Введение к работе
Актуальность темы
Процесс канцерогенеза представляет огромный интерес для фундаментальной молекулярной биологии и онкологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения механизмов регуляции клеточной жизнедеятельности, до сих пор до конца не изученные даже в норме. Одной из наиболее актуальных проблем является идентификация белков, которые участвуют во внутриклеточных сигнальных путях, изменяющихся при прогрессии заболевания. Исследование таких нарушений может в будущем привести к разработке новых мишеней для направленной терапии.
В отношении большинства малых ГТФаз семейства Ras накоплен огромный экспериментальный материал, касающийся их участия в злокачественной трансформации клеток. Однако белок Arf6 долго оставался «в тени» более известных G-белков. За последние годы появилось много данных, указывающих на важнейшую роль Arf6 в ключевых аспектах жизнедеятельности клетки. Все больше внимания стало уделяться белкам Arf, в частности Arf6, и в аспекте канцерогенеза. Тем не менее, до сих пор опубликованы лишь единичные работы, исследующие участие Arf6 в опухолевой прогрессии и метастазировании. Среди возможных механизмов, опосредующих участие Arf6 в канцерогенезе, чаще всего рассматриваются Arf6-зависимое изменение цитоскелета и подвижности, а также регуляция эндоцитоза ряда белков и структуры мембраны. Менее понятной и остается роль Arf6 в метаболизме липидов и участие этой ГТФазы во внутриклеточных сигнальных путях. Таким образом, исследование механизмов действия Arf6 является крайне актуальным для понимания механизмов онкогенеза у человека.
Для изучения влияния Arf6 на различные функциональные характеристики трансформированных клеток in vivo, а также на молекулярно-биологические характеристики клеток in vitro, была выбрана клеточная линия HET-SR ранее полученная в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Эта линия представляет собой эмбриональные фибробласты Сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh) трансформированные вирусом саркомы Рауса и характеризуется высокой туморогенностью, но низкой спонтанной метастатической активностью (СМА), что делает данную линию удобной мог-
делью для исследования опухолевой прогрессии и изучения метастазирования in vivo на иммунокомпетентных животных.
Необходимо отметить, что при онкопаталогиях человека исследование экспрессии Arf6 проводилось только на уровне мРНК в образцах глиом. Однако в контексте накопленных за последнее время данных на модельных системах о значительной роли Arf6 в процессе канцерогенеза представляется чрезвычайно актуальным исследование экспрессии Arf6 при других онкопаталогиях, в том числе при таком распространенном заболевании как немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ).
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является исследование влияния малой ГТФазы Arf6 на ключевые биологические свойства трансформированных клеток в культуре in vitro и метастатическую активность in vivo, а также на активацию отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, ассоциированных с опухолевой профессией.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
На основе клеточной линии HET-SR (RSV трансформированные фиброб-ласты хомяка) получить производные линии, стабильно экспрессирующие различные формы белка Arf6: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную, не способную взаимодействовать с PLD.
-
Изучить основные биологические свойства клеток HET-SR, экспресси-рующих различные формы Arf6, в культуре in vitro: скорость пролиферации, подвижность, инвазивность, клоногенность и способность к неприкрепленному росту.
-
Исследовать влияние различных форм Arf6 на протеолитическую активность внеклеточных протеиназ ММР 1,2,9 и uPA, активность PLD, а также на статус фосфорилирования основных МАР киназ (ERK1/2, р38 и JNK1) и киназ Akt и S6K1.
-
Получить клеточные линии, экспрессирующие одновременно активные формы белков Ral (RalA и RalB) и белок Arf6 как в активной, так и в доминантно-негативной форме.
-
Сравнить уровень спонтанной метастатической активности всех полученных клеточных линий in vivo.
-
Провести анализ экспрессии белков Arf6 и RalA в образцах НМРЛ человека.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Полученные в работе результаты расширяют представления о роли малой ГТФазы Arf6 в канцерогенезе. В результате проведенных исследований получены приоритетные данные о влиянии белка Arf6 и его основного эффектора — PLD на многие характеристики клеток. В частности, впервые показано наличие сигнального пути Arf6—»PLD—»mTOR—>S6K1, а также АіГб-зависимая стимуляция активности киназы р38. До сегодняшнего времени исследования изменения экспрессии Arf6 в человеческих опухолях практически не проводились. Полученные в представленной работе данные об экспрессии Arf6 и белка RalA, необходимого для активации основного партнера Arf6 — PLD, при НМРЛ являются уникальными и одними из первых исследований такого рода.
Работа носит в первую очередь теоретический характер, полученные данные о роли Arf6 в опухолевой прогрессии могут быть использованы при дальнейшем изучении участия Arf6 как на модельных системах, так и в клинических исследованиях. Перспективным представляется дальнейшее исследование роли Arf6 в прогрессии НМРЛ. Полученные данные свидетельствуют о возможной роли Arf6 в качестве потенциального маркера при комплексной диагностике и поиске мишеней для таргетной терапии НМРЛ.
Публикации и апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 18 февраля 2010 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, молекулярной эндокринологии и механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «European Small GTPase meeting» в 2007 г. (Умеа, Швеция), «Cancer Degradome Symposium» в 2008 г. (Лондон, Англия), «Методы культивирования клеток» в 2009 г. (Санкт-Петербург), Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis" в 2009 г. (Глазго, Шотландия).
По результатам диссертационной работы опубликована 1 научная статья и 9 тезисов докладов.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков, 4 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 127 источников, в том числе 2 в отечественных рецензируемых изданиях.
