Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1.Механизмы клеточной гибели 11
1.2. Молекулярные механизмы процесса аутофагии 12
1.2.1. Консервативность генов, кодирующих процесс аутофагии 17
1.2.2. Регуляция активности процесса аутофагии в опухолевых клетках 18
1.3. Роль аутофагии в канцерогенезе и прогрессии опухоли 23
1.4. Роль аутофагии среди других механизмов клеточной гибели 27
1.5. Роль аутофагии в подавлении опухолевой инициации 29
1.6. Роль аутофагии в прогрессии заболевания на поздних стадиях 29
1.7. Потенциальные мишени для таргетной терапии злокачественных опухолей в клинической онкологии 33
1.8. Роль аутофагии при злокачественной меланоме кожи 41
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Клеточные линии 44
2.2. Определение антипролиферативной активности с помощью МТТ метода 44
2.3. Модуляция цитотоксичности и определение взаимодействия препаратов в культуре in vitro 45
2.4. Определение колониеобразования 45
2.5. Трансфекция клеточных линий 46
2.6. Оценка миграционной способности клеток методом миграции «в рану» 46
2.7. Определение апоптоза методом проточной цитометрии 46
2.8. Анализ клеточного цикла 48
2.9. Определение активирующих мутаций в гене BRAF 49
2.10. Анализ экспрессии генов 49
2.11. Проведение Вестерн-блоттинга. Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в полиакриламидном геле 50
2.12. Иммуноблоттинг 51
2.13. Анализ течения аутофагии и лизосомального содержимого 52
2.14. Статистический анализ 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 54
3.1. Влияние мутации V600 гена BRAF на уровень аутофагии в клеточных линиях меланомы человека 54
3.1.1. Влияние мутации гена BRAF на базальный уровень аутофагии 54
3.1.2. Влияние мутации гена BRAF на индукцию аутофагии 56
3.2. Изучение цитотоксичности на клетах меланомы человека 57
3.2.1. Исследовние цитотоксического действия TMZ 57
3.2.2. Влияние ингибиторов аутофагии на цитотоксичность TMZ 58
3.2.3. Влияние ЭПР-стресса на цитотоксичность ТМZ и его комбинации с ингибитором аутофагии CQ 61
3.3. Влияние комбинированного действия TMZ с ингибиторами аутофагии на клеточный цикл 65
3.4. Механизмы гибели клеток меланомы человека под действием TMZ и его комбинаций с ингибиторами аутофагии 70
3.4.1.Изучение апоптотической гибели клеток меланомы человека под действием TMZ и CQ или LY 70
3.4.2. Исследование аутофагии в клетках меланомы при комбинации TMZ и CQ или LY 71
3.4.3. Изучение апоптотической гибели клеток меланомы человека при ЭПР стрессе 74
3.4.4. Исследование аутофагии в клетках меланомы при ЭПР-стрессе 78
3.5. Изучение взаимосвязи аутофагии и ЭМП в клеточных линиях меланомы 82
3.5.1. Влияние аутофагии на маркеры ЭМП 82
3.5.2. Влияние ингибиторов аутофагии на миграционную способность клеток меланомы 83
3.5.3. Изучение экспрессии маркеров ЭМП под действием ингибиторов аутофагии 87
Глава 4. Обсуждение результатов 92
Заключение 103
Выводы 105
Список сокращений 107
Список литературы 110
- Молекулярные механизмы процесса аутофагии
- Роль аутофагии при злокачественной меланоме кожи
- Влияние ЭПР-стресса на цитотоксичность ТМZ и его комбинации с ингибитором аутофагии CQ
- Изучение экспрессии маркеров ЭМП под действием ингибиторов аутофагии
Молекулярные механизмы процесса аутофагии
Аутофагия – эволюционно сложившийся процесс лизосомальной утилизации белков и органелл для поддержания внутриклеточного гомеостаза и жизнедеятельности при неблагоприятных условиях окружающей среды [103, 108, 142, 185].
Известны три формы аутофагии – макроаутофагия (обычно и подразумевается под термином «аутофагия» и о ней будет идти речь далее), микроаутофагия и шаперон-зависимая аутофагия [141]. Они были выделены в зависимости от типа утилизируемого материала (органеллы или белки) и механизма попадания продуктов деградации в аутолизосому. При макроаутофагии, участок цитоплазмы и/или органеллы сначала отделяется мембранной структурой (фагофорой), которая впоследствии расширяется и сливается, превращаясь в аутофагосому с характерной двойной мембраной. В случае микроаутофагии, цитоплазматический материал (макромолекулы и обломки клеточных мембран) захватывается непосредственно эндосомой или лизосомой без этапа формирования прелизосомальной вакуоли. Таким путем клетка может переваривать белки при нехватке энергии или аминокислот (например, при голодании). При шаперон-зависимой аутофагии происходит направленный транспорт частично денатурировавших определенных цитозольных белков, содержащих пентапептидный мотив (KFERQ), в полость лизосомы с участием соответствующих белков-шаперонов семейства Hsc70. Этот тип аутофагии, описанный только для млекопитающих, индуцируется стрессом [5].
Процесс аутофагии разделяют на шесть основных этапов: образование омегасомы (инициация), образование фагофоры, ее элонгация, образование (созревание) аутофагосомы, синтез аутолизосомы и ее деградация. Он тонко регулируется группой генов ATG (autophagy-related genes). Около 30 генов ATG было обнаружено в дрожжах, 16 из них имеют гомологи у человека [94]. Эти гены и их белковые продукты регулируются многочисленными восходящими сигналами: наличием питательных веществ и энергии в клетке, стрессами, дефектными органеллами и патогенными условиями. Генные продукты ATG контролируют формирование аутофагосомы. Другие гены кодируют рецепторы, которые направляют «груз» к формирующейся аутофагосоме, контролируют процесс доставки аутофагосом к лизосоме и их слияние [3]. В таблице 1 приведены основные гены, контролирующие различные этапы аутофагии у человека.
Ключевым событием формирования преаутофагосомной везикулы (фагофоры) является активация синтеза фосфатидилинозитол-3-фосфата (PI3Р) при формировании комплекса Beclin 1-Vps34 -PI3K-CIII [184]. При этом PI3Р локализуется на особых структурах эндоплазматического ретикулума (ЭПР) – омегасомах, названных так за счет их O-образной формы. Они формируются на основе мембран ЭПР путем присоединения к ним белка DFCP1 и PI3-киназного комплекса Beclin1-Vps34-Atg14 [11, 77]. Далее именно на мембранах омегасомы происходит сборка комплексов белков, необходимых для формирования фагофоры.
После образования омегасомы внутри ее полости формируется изолированная мембрана (преаутофагосома или фагофора), к которой присоединяются комплекс Atg12-Atg5—Atg16, белки Atg9, WIPI-1, протеинкиназный комплекс ULK1-Atg13-FIP200-Atg101 и Beclin1-Vps34-Atg14-PI3Р, ответственные за этап элонгации [91, 140].
Основная функция этой вновь сформированной фагофоры – поглощение поврежденных цитоплазматических компонентов. На этом этапе формирования аутофагосомы участвуют две белок-сопряженные системы: Atg12-Atg5 и Atg8-фосфатидилэтаноламин (LC3, microtubule-associated 1A/1B-light chain 3) [142]. Комплекс Atg12-Atg5 способствует формированию и удлинению фагофоры, а также образованию аутофагосомы. На более поздних стадиях ее элонгации комплекс Atg12-Atg5—Atg16 постепенно отделяется от мембраны аутофагофоры и расщепляется [140]. Цитозольная форма LC3-I при участии белков Atg7, Atg3 и Atg12-Atg5—Atg16 образует комплекс с фосфатидилэтаноламином, который встраивается в мембрану фагофоры, в следствие чего получается форма LC3-II белка, непосредственно связанная с мембраной аутофагосомы.
В процессе формирования аутофагосомы участвует только LC3-II изоформа белка. В отличие от Atg12-Atg5, LC3-II постоянно присутствует в аутофагосоме и считается самым надежным маркером аутофагии [82, 90]. Его накопление в аутофагосомах визуализируется микроскопически в виде отдельных включений, т.н. пунктатов [90]. В некоторых случаях, поврежденные белки/органеллы доставляются в аутофагосому за счет специфических белков-адаптеров (например, NBR1 и p62/SQSTM1), связывающихся с LC3-II [143]. «Грузовой» рецептор аутофагии p62/SQSTM1 связывает убиквитин на поверхности поврежденных компонентов и доставляет их в аутофагосомы путем связывания с белком LC3. Сам р62 является субстратом аутофагии, который аккумулируется, когда процесс ингибирован [87]. Интересно, что накопление р62, индуцированное инактивацией аутофагии, способствует развитию доброкачественных гепатом в мышиных моделях, но механизм остается неизвестным [93, 195].
Ген Beclin 1 (Atg6) играет ключевую роль в процессе аутофагии у млекопитающих. Этот белок является фактором в инициации аутофагии: присоединяясь к комплексу Vps34-PI3K-CIII, он дает начало формированию аутофагосом [82, 90]. Он также тесно взаимодействует с другими белками аутофагии Ambra1, ULK1, Vps15 [80, 183].
Вскоре после образования аутофагосомы происходит слияние ее внешней мембраны с лизосомой с образованием аутолизосомы. Это слияние стимулируется комплексом Beclin 1-Vps34-PI3K-CIII-UVRAG, а ингибируется путем присоединения белка Rubicon этому комплексу [96, 122]. Содержимое аутофагосомы разрушается под действием лизосомальных гидролаз, в том числе катепсинов и липаз [183]. Продукты катаболизма (глюкоза, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и др.) затем либо возвращаются в цитоплазму, где они перерабатываются в метаболических и биосинтетических путях, либо подвергаются дальнейшему расщеплению для получения АТФ [68, 162].
При нормальных питательных условиях аутофагия функционирует на конститутивном низком базальном уровне для поддержания качества, количества и функциональности белков и органелл. Гены ATG и аутофагия сильно индуцированы в условиях недостатка питательных веществ и других стрессорных факторах, которые обеспечивают клеточное и органное выживание.
На заключительном этапе за счет удлинения аутолизосомы образуется протолизосома, которая снова превращается в лизосому. Данный процесс деградации аутолизосомы контролируется белком Rab7 [49, 61]. При его участии под контролем белка Atg4 происходит катепсин-зависимое отщепление фосфатидилэтаноламина от LC3-II с образованием LC3-I формы.
Роль аутофагии при злокачественной меланоме кожи
Меланома кожи является самой агрессивной формой злокачественных новообразований кожи, которая развивается из трансформированных меланоцитов. Заболеваемость меланомой продолжает неуклонно нарастать. Таким образом, меланома представляет собой одну из значимых междисциплинарных проблем клинической и экспериментальной онкологии, а агрессивное течение говорит о данной опухоли как о социально-значимом заболевании. [19, 151].
Меланома является гетерогенным заболеванием, так как при данной патологии выявляются различные генетические изменения, клиническая картина так же весьма вариабельна.
Клеточный путь MAPK (Ras/Raf/MEK/ERK) - ключевой регулятор клеточной пролиферации и деления клеток. MAPK – путь может быть активирован различными внеклеточными импульсами через трансмембранные рецепторы факторов роста. Они, в свою очередь, активируют белок RAS, передающий сигнал к группе серин-треониновых киназ RAF (A-RAF, BRAF, C-RAF). Каждая из них может последовательно активировать следующие этапы сигнального пути, на каждом из которых так же возможна реверсия: MEK1/MEK2-киназы (интеграция сигналов от различных факторов роста и активация пролиферации), ERK1/ERK2 (активирующие мутации ведут к повышенной клеточной пролиферации и резистентности к апоптозу) [194].
В 2002 году было обнаружено, что в 50-70% случаев у пациентов с прогрессирующей меланомы кожи есть мутация в гене, кодирующим белок BRAF [49]. Наиболее часто (в 80% случаев) встречается мутация в 600-м кодоне гена BRAF, в котором происходит замена аминокислоты валина на глутаминовую кислоту (мутация V600E). Вторая по частоте мутация – V600K - замена валин на лизин, встречается до 10% случаев [8].
Помимо MAPK пути существенную роль в клеточном ответе в клетках меланомы играет PI3K/AKT/mTOR каскад – внутриклеточный сигнальный путь, центральными компонентами которого являются ферменты фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), киназы AKT (семейство протеинкиназ В) и mTOR (mammalian target of rapamycin). Следует за активацией белков RAS и вовлечен в развитие меланомы, поскольку часто гиперактивирован в этих опухолях. Основной мишенью в данном пути является белок AKT, частота возникновения мутаций в котором при меланоме кожи наблюдается в 60% случаев [45].
Обычные режимы химиотерапии меланомы с диким типом BRAF включают в себя дакарбазин, темозоломид, цисплатин, которые использовались по отдельности или в комбинации без значительного улучшения выживаемости рака: только 10-20% пациентов отвечают на терапию, а медиана выживаемости составляет всего 6 -8 месяцев [118]. Для отдельных групп пациентов применяется иммунотерапия ингибиторами CTLA-4 и PD-1.
Темозоломид (ТМZ) является липофильной молекулой и алкилирующим агентом [64]. Цитотоксичность TMZ является результатом образования O6-метилгуанина в ДНК, метилированный гуанин образует сшивку с тимином, что вызывает ошибки в репарации ДНК и ее репликацию [6]. Несмотря на то, что частота ответных реакций низкая у большинства из этих заболеваний, ТМZ назначается из-за легкости введения, переносимости и известной способности проникать через гематоэнцефалический барьер, обеспечивая умеренную противоопухолевую активность в отношении метастазов в мозг [232].
После открытия таргетной терапии, в частности BRAF и MEK ингибиторов, выживаемость пациентов с меланомой кожи повысилась. Однако у большого количества больных наблюдаются признаки прогрессирования заболевания уже через 6-8 месяцев из-за развития у опухоли устойчивости к применяемым препаратам [7].
Была отмечена повышенная регуляция маркеров аутофагии в опухолях пациентов, получавших BRAF или BRAF и MEK ингибиторы. Ингибиторы BRAF запускают цитопротекторную аутофагию через реакцию несвернутых белков.
Генетическая инактивация аутофагия также повышает эффективность ингибиторов BRAF при исследованиях генетически модифицированных мышей с Braf-мутированными опухолями, которые были особенно зависимы от аутофагии [189, 190].
Таким образом, инактивация аутофагии может обеспечить другую стратегию для решения лекарственной устойчивости опухолей: вместо инактивации того же сигнального пути другими препаратами, можно ингибировать другой процесс (то есть аутофагию) для того, чтобы обойти устойчивость к киназным ингибиторам BRAF.
Выступая в качестве основного механизма удаления поврежденных химиопрепаратами органелл и белков, аутофагия рассматривается как один из важных путей выживаемости опухолевых клеток. Предполагается, что ее ингибирование приведет к фатальным повреждениям в клетке, и, в конечном итоге, к массовой клеточной гибели [108].
Влияние ЭПР-стресса на цитотоксичность ТМZ и его комбинации с ингибитором аутофагии CQ
Эксперименты были проведены на трех клеточных линиях меланомы с различным базальным уровнем аутофагии: Mel Z (низкий), Mel IL (средний) и Mel MTP (высокий), который был определен по уровню экспрессии мРНК Beclin 1 (рисунок 6А) и продукции белка Beclin 1 (рисунок 6Б, В).
Чтобы лучше понять механизм, лежащий в основе синергетической цитотоксичности TMZ и CQ в наших клетках, мы трансфецировали клетки Mel Z, Mel IL и Mel MTP с помощью малых интерферирующих (ми)РНК к GRP78 (siGRP78) либо контрольным вектором (siCTRL). После трансфекции клетки культивировали в присутствии TMZ или TMZ в комбинации с CQ или оставляли интактными в течение 24 часов в ряде экспериментов на способность клеток к колониеобразованию. Чтобы подтвердить нокдаун белка GRP78, мы проанализировали уровень белка GRP78 с помощью вестерн-блоттинга с использованием -актина в качестве контроля (рисунок 7А). TMZ в монорежиме не влиял на формирование колоний клеток Mel IL. По сравнению с контролем, обработанным ДМСО, комбинация TMZ и CQ уменьшала количество колоний на 25% (р = 0,05). Количество колоний в клеточной линии Mel Z уменьшилось на 30% при добавлении TMZ, комбинация TMZ с CQ снизила количество колоний на 60% по сравнению с контролем (p 0,05) (рисунок 7В). Интересно, что при обработке TMZ отдельно или в сочетании с CQ клетки Mel MTP не образовывали колоний.
В клетках Mel IL и Mel Z нокдаун GRP78 усиливал цитотоксические эффекты TMZ, дополнительно снижая процент образовавшихся колоний еще на 20%. Обработка siGRP78-трансфицированных клеток меланомы 100 мкМ TMZ и 20 мкМ CQ снижала процент колоний на 70% в клетках Mel Z, но не влияла на Mel IL. Клетки Mel MTP не образовывали колоний при трансфекции siGRP78 (Рисунок 7В).
Далее мы определили цитотоксический эффект TMZ на клеточные линии меланомы с нокдауном GRP78 методом MTT. Согласно полученным данным, обработка клеток меланомы, трансфецированных siCTRL, 100 мкМ TMZ не влияла на их жизнеспособность по сравнению с нетрансфецированными клетками. Нокдаун GRP78 усиливал цитотоксическое действие одного TMZ на клетки Mel MTP с высоким базовым уровнем аутофагии, но не наблюдалось ингибирующего действия на Mel IL по сравнению с нетрансфицированными клетками и, что удивительно, подавление GRP78 снижало токсичность TMZ на клеточной линии Mel Z (рисунок 8). Более того, подавление GRP78-зависимой аутофагии снижало цитотоксическое действие CQ на клеточные линии Mel Z и Mel IL, но индуцировало антипролиферативный эффект на Mel MTP (рисунок 8)
GRP78 поддерживает целостность ЭПР и участвует в формировании аутофагосом независимо от Beclin 1 [64]. Таким образом, ингибирование GRP78 усиливает цитотоксические эффекты TMZ, но комбинированный эффект TMZ и CQ был обнаружен только на клеточной линии Mel Z.
Таким образом, наши результаты показали, что чувствительность клеток к TMZ не зависела от мутационного статуса гена BRAF и уровня аутофагии. Однако обработка клеток меланомы ингибиторами аутофагии CQ или LY усиливала цитотоксический эффект TMZ в клеточных линиях меланомы.
Все исследованные клеточные линии с различным базальным уровнем аутофагии экспрессировали GRP78. При этом TMZ индуцировал повышение уровня белка GRP78. Обработка клеток, трансфицированных siGRP78, TMZ приводила к усилению цитотоксичности только в клеточной линии Mel MTP с высокой базальной аутофагией.
Нами показано, что TMZ приводит к снижению процента колоний, образованных при обработке TMZ, а комбинация TMZ с CQ усиливала цитотоксические эффекты TMZ. Нокдаун GRP78 потенцировал цитотоксическое действие TMZ. Таким образом, GRP78-зависимая аутофагия ограничивала цитотоксичность TMZ.
Изучение экспрессии маркеров ЭМП под действием ингибиторов аутофагии
Для оценки степени участия аутофагии в эпителиально-мезенхимальном переходе и метастазировании мы исследовали экспрессию E-cadherin, N-cadherin, -catenin, Vimentin, MMP2, ZEB1, SNAIL, TWIST, LC3BI/II, р62/SQSTM1, Beclin 1 и ATG5 под действием ингииторов аутофагии LY и CQ в течение 24 и 48 часов на 2 клеточных линиях с разным статусом гена BRAF (А375(mt) и MeWo(wt)). Активность каждого маркера определяли методом вестерн-блотинга с использованием соответствующих антител и -actin в качестве референсного контроля. Как показано на Рисунках 22 и 23 в клетках А375 оба изученных ингибитора снижали экспрессию маркеров мезенхимальности vimentin, MMP2 и транскрипционных факторов ZEB1, SNAIL и TWIST, при этом дополнительные 24 часа инкубации в присутствие LY или CQ усиливали этот эффект. Уровень -catenin не изменялся. Однако, отмечалось повышение уровня N-cadherin в присутствие ингибиторов в течение 48 часов. Изучение маркеров аутофагии показало, что Beclin 1 не вовлечен в процесс ЭМП и действие ингибиторов, что было подтверждает описанные выше результаты. Присутствие CQ приводило к нарушению слияния аутофагосомы с лизосомой, что подтверждается увеличенным накоплением LC3BII в клетках А375 и повышенным уровнем р62/SQSTM1, объясняющим снижение убиквитинилирвоания белковых агрегатов. Уровень маркера элонгации аутофагом ATG5 также не изменялся. LY достоверно не влиял на маркеры аутофагии. Схожая картина наблюдалась и в другой линии меланомы MeWo c диким типом гена BRAF, где ингибиторы аутофагии также подавляли активацию vimentin, ММР2, ZEB1, при этом отмечалось и снижение N-cadherin. Накопление LC3BII и р62/SQSTM1 было сходно с таковым в клетках меланомы А375. Однако, отмечалось подавление Beclin 1 и ATG5 после 48-часовой инкубации с ингибиторами аутофагии. При исследовании обеих клеточных линий отмечены значимые различия в экспрессии Е-кадхерина лишь в клетках А375 (рисунок 23). Таким образом, наши результаты показывают, что оба ингибитора аутофагии LY и CQ вовлечены в подавление ЭМП, однако, имеют разные механизмы действия.
Подавление аутофагии посредством миРНК к ATG5 приводило к увеличению экспрессии LC3BI (при отстутствии экспрессии LC3BII) и р62/SQSTM1, а также E-cadherin ZEB1, SNAIL. Подавление Vimentin отмечатлось только в BRAF-мутированной линии А375/ однако уровень N-cadherin оставался неизменным (рисунок 24).
Подавление аутофагии посредством LY, CQ или трансфекции клеток с siATG5 и siGRP78 снижали экспрессию маркеров мезенхимальности vimentin, MMP2 и транскрипционных факторов ZEB1, SNAIL, TWIST в клетках меланомы. Присутствие CQ приводило к нарушению экспрессии белков аутофагии, что объясняет снижение убиквитинилирования белковых агрегатов. Таким образом, наши результаты показывают, что ингибирование аутофагии вовлечено в подавление ЭМП.