевый эффект 84
3.3.2. Влияние количества секретируемого клетками вакцины ГМ-КСФ на эффективность сингенной противоопухолевой вакцинации 85
3.3.3. Влияние количества секретируемого клетками вакцины ГМ-КСФ на эффективность аллогенной иммунопрофилактики меланомы B16-F10 86
3.3.4. Влияние режима вакцинации на противоопухолевый эффект 88
3.3.5. Обсуждение результатов 90
3.3.6. Заключение по разделу 94
3.4. Увеличение эффективности противоопухолевой вакцинотерапии путем комплексного применения различных клеточных линий в составе вакцины 95
3.4.1. Повышение эффективности аллогенной иммунизации за счет введения в состав вакцины сингенных опухолевых клеток 95
3.4.2. Изучение влияния источника рекомбинантного цитокина при вакцинации смесью нескольких линий 96
3.4.3. Увеличение эффективности противоопухолевой вакцинации при помощи сочетания в составе вакцины линий продуцирующих различные цитокины 98
3.4.4. Изучение продолжительности эффекта комбинированной противоопухолевой вакцинации и возможностей пролонгировать эффект повторным введением вакцины 99
3.4.6. Заключение по разделу 106
4. Заключение 107
5. Выводы по
Список литературы 111
- Причины иммуногенности опухолевых клеток и стратегии иммунного распознавания опухолей
- Опухолевые антигены как мишень противоопухолевой иммунотерапии
- Трансфекция и получение стабильно трансфицированных клонов
- Влияние гамма-облучения на секрецию ГМ-КСФ стабильно трансфицированными опухолевыми клетками
Введение к работе
Актуальность работы
Эффективность методов лечения злокачественных новообразований значительно возросла за последние десять лет. Появились препараты, активность которых основана на принципиально новых механизмах действия: ингибиторы протеасомальной деградации белков, антиангиогенные средства, ингибиторы сигнальных путей, поддерживающих злокачественный фенотип опухолевой клетки [51, 39, 42]. Кроме этого, эффективность известных противоопухолевых препаратов значительно увеличилась благодаря разработке новых лекарственных форм, применению их более совершенных аналогов, а также схем комбинированной терапии [130].
Вместе с тем, онкологические заболевания по-прежнему являются одной из наиболее распространенных причин смерти в Европе и Северной Америке [3]. Происходит это отчасти в силу того, что большинство фармакологических методов терапии опухолей, несмотря на новизну механизмов действия, оказывают влияние не только на опухолевые клетки, но и на нормальные клетки организма, для которых свойственна интенсивная пролиферация: эпителий кишечника, клетки иммунной системы. Воздействие противоопухолевых препаратов на нормальные клетки обуславливает побочные токсические явления, что ограничивает их применение и снижает эффективность. С другой стороны, препараты, обладающие чрезвычайно высокой избирательностью действия, становятся «заложниками» присутствия в опухолевых клетках конкретной белковой молекулы. В тоже время, происходящая в опухоли селекция, порождает клоны клеток с мутированной молекулой-мишенью, которые полностью теряют чувствительность к препарату [137].
Известно, что при терапии опухолевых заболеваний основной проблемой является не подавление первичного локального процесса, а предотвращение рецидивирования и метастатической диссеминации опухоли. Распространенным сценарием является эффективный курс терапии при первичном обращении пациента по поводу онкологического заболевания и последующее рецидивирование процесса с повторным обращением через год или более [139]. Химиотерапия и все иные современные методы противоопухолевой терапии эффективны на начальной стадии заболевания, однако не могут быть применены для контроля минимальной остаточной болезни и профилактики рецидивирования в силу токсичности и селекции устойчивых клонов опухолевых клеток.
Идеальное средство, предназначенное для профилактики рецидивов онкологических заболеваний должно обладать рядом качеств, а именно: минимальным побочным
действием, длительностью противоопухолевого эффекта, а также способностью подавлять возникновение устойчивых опухолевых клонов. Примечательно, что эти же критерии характеризуют феномен иммунологической памяти - состояние активности иммунной системы, поддерживающее резистентность организма к повторному заражению [188]. Современные данные достоверно подтверждают способность иммунного ответа не только бороться с инфекционными заболеваниями, но и подавлять рост опухоли, а в некоторых случаях, обуславливать стойкую ремиссию пациентов, иммунных к антигенам неопластических клеток [139].
В основе иммунологических механизмов подавления роста опухоли лежит способность лимфоцитов к цитотоксическому действию в отношении клеток, экспонирующих на своей поверхности опухолевые антигены. Также установлено, что значимыми молекулами для реализации противоопухолевого иммунитета являются интерферон-гамма и его рецептор, экспрессируемый на клетках опухолевой стромы. Это позволяет предполагать, что противоопухолевый эффект иммунотерапии связан с цитотоксическим действием лимфоцитов в отношении опухолевых клеток и с локальным воздействием секретируемых лимфоцитами цитокинов, которые нарушают формирование опухолевого микроокружения [91].
Факторам противоопухолевого иммунитета противостоят защитные системы опухолевых клеток, опосредуемые растворимыми и поверхностными иммуносупрессорными молекулами [10, 171, 177], а также способность опухолевых клеток избегать инструктивного апоптоза [2, 156]. Взаимодействие противоопухолевого иммунного ответа и иммуносупрессивных факторов опухоли образует своего рода равновесие, поддерживаемое постоянным давлением иммунного ответа, с одной стороны, и селекцией иммунорезистентных опухолевых клонов, с другой.
Пластичность фенотипа опухолевых клеток и способность иммунитета селективно уничтожать определенные субклоны делает иммунную систему не только и не столько противоопухолевой защитой, сколько основной системой, формирующей фенотип опухолевых клеток [56]. Закономерным результатом этой селекции является появление опухолевых клеток не только резистентных к противоопухолевому иммунитету, но и использующих его для стимуляции роста и прогресии [101]. На уровне организма появление резистентных клеток и неспособность иммунной системы контролировать рост опухоли сопровождается прогрессией заболевания и появлением метастатических очагов: состоянием, в котором большая часть пациентов попадает на приём к врачам-онкологам.
Вместе с тем, баланс между опухолью и иммунитетом можно изменить при помощи стимуляции иммунного ответа вакцинами, или пассивного переноса антител или
противоопухолевых лимфоцитов. Значительные успехи в иммунотерапии опухолей достигнуты при помощи переноса противоопухолевых Т-лимфоцитов, а также вакцин на основе аутологичных дендритных клеток и аллогенных цельноклеточных генно-инженерных вакцин, секретирующих рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) [94,103,151].
Из методов эффективной иммунотерапии опухолей наиболее технологичным является вакцинотерапия - введение в организм опухолевых антигенов в комплексе с адъювантами, способствующими развитию специфического противоопухолевого иммунитета. Адъюванты способны изменять иммунологический контекст, в котором опухолевые антигены встречаются с иммунной системой: в таком окружении нивелируется иммуносупрессорное воздействие опухоли, а также создаются оптимальные условия для формирования эффективного иммунитета против иммуногенных опухолевых антигенов.
Хорошими адъювантами являются различные факторы, обеспечивающие активацию иммунной системы (двуспиральная РНК вирусов, липополисахарид и протеогликаны бактериальной мембраны и др.) и некоторые цитокины, секретируемые при такой активации. Прямым сравнением было показано, что усиления противоопухолевой активности вакцинотерапии можно достичь, используя в качестве адъювантов ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-1, ИЛ-7, фактор стволовых клеток, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, однако наибольшей активностью обладает ГМ-КСФ [52].
Опыт клинического применения ГМ-КСФ-секретирующих вакцин из транзиторно трансфицированных аутологичных опухолевых клеток пациентов подтвердил эффективность такого вида биотерапии опухолей человека. Позитивные клинические изменения были получены у 25-30% пациентов с III и IV стадией меланомы, недостаточно отвечающих на предшествующие курсы химиотерапии [165, 166]. Дополнительным преимуществом вакцин, секретирующих ГМ-КСФ, оказались хорошая переносимость и широкий (в сравнении с ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, интерфероном-гамма) интервал терапевтических доз [157].
В то же время, противоопухолевая вакцинация оказалась недостаточно эффективной в качестве самостоятельного средства терапии злокачественных новообразований. Сложившаяся ситуация подталкивает исследователей к поиску более эффективных комбинаций иммунотерапевтических методов с радио- и химиотерапией, а также к сочетанному применению иммунопрепаратов, воздействующих на разные этапы формирования и реализации противоопухолевого иммунного ответа.
Цель работы:
Изучение специфической активности клеточных генно-инженерных противоопухолевых вакцин, секретирующих ГМ-КСФ и разработка способов повышения эффективности иммунотерапии опухолей.
Задачи работы:
Разработать экспериментальную модельную систему для доклинического изучения эффективности противоопухолевой иммунотерапии мышей.
Получить стабильно трансфицированные геном ГМ-КСФ линии клеток меланомы мышей с высоким уровнем продукции ГМ-КСФ и разработать рациональные подходы к созданию на их основе противоопухолевых вакцин.
Изучить эффективность иммунотерапии опухолей генно-инженерными клеточными вакцинами в зависимости от характеристик вакцины и особенностей экспериментальной модели опухоли.
Оценить возможность повышения активности генно-инженерных вакцин, оптимизируя антигенный спектр включением в их состав клеток различных опухолей.
Изучить возможности повышения эффективности противоопухолевой иммунотерапии путем применения вакцин, состоящих из смеси клеточных линий, экспрессирующих различные цитокины.
Научная новизна
В настоящем исследовании впервые разработана экспериментальная модельная система для доклинического изучения эффективности иммунотерапии меланомы ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами. Впервые проведено корректное сравнение эффективности иммунопрофилактики низкоиммуногенной меланомы В16 и высокоиммуногенной меланомы М-3 иммунотерапии ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами в сингенном и аллогенном режиме. Впервые для разработанного типа вакцин проанализировано значение аллогенной стимуляции для индукции эффективного противоопухолевого иммунного ответа.
Впервые показана недостаточная эффективность аллогенной ГМ-КСФ-секретирующей клеточной вакцины на основе генно-модифицированных клеток линии М-3 для иммунопрофилактики меланомы B16-F10. Установлено, что включение в состав аллогенной вакцины инактивированных немодифицированных сингенных опухолевых клеток повышает эффективность применения вакцины до уровня эффективности сингенной вакцины.
Впервые изучена эффективность комбинированных клеточных вакцин, состоящих из смеси клеток, продуцирующих белки Tag-7 и ГМ-КСФ. Показан синергизм
адьювантной активности этих молекул в составе генно-модифицированных клеточных вакцин.
Научно-практическая значимость
Выполненная работа выявила недостаточность совпадения спектров опухолевых антигенов вакцины и опухоли -мишени для эффективной иммунопрофилактики экспериментальной меланомы, что должно найти отражение в клинической практике использования аллогенных ГМ-КСФ-секретирующих вакцин. Изучение эффективности иммунопрофилактики в модельных системах показало, что наиболее универсальным и эффективным средством вакцинотерапии опухолей являются байстендерные вакцины, состоящие из смеси аллогенных клеток, секретирующих ГМ-КСФ и клеток сингенной опухоли.
Изучение вакцины на основе смеси клеток продуцирующих Tag-7 и ГМ-КСФ выявило увеличение эффективности комбинированной вакцины по сравнению с вакцинами, состоящими из клеток, продуцирующих один из цитокинов. Применение подобной вакцины для иммунотерапии пациентов со злокачественной меланомой способно повысить эффективность вакцинотерапии.
В настоящее время в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина проходят ограниченные испытания вакцины на основе аллогенных опухолевых клеток, продуцирующих Tag-7 человека, также вакцины на основе аллогенных клеток меланомы человека, секретирующих ГМ-КСФ человека. Результаты настоящей работы, посвященной доклиническому изучению вакцин на основе опухолевых клеток, генетически модифицированных генами иммунологически активных молекул, учитываются при проведении клинических испытаний.
Причины иммуногенности опухолевых клеток и стратегии иммунного распознавания опухолей
Причиной и основной движущей силой опухолевого роста и прогрессии является нестабильность генома опухолевых клеток и обусловленная этим чрезвычайная пластичность их свойств. Происходящая в опухоли селекция наиболее приспособленных клонов позволяет рассматривать это заболевание как эволюционный процесс, в силу каких-то причин происходящий в отдельном организме [129]. Результатом опухолевой прогрессии является накопление мутационных изменений1, приводящих к появлению новых молекул или исчезновению молекул, присущих нормальным клеткам, причем количество таких мутаций может достигать десятков тысяч в одной клетке [175]. Появление в опухолевых клетках новых молекул обеспечивает возможность отличать трансформированные клетки от нормальных при помощи факторов адаптивного иммунитета, причем, чем больше атипичных молекул встречается в неопластической клетке, тем большее количество Т- и В-клеточных клонов может быть вовлечено в противоопухолевый ответ. Одновременно, пластичность фенотипа позволяет опухоли достаточно легко отбирать варианты клеток, которые не несут антигенных детерминант, либо молекул необходимых для их презентации, либо же подавляют эффекторную часть иммунного ответа. Таким образом, генетическая нестабильность является одновременно причиной возникновения иммуногенности опухолей и причиной, по которой опухоль чрезвычайно сложно контролировать как иммунологическими, так и любыми другими терапевтическими средствами.
Следствием генетической нестабильности опухолевых клеток и происходящей в опухоли селекции является приобретение неопластическими клетками ряда свойств, отличающих их от клеток нормальных тканей [5,81,107]: независимость пролиферации от внешних стимулов; резистентность к рост-ингибирующим сигналам; устойчивость к апоптозу; способность к неограниченному числу делений; способность изменять микроокружение; способность к инвазии и метастазированию.
Очевидно, что приобретаемые трансформированной клеткой свойства создают для таких клеток селективное преимущество, однако, одновременно эти свойства вступают в противоречие с нормальной клеточной физиологией. Показано, что в подавляющем большинстве опухолевых клеток наблюдается постоянная активность сигнальных каскадов, сообщающих о различных нарушениях клеточного метаболизма. В нормальных клетках такие сигналы приводят к остановке пролиферации и запуску репаративных процессов, а в случае невозможности последних - к активации программируемой клеточной гибели. Инактивация в опухолевых клетках белка р53 и других молекул, участвующих в реализации остановки клеточного цикла и апоптоза, приводит к отмене этих событий, однако не прекращает сигнализацию о нарушениях [31,126].
Одним из последствий активации данных сигнальных каскадов является экспрессия на поверхности клеток так называемых стресс-индуцированных молекул MICA и MICB, относящихся к семейству неканонических молекул гистосовместимости 1с класса [70, 74]. В частности показано, что экспрессия этих молекул активируется в результате повреждающих ДНК воздействий [67], а также в результате аномального пролиферативного сигнала, возникающего при активирующих мутациях в киназных доменах цитоплазматической части рецепторов ростовых факторов [74]. Кроме этого, одним из основных факторов, индуцирующим поверхностную экспрессию молекул MICA/B, является инфицирование клетки вирусами [199]. Примечательно, что, при вирусной инфекции, экспрессия молекул MICA/B является событием гораздо более ранним, нежели появление эпитопов из вирусных белков, интегрированных в молекулы МНС, и, в сущности, оказывается первой иммунологической манифестацией вирусной инфекции. Более того, показано, что и при неоплазиях экспрессия этих молекул также является одним из самых ранних событий, проявляющихся в процессе злокачественной трансформации клеток [Р. Меджитов, данные не опубликованы].
Представленные на клеточной поверхности стресс-индуцированные молекулы распознаются рецептором NKG2D, который несут все NK-клетки, а также большинство у5Т-лимфоцитов и часть CD8+ аВТ-лимфоцитов [12, 76]. Этот рецептор лимфоцитов не имеет собственных сигнальных последовательностей в цитоплазматической части, но функционирует в связи с адаптерными молекулами DAP10 [192]. Адаптерные молекулы воспринимают импульс, возникающий при связывании рецептора NKG2d на поверхности лимфоцитов со стресс-индуцированными молекулами на поверхности клеток-мишеней, и осуществляют дальнейшую передачу сигнала, который индуцирует цитотоксическое действие лимфоцита [12]. Таким образом, экспрессия стресс-индуцированных молекул должна приводить к иммунологическому уничтожению трансформированной или зараженной вирусом клетки. Данный феномен может являться свидетельством эволюционно сформированного механизма иммунного надзора, что достоверно подтверждается, по крайней мере для опухолей, возникающих под действием ультрафиолетового облучения [70, 100].
Опухолевые антигены как мишень противоопухолевой иммунотерапии
К первой группе можно отнести большинство уникальных антигенов, появляющихся в клетке в результате мутаций, приобретаемых в процессе злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. Поскольку продукты измененных генов атипичны для организма, они являются сильными антигенами. Следует учитывать, что в данном случае понятие антиген можно применять не столько к самому белку, сколько к распознаваемому Т-клетками пептидному фрагменту - эпитопу.
Возможность использования мутированных онкобелков в качестве мишеней иммунотерапии опухолей является воплощением мечты о «золотой пуле» Эрлиха: такие молекулы обязательно присутствуют в опухолевых клетках и присутствуют только в них. Опухоль не может ускользнуть от иммунного ответа при помощи формирования клонов, не экспрессирующих антиген, так как онкобелки необходимы для поддержания трансформированного фенотипа и, следовательно, опухолевая клетка не может существовать без них.
Однако, использование антигенов данной группы существенно затруднено возникновением измененных молекул в результате случайных, как правило, точечных мутаций. Подобные антигены в большинстве случаев уникальны или встречаются крайне редко. Как следствие, для терапии требуется персонализированный иммунопрепарат. Важен вопрос иммуногенности мутантных белков: поскольку в результате мутации, как правило, появляется только единичная аминокислотная замена, то мутированные белки могут не давать иммуногенных эпитопов. Это может происходить в результате того, что появляющаяся мутация находится в области, не способной к протеасомальной деградации с образованием пептида. Или же в результате того, что аминокислотная замена происходит в той области белка, которая, деградируя в протеасомах, дает пептид, не способный связываться с молекулами МНС [77]. Иммуногенные эпитопы мутированных опухолевых супрессоров еще более редки, так как многие мутации приводят к утрате экспрессии соответствующего белка, однако, могут наблюдаться, например, при трансляции нетранслируемых областей в результате сдвига рамки считывания [32].
Тем не менее, существует достаточное количество примеров иммуногенных эпитопов из мутированных B-raf, K-RAS, N-RAS, beta-catenin, CDK4, каспазы-8 и других онкогенов [45, 189]. В случае, если при помощи иммунотерапии удается стимулировать иммунный ответ на антигены данной группы, то результатом может быть стабильная продолжительная ремиссия или даже полное выздоровление [17]. Вероятно, именно это является причиной высокой эффективности противоопухолевой вакцинации препаратами на основе собственных клеток: пациенты, получающие персонализированный препарат, развивают иммунный ответ в отношении собственных уникальных опухолевых антигенов, что позволяет успешно подавлять опухолевый рост [115].
К антигенам второй группы можно отнести целый ряд молекул, экспрессия которых создает селективное преимущество для опухолевых клеток. Наиболее ярким примером является антиген ERBbll - один из вариантов рецептора эпидермального фактора роста -EGF. Повышенная экспрессия HER2/neu характерна для опухолей эпителиального происхождения, в особенности для клеток эпителиальных опухолей молочной железы [33]. Поскольку антиген практически не экспрессируется в нормальных тканях, было предложено использовать иммунный ответ против этого антигена для терапии экспрессирующих его опухолей. В настоящее время разработан и эффективно применяется в клинической практике лекарственный препарат «Герцептин» -представляющий собой гуманизированные моноклональные антитела к HER2/neu [158]. Основой эффективности препарата является то, что будучи экспрессированным на поверхности опухолевой клетки, данный белок усиливает пролиферативный и антиапоптотический сигналы, индуцируемые в клетке в ответ на связывание EGF. Варианты опухолевых клеток, вынужденные терять поверхностную экспрессию ERBbll, теряют и преимущества в виде защиты от апоптоза и усиленной пролиферации [116].
Факторами, сопутствующими успеху иммунотерапии, направленной против опухолей, экспрессирующих HER2, является то, что антиген должен присутствовать именно на поверхности клеток для того, чтобы белок мог выполнять свою функцию [116]. Облигатная поверхностная локализация дает возможность использовать гуморальный иммунный ответ и сужает возможности формирования резистентных клонов.
Другие антигены данной группы, такие как WT1 и Survivin, являются сугубо внутриклеточными белками и потому иммунный ответ, направленный на них, полностью зависит от Т-клеточного распознавания и механизмов презентации [9]. Как следствие, могут появляться опухолевые клетки, в которых сохранена экспрессия белка, однако нарушена система презентации антигенов Т-клеткам: такие клетки полностью резистентны к противоопухолевым Т-лимфоцитам и при этом сохраняют внутриклеточную экспрессию необходимого им антигена [8].
Трансфекция и получение стабильно трансфицированных клонов
Для учета формирования колоний клеток резистентных к гамма-облучению, инактивированные клетки культивировали 35 дней со сменой среды через каждые 3-4 дня. Формирование колоний и их подсчет проводили в инвертированном световом микроскопе DMIL (Leica Microsystems, Германия), за колонию принимали группу не менее чем 20 живых клеток одинаковой морфологии, расположенных в непосредственном контакте друг с другом.
Для учета количества жизнеспособных клеток на разные дни после облучения, инактивированные облучением в различных дозах и необлученные клетки высевали в 96-ти луночные планшеты в триплетах в различной плотности. Жизнеспособность клеток определяли по их метаболической активности при помощи набора CellTiter 96 AQue0us Cell Proliferation Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя. К исследуемым образцам и контрольным лункам добавляли по 20 мкл реагента MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) через 3 часа определяли оптическую плотность (OD490) в лунках.
Эксперименты с трансплантированными опухолями были проведены на мышах линии С57В1/6 (гаплотип Н-2Ь), мышах линии DBA/2 (гаплотип H-2d) и BDFi - гибридах первого поколения C57BI/6 х DBA/2 (комбинированный гаплотип H-2b/d). У мышеи линии C57BI/6 отсутствуют локусы Н-2Еа и H-2L, у мышей линии DBA/2 сохранены все классические гены, кодирующие антигены главного комплекса гистосовместимости I и II классов (табл. 2).
Для проведения части экспериментов были использованы гибридные мыши первого поколения BDFi (C57BI/6 х DBA/2). Эти мыши имеют два аллельных варианта генов гистосовместимости гаплотипов Н-2 и Н-2 , экспрессирующиеся в виде двух разных вариантов поверхностных белковых молекул главного комплекса гистосовместимости. Все животные были получены из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая». В экспериментах использовали мышей-самцов 8-12 недельного возраста, массой 20-25 г. вводимые клетки были аллогенными по отношению к животным и вызывали реакцию факторов, обуславливающих аллоиммунитет. Мыши DBA/2 относятся к гаплотипу H-2d, таким образом, по отношению к этим животным, клетки линии S91-M3 (гаплотип H-2d) являются сингенными, а клетки линии B16-F10 (гаплотип Н-2Ь) - аллогенными. Согласно этому проводили иммунизацию животных линии DBA/2: сингенно - при помощи клеток линии S91-M3 или клеток ГМ-КСФ-секретирующего клона MG, либо же аллогенно - при помощи клеток B16-F10 или клонов BG.
Непосредственно перед началом иммунизации клетки линий B16-F10 и S91-M3, клонов MG и BG, снимали с поверхности культурального пластика раствором трипсина и двукратно отмывали в полной среде DMEM. Далее клетки переносили во флаконы для облучения в концентрации 107 клеток в мл и облучали в дозе 50 Гр на источнике гамма-облучения в клинике экспериментальной терапии ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. После облучения клетки дважды отмывали бессывороточной средой 199 и ресуспендировали в этой среде в концентрации 107 клеток в мл и вводили экспериментальным животным подкожно, в область левой подмышечной впадины по 106 клеток в 100 мкл культуральной среды.
Клетки для трансплантации, предварительно выращивали in vitro в стандартных условиях. Непосредственно перед введением клетки снимали с поверхности культурального пластика раствором трипсина, дважды отмывали в бессывороточной среде 199 и ресуспендировали в ней в концентрации 106 клеток в мл для B16-F10, либо же 107 клеток в мл для МЗ. Для индукции опухолей животным линии C57BI/6 трансплантировали по 105 клеток линии B16-F10 (что составляет для данных животных 10 TDioo) в 100 мкл суспензии подкожно, в область правой подмышечной впадины. Для индукции опухолей у мышей линии DBA/2 использовали 106 клеток линии S91-M3, что также составляет для данных животных 10 трансплантационных доз 100 (ТОюо). Гибридным мышам (BDFi) для формирования опухолей вводили в разных экспериментах как клетки S91-M3, так и клетки B16-F10. Через 5 дней после трансплантации и далее через каждые 2-3 дня животных обследовали на наличие пальпируемых опухолей в области введения клеток. Формирующиеся опухоли измеряли дважды в неделю, объем опухоли определяли по формуле V=DmaxxDix(Dmax/2), где Dmax равен максимальному диаметру опухоли, a Di - диаметру перпендикулярному максимальному. Отмечали сроки достижения опухолями линейного размера 15 мм в любом измерении, а также сроки гибели животных.
Анализ динамики роста опухолей у экспериментальных животных проводили с расчетом среднего значения объема опухоли у мышей экспериментальной группы и ошибки среднего. Статистическую достоверность различий объема опухолей между контрольной и опытной группами определяли по методу ANOVA.
Для анализа выживаемости экспериментальных мышей применяли программное обеспечение GraphPad PRIZM v4.03 (GraphPad Software INC., США). Анализ и представление результатов проводили по методу Каплана-Майера, достоверность различий проверяли при помощи log-rank теста.
Влияние гамма-облучения на секрецию ГМ-КСФ стабильно трансфицированными опухолевыми клетками
В результате работы по генетической модификации клеток двух клеточных линий мышиной меланомы было получено два набора клонов клеток, секретирующих различные количества рекомбинантного ГМ-КСФ. Уровень продукции ГМ-КСФ оставался стабильным без признаков снижения при пассировании с добавлением селективного антибиотика в течение 12 месяцев.
Для получения продуктивных клонов потребовалась трансфекция и отбор нескольких сотен первичных клонов каждой линии, однако, даже при такой выборке, продуктивность исходных клонов составляла менее 10 нг. Секреции клетками вакцины менее чем 10 нг ГМ-КСФ недостаточно для получения стабильных позитивных результатов иммунотерапии [93], поэтому для дальнейшей работы исходные клоны были подвергнуты дополнительной селекции.
Было установлено, что облучение опухолевых клеток, как генетически модифицированных клонов, так и исходных линий, вызывает дозозависимую остановку клеточного деления. У подавляющего большинства облученных клеток происходит утрата способности к делению, в то время как другая, незначительная часть клеток, прекращая пролиферацию на некоторое время, восстанавливает способность делиться через 14-25 дней после облучения. Эти данные находятся в корреляции с известными из литературы примерами, когда было продемонстрировано, что увеличение дозы облучения драматически уменьшает количество пролиферирующих клеток, но не сводит их численность к нулю [7].
Полученные нами результаты дают основания предполагать, что восстановление способности к делению происходит скорее в результате случайного события, происходящего в обыкновенной клетке, нежели существования в популяции некоторого количества радиорезистентных клеток. Получаемая клетками доза облучения регулирует медиану выживаемости клеток и тем самым косвенно, но не напрямую, обуславливает появление в облученной популяции делящихся клеток. Таким образом, возможен подбор такой минимальной дозы облучения, при которой предположительно абсолютно все клетки в определенном образце будут инактивированы, и такая минимальная инактивирующая доза будет зависеть от количества клеток в облучаемом образце.
Несмотря на явные изменения морфологии клеток после гамма-облучения, часть базисных метаболических функций остается на прежнем уровне, что коррелирует с результатами, полученными при анализе последствий гамма-облучения при помощи ДНК микрочипов [164]. Мы показали, что гамма-облучение в дозах до 100 Гр не отменяет способности генетически модифицированных клеток к синтезу и секреции трансгенного цитокина. Напротив, количество ГМ-КСФ, секретируемого облученными клетками, возрастает на протяжении 15 дней с момента облучения. Такое повышение продуктивности происходит постепенно, причем прирост зависит от дозы облучения. Положительная регуляция экспрессии трансгена может происходить в результате встраивания генетической конструкции в непосредственной близости от участков генома, кодирующих белки, участвующие в репаративных процессах, экспрессия которых усиливается после гамма-облучения.
Нами установлено, что после трансфекции опухолевых клеток и приобретения ими способности секретировать ГМ-КСФ, клетки клонов сохраняют туморогенность. При трансплантации мышам сингенных ГМ-КСФ-секретирующих клеток стабильно трансфицированных клонов, опухоли формируются у всех животных. Скорость роста таких опухолей значительно снижена по сравнению со скоростью роста опухолей, формирующихся в результате трансплантации такого же количества не модифицированных клеток, однако, рост опухолей приводил к летальному исходу вне зависимости от наличия трансгена в трансплантируемых клетках.
Различия в скорости роста опухолей, формирующихся после трансплантации клеток трансгенных клонов и немодифицированных клеток, вероятно, являются следствием процессов в организме животных, замедляющих увеличение числа опухолевых клеток на ранних сроках после введения ГМ-КСФ-секретирующего клона. Наиболее вероятным объяснением различий в туморогенности исходной линии и клона представляется способность последнего стимулировать противоопухолевый иммунный ответ. В пользу такой возможности говорит и то, что эффект гораздо более выражен для высокоиммуногенной линии М-3, нежели для низкоиммуногенной линии B16-F10.
Сохранение (на более низком уровне) туморогенности клеток трансфицированного ГМ-КСФ-секретирующего клона, указывает на сохранения основных свойств опухолевой клетки после генетической модификации и обеспечивает возможность использования полученных клонов в качестве противоопухолевой вакцины.
В результате проделанной работы нами получено два набора клонов линий мышиной меланомы М-3 (MG10 и MG50) и мышиной меланомы B16-F10 (BG10 и BG50), продуцирующих и секретирующих рекомбинантный ГМ-КСФ. Продукция клонов составила 10 нг ГМ-КСФ за 24 часа в расчете на 106 клеток для клеток MG10 и BG10 и 50 нг для MG50 и BG50, соответственно.
При облучении клеток на источнике гамма-излучения в дозе от 20 до 100 Гр экспрессия трансгенного белка в стабильно трансфицированных опухолевых клетках возрастает в диапазоне терапевтических значений. Инактивация клеток, осуществляемая с использованием гамма-облучения, способна надежно предотвращать пролиферацию генетически модифицированных опухолевых клеток, что позволяет безопасно применять живые клетки для вакцинотерапии.
Разработка вакцин на основе клеток линии B16-F10 и М-3 позволила провести как сингенную, так и аллогенную вакцинацию клетками низко- и высокоиммуногенных опухолей. Получение цельноклеточных вакцин на основе двух разных линий клеток, позволяет использовать две различные модельные системы для оценки эффективности иммунопрофилактики. Опухоли, возникающие в результате трансплантации мышам линии C57BI/6 опухолевых клеток линии B16-F10, относят к низкоиммуногенным, в то время как, опухоли у мышей линии DBA/2, формирующиеся в результате трансплантации им сингенных клеток линии М-3, считают высокоиммуногенными [93]. Для того, чтобы изучить возможное влияния модельной системы на эффекты, наблюдаемые при иммунопрофилактике опухолей, выполнены эксперименты, в которых сравнена эффективность профилактической иммунизации животных в отношении низко- и высокоиммуногенных опухолей.
Эффективность сингенной иммунопрофилактики меланомы В16 оценивали путем иммунизации сингенных мышей клетками ГМ-КСФ секретирующего клона BG10 и последующей трансплантации иммунизированным животным сингенных опухолевых клеток. Одну из экспериментальных групп сравнения иммунизировали немодифицированными инактивированными клетками меланомы, контрольных животных не иммунизировали (рис. 9).
