Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .14
1.1. Таргетная терапия диссеминированного почечно-клеточного рака...14
1.2. Циторедуктивная нефрэктомия .25
1.3. Предоперационная таргетная терапия 26
1.4. Клинико-лабораторные и молекулярные факторы прогноза 34
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования .47
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение .58
3.1 Спектр и частота нежелательных побочных явлений, связанных с проведением ПТТ у пациентов с мПКР 58
3.2 Качество жизни пациентов мПКР, связанное с проведением ПТТ 61
3.3 Эффективность ПТТ у пациентов с мПКР .63
3.4. Объем хирургического вмешательства и течение раннего послеоперационного периода 65
3.5 Отдаленные результаты комбинированного лечения .70
3.6 Взаимосвязь молекулярных параметров с эффективностью предоперационной таргетной терапии у больных мПКР 72
3.7 Создание модели прогнозирования эффективности предоперационной таргетной терапии у пациентов диссеминированным раком почки 84
3.8 Создание модели прогнозирования эффективности типа таргетной терапии у пациентов метастатическим раком почки .88
Заключение .94
Выводы .105
Практические рекомендации 106
Список литературы
- Циторедуктивная нефрэктомия
- Клинико-лабораторные и молекулярные факторы прогноза
- Качество жизни пациентов мПКР, связанное с проведением ПТТ
- Взаимосвязь молекулярных параметров с эффективностью предоперационной таргетной терапии у больных мПКР
Циторедуктивная нефрэктомия
Неоангиогенез представляет собой сложный процесс образования новой сосудистой сети, который включает в себя миграцию, активацию и пролиферацию эндотелиальных клеток, нарушение целостности сосудистой базальной мембраны, образование экстрацеллюлярного матрикса, миграцию перицитов и формирование связей с уже существующими сосудами. Ангиогенез представляет собой одно из главных условий опухолевой прогрессии, а терапевтические подходы, нацеленные на его блокировку, рассматриваются в качестве основных лекарственных возможностей при диссеменированном раке почки. Неоангиогенез в нормальных или патологических условиях регулируется огромным числом ангиогенных и антиангиогенных факторов. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), накапливающийся в опухолевых клетках в большом количестве, является одним из основных факторов, стимулирующих ангиогенез. Семейство VEGF представлено рядом факторов (A,C,D), которые в свою очередь имеют афинность к тому или иному типу рецепторов (VEGFR1-3). Фактор роста эндотелия сосудов, воздействуя на соответствующие рецепторы, способствует активации в сосудистом русле циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток, замедлению апоптоза, активации и последующему делению с формированием внутриопухолевой сосудистой сети [5, 62].
Бевацизумаб (Авастин) – рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело – обладает способностью с высокой специфичностью связываться со всеми формами VEGF (A, C, D) [87]. В мультицентровом регистрационном исследовании III фазы AVOREN сравнивалась комбинация бевацизумаба и ИФН- с монотерапией ИФН- в качестве 1-й линии лечения у 649 больных мПКР с благоприятным или промежуточным прогнозом по MSKCC. Комбинации бевацизумаба и ИФН- позволила увеличить частоту объективных эффектов с 9% до 32%, а время до прогрессирования с 5,5 до 10,3 месяцев (p 0,0001). Средняя продолжительность жизни у больных, получавших комбинацию препаратов, также была несколько выше, но различия в показателях (23 vs 21 месяца) не достигли статистической значимости. Отсутствие значимых различий по результатам общей выживаемости между группами объясняется тем, что более 60% больных, получавших ИНФ- в монорежиме, перешли на другие варианты таргетной терапии при выявлении у них прогрессирования заболевания. Основными видами нежелательных побочных явлений 3-4 степени, связанными с использованием комбинации препаратов были: слабость (36%) и анорексия (15%), белок в моче (14%) и артериальная гипертензия (12%) [36, 89].
B.I. Rini и соавторы в 2008 г. опубликовали результаты схожего по дизайну исследования III фазы CALGB 90206 (Cancer and Leukemia Group B). В исследовании принимали участие 732 пациента с мПКР. По результатам также было отмечено увеличение времени до прогрессирования и более высокая частота объективных ответов в группе больных, получавших комбинацию бевацизумаба с ИФН- [92].
На сегодняшний день комбинация бевацизумаб с ИФН- включена в стандарты первой линии терапии у пациентов мПКР с хорошим и промежуточным прогнозом по MSKCC.
VEGFR рецепторы представляют собой чрезмембранные белки с похожей структурой: их наружная рецепторная часть состоит из иммуноглобулин-подобных субъединиц, а внутриклеточная область представлена тирозинкиназным доменом. Тирозинкиназные ингибиторы, проникают внутрь клетки и конкурируют с АТФ за АТФ-связывающие внутриклеточные домены соответствующих тирозинкиназных рецепторов, тем самым, блокируя фосфорилирование тирозиновых остатков внутриклеточных белков, предотвращая дальнейшую передачу сигнала к ядру клетки. Основными мишенями для мультикиназных ингибиторов при мПКР являются рецепторы семейства VEGFR, FGFR и PDGFR [27, 95, 100]. Сорафениб (Нексавар) – тирозинкиназный ингибитор, обладающий возможностью блокировать ангиогенез, воздействуя в большей степени на VEGFR1-3, FGFR и PDGFR. В дополнении к этому он подавляет активность серинтреониновой RAF-киназы, и звенья с-KIT-зависимого пути [58, 61].
В международном рандомизированном исследовании III фазы, сравнивающем сорафениб (n=451) и плацебо (n=452) во второй линии терапии мПКР после предшествующей иммунотерапии, было показано увеличение медианы времени до прогрессирования по сравнению с плацебо – 5,6 и 2,9 месяцев, соответственно (р 0,01). Основными токсическими реакциями (I-IVст.), ассоциированными с приемом препарата, являлись диарея (43%), кожная сыпь (41%), ладонно-подошвенный синдром (32%) и артериальная гипертензия (18%) [38].
Сунитиниб (Сутент) – мультикиназный пероральный ингибитор, подавляющий передачу сигнала от рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR1-3), тромбоцитарного фактора роста, (PDGFR,), тирозинкиназы c-KIT, рецептора фактора некроза опухоли и FMS-подобной тирозинкиназы (Fit3) [90].
В 2009 году были опубликованы результаты мультицентрового исследования III фазы, сравнивающего эффективность сунитиниба с ИФН- у 750 ранее не леченых пациентов с мПКР. Объективный ответ оказался достоверно выше в группе больных, получавших сунитиниб (38,7%), чем в группе пациентов, принимавших ИФН (8,2%) (р 0,001). У них зафиксирована более продолжительная медиана времени до прогрессирования (11,4 месяца) по сравнению с группой пациентов, получавших ИФН- (4,8 месяца) (р 0,001). Кроме этого, финальный анализ показал, что медиана общей выживаемости в группе пациентов, принимавших сунитиниб, составила 26,4 по сравнению с 21,8 месяцами для группы больных, получавших ИФН- (р=0,051) [73, 82].
Клинико-лабораторные и молекулярные факторы прогноза
Определение активности протеасом. Химотрипсинподобную активность тотального пула протеасом определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей, а также во фракциях протеасом, по гидролизу флуорогенного олигопептида N-Succinyl-Leu-Leu Valyr-7-Amido-4-Methylcoumarin (Sigma, США), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом, на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Реакцию проводили при 370С в течение 20 мин и останавливали 1% додецил сульфатом натрия. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяли специфический ингибитор протеасом – MG132 (Sigma, США). За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль N-Succinyl-Leu-Leu-Valyr-7-Amido-4 Methylcoumarin в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.
Получение осветленных гомогенатов. Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 минут при 10000g и 4оС.
Определение активности кальпаинов. Активность кальпаинов определяли в осветленных гомогенатах тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида N-Succinyl-Leu-Leu-Valyr-7-Amido-4-Methylcoumarin. Реакционная смесь содержала 100 мМ Tris-HCl (pH 7,3), 145 мМ NaCl. Реакцию проводили, добавляя к 30 М N-Succinyl-Leu-Leu-Valyr-7-Amido-4-Methylcoumarin, растворенному в реакционной смеси, 5 l супернатанта и инкубируя при 25оС в течение 30 мин в присутствии или отсутствии 10 мМ СаС12 и 50 М ингибитора М-ацетил-Ьеи-Ьеи-норлейцинал (Merck Biosciences, Германия). Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Активность кальпаинов определяли в пробах с 10 мМ СаС12 и с ингибитором. За единицу активности принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль N-Succinyl-Leu-Leu-Valyr-7-Amido-4-Methylcoumarin в течение 1 мин. Удельную активность выражали в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.
Приготовление тканевых экстрактов для определения HIF-la, NF-кВ (р50 и р65 форм) и phospho-mTOR . Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 500 мкл фосфатного буфера, содержащего 0,137 М NaCl; 0,0027 М КС1; 0,01 М Na2HP04; 0,0017 М КН2Р04 (рН 7.4), и центрифугировали в течение 5 минут при 3000g и 4оС. Надосадочную фракцию сливали, а полученный осадок вновь ресуспендировали в 50 мкл буфера, содержащего 0,137 М NaCl; 0,0027 М КСГ 0,01 М Na2HP04; 0,0017 М КН2Р04 (рН 7.4), а также ингибиторный коктейль, включающий в себя 0,1мМ AEBSF; 0,5-10 2 мМ Bestatin; 0,2-10 2 Leupeptin Hemisulfate; 0,15-Ю"2 мМ Е-64; 0,1-Ю"2 мМ Pepstatin А; 0,08-10"2 Aptrotinin, при постоянном помешивании инкубировали 15 минут при 4оС и центрифугировали 10 минут при 14000g и 4оС. Полученный супернатант использовали для определения экспрессии транскрипционных факторов.
Определение содержания транскрипционных факторов. Экспрессию форм NF-кВ р50, NF-кВ р65, HIF-1 и phospho-mTOR (R&D Systems, DSL, США) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощь наборов Caymanchem (США) на ИФА-анализаторе «Anthos 2020» (Австрия). Уровень белка в гомогенатах и ядерных экстрактах определялся по Лоури. Результаты определения содержания транскрипционных факторов выражали в единицах оптической плотности на мг белка в лунке, а phospho-mTOR выражали в пг/мг белка.
Приготовление тканевых экстрактов для определения содержания ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2 . Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 500 мкл фосфатного буфера, содержащего 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4, 0,0017 M KH2PO4 (pH 7.4), при постоянном помешивании инкубировали 15 минут при 4оС и центрифугировали 20 минут при 10000g и 40С. Полученный супернатант использовали для определения тотального (внутриклеточного и внеклеточного) пула свободного ростового фактора – VEGF и рецептора VEGFR2.
Определение содержания ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2. Экспрессия ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2 определялась в тканях рака почки в соответствии с рекомендациями фирмы производителя с помощью ИФА-анализатора «Anthos 2020» (Австрия). Использовали наборы для твердофазного ИФА (R&D Systems, США). Результаты определения содержания VEGF и VEGFR2 выражали в пг/мг белка.
Качество жизни пациентов мПКР, связанное с проведением ПТТ
Вероятно, это связано с тем, что эверолимус блокирует серин-треаниновую протеинкиназу mTOR, тем самым снижая уровень е активной формы – phospho-mTOR. Соответственно, низкая концентрация p-mTOR приводит к снижению фосфорилирования киназ внутриклеточного сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, блокируя пролиферацию опухолевых клеток. Аналогичные данные были представлены в работе S.Li, опубликованной в 2014 году [64]. Авторы также высказали свое мнение относительно потенциальной роли p-mTOR в прогнозе эффективности терапии эверолимусом.
На фоне проведения таргетной терапии эверолимусом, также, были отмечены существенные изменения в показателях активности протеасом и кальпаинов (таблица 19). Таблица 19 – Активность внутриклеточных протеиназ в опухоли больных мПКР до и после лечения эверолимусом в зависимости от эффективности лечения Эффект терапии До лечения После лечения Активность протеасом в опухолевойткани, 103 Ед/мг белка Активностькальпаинов вопухолевойткани, 103 Ед/мг белка Активность протеасом в опухолевойткани, 103 Ед/мг белка Активностькальпаинов вопухолевойткани, 103 Ед/мг белка
Так, у больных с клиническим ответом на проведение ПТТ зафиксировано снижение активности протеасом 1,8 раза (рисунок 12А) и рост активности кальпаинов в 2,4 раза по сравнению с исходными значениями (рисунок 12Б). При прогрессировании заболевания на фоне лечения эверолимусом изначально были зафиксированы более высокие показатели активности протеасом и низкие значения активности кальпаинов, чем в группе пациентов с клиническим эффектом: в 1,7 и в 1,9 раза соответственно (р 0,05). Причем, после проведения ПТТ у этих пациентов активность протеасом в опухолевой ткани оставалась неизменной, а уровень кальпаинов увеличивался почти в 3 раза. Рисунок 12A – Активность протеасом в опухоли больных мПКР до и после лечения эверолимусом в зависимости от его эффективности Примечание: - значимость различий по сравнению с группой с наличием клинического ответа, р 0,05; #- значимость различий по сравнению с группой больных до лечения, р 0,05; Рисунок 12Б – Активность кальпаинов в опухоли больных мПКР до и после лечения эверолимусом в зависимости от его эффективности Примечание: - значимость различий по сравнению с группой с наличием клинического ответа, р 0,05; #- значимость различий по сравнению с группой больных до лечения, р 0,05; Представленные данные свидетельствуют о том, что не только уровни транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50, HIF-l, ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2 являются значимыми маркерами, определяющими особенности развития опухоли почки, но и важным показателем является уровень протеинкиназы p-mTOR. Исходно низкое содержание данного показателя до начала лечения эверолимусом связано с более высокой его эффективностью. В свою очередь, исходно низкие значения активности внутриклеточного протеолиза и их изменения также могут являться предикторами ответа на ПТТ эверолимусом.
Полученные результаты позволяют рассматривать изучаемые молекулярные показатели в качестве дополнительных предсказательных маркеров.
Для прогнозирования эффективности таргетной терапии в предоперационном режиме у больных мПКР был проведен дискриминантный анализ, результатом которого явилась разработка математических моделей, представленных набором линейных дискриминантных функций, определяющих границы принятия решения в пользу той или иной группы (класса). Классификация проводилась следующим образом: коэффициент Y1 характеризовал группу больных с ожидаемой неэффективной предоперационной таргетной терапией, коэффициент Y2 - больных с эффективным противоопухолевым лечением. Вероятность эффективности терапии оценивали следующим образом: если значение Y1 было Y2, то больной относился к группе с вероятно неэффективной таргетной терапией; если Y1 Y2 - к группе с ожидаемым клиническим ответом на проведение предоперационной таргетной терапии.
Дискриминантный анализ включал следующие этапы: первичный отбор признаков для построения модели; набор обучающей выборки (группы больных, у которых регистрируются отобранные признаки); отбор информативных признаков и формирование на их основе группы дифференциальных функций (критерий Фишера); проверка качества полученной дискриминантной модели.
В качестве обучающей выборки были определены две группы пациентов мПКР, у которых в первом случае на проведение ПТТ был получен клинический эффект, во втором диагностировано прогрессирование заболевания. На основании базы данных, включающей в себя 16 клинико-морфологических (возраст, пол, статус по ECOG, T, N, M, степень дифференцировки G, некроз опухоли, саркоматоидный компонент, сосудистая инвазия, взаимоотношение с капсулой, уровень гемоглобина, Са2+, ЩФ и ЛДГ, прогноз по MSKCC) и 8 молекулярных (NF-B р50, NF-B р65, HIF1, VEGFR2, VEGF, p-mTOR, ПА и КА) признаков, с помощью дискриминантного анализа были отобраны 9 наиболее информативных, которые в дальнейшем и вошли в математическую модель прогнозирования ожидаемой эффективности ПТТ (таблицы 20, 21).
Взаимосвязь молекулярных параметров с эффективностью предоперационной таргетной терапии у больных мПКР
Несмотря на многообразие идентифицированных молекулярных нарушений в опухолевой ткани почки, ни одно из них в настоящее время не рассматривается в клинической практике в качестве надежного предиктора эффективности различных вариантов таргетной терапии у больных с диссеминированным процессом. В подавляющем большинстве клинических исследований, в которых изучались биомаркеры и их потенциальная прогностическая роль у больных мПКР, оценка маркеров проводилась, как правило, в единичных образцах ткани, полученной из первичной опухоли у пациентов после радикальной или паллиативной нефрэктомии.
Мы в своей работе определяли уровни NFkB р50, NFkB р65, HIF-la, VEGF, VEGFR2, р-mTOR, протеасомную и кальпаиновую активность как в биопсийном, так и операционном материале у пациентов мПКР, после проведения 8 недель ПТТ. Полученные результаты были сопоставлены с эффективностью проведенного лечения.
При изучении динамики изменения молекулярных параметров на фоне терапии пазопанибом выявлено, что исходно высокая экспрессия транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50 и HIF-la в опухоли, ассоциирована с клиническим ответом на ПТТ по сравнению с пациентами, у которых отмечено прогрессирование заболевания. При этом отмечалось значимое снижение уровня ядерного фактора NF-кВ р50 и HIF-la в 2,9 и 4,5 раза, соответственно. Также, у пациентов с наличием клинического ответа, показано влияние пазопаниба на уровень протеинкиназы p-mTOR. Содержание данного показателя снижалось в 3,37 раза на фоне лечения.
Отмечено, что содержание ростового фактора VEGF у пациентов с клиническим ответом на терапию пазопанибом было также повышено в ткани опухоли до лечения. После проведения ПТТ отмечено уменьшение его содержания в 3,6 раза (р 0,05). В зависимости от эффективности ПТТ пазопанибом отмечены значительные изменения в состоянии внутриклеточного протеолиза. Так, у больных с наличием ответа на терапию пазопанибом, отмечается исходно высокая активность протеасом в опухоли по сравнению с пациентами с прогрессией заболевания. После проведенного предоперационного лечения у больных с частичной регрессией и стабилизацией процесса отмечалось снижение активности протеасом и значительный рост активности кальпаинов в 1,66 и 12,6 раза, соответственно, по сравнению с таковым до лечения. Развитие прогрессии заболевания на фоне терапии пазопанибом было связано с повышением активности как протеасом, так и кальпаинов (13,5 и 9,5 раз). Возможно, эффективное применение пазопаниба связано с уменьшением количества субстратов протеасом, а отсутствие эффекта на лечение, в свою очередь способствует активации внутриклеточного протеолиза.
Таким образом, на основании полученных результатов, показано сопряжение исходного уровня экспрессии ядерных факторов NF-кВ, HIF-1 , ростового фактора VEGF и активности протеасом с выраженностью объективного ответа на лечение ингибитором тирозинкиназ - пазопанибом. Высокие уровни данных показателей в опухоли до лечения и их значимое снижение после предоперационной таргетной терапии пазопанибом, позволяет предлагать их в качестве дополнительных информативных маркеров, ассоциированных с эффективностью таргетной терапии.
При анализе динамики показателей молекулярных маркеров у больных с наличием ответа на таргетную терапию эверолимусом выявлено, что исходно в опухолевой ткани определялась высокая экспрессия транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50 и HIF-1 по сравнению с пациентами, у которых отмечено прогрессирование заболевания (р 0,05).
Экспрессия ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2, также была выше, по сравнению с пациентами, у которых отмечено прогрессирование заболевания. У этих же больных диагностировано значимое снижение уровня вышеперечисленных параметров на фоне проводимого лечения (р 0,05). При этом уровень протеинкиназы p-mTOR был исходно низким и оставался таковым после лечения. На фоне проведения таргетной терапии эверолимусом, также, были отмечены существенные изменения в показателях внутриклеточных протеиназ. Так, у больных с клиническим ответом после проведения ПТТ эверолимусом зафиксировано снижение активности протеасом в 1,8 раза и рост активности кальпаинов в 2,4 раза по сравнению с исходными значениями. При прогрессировании заболевания изначально зафиксированы более высокие показатели активности протеасом и низкие значения активности кальпаинов, по сравнению с группой пациентов с клиническим эффектом: в 1,7 и в 1,9 раза соответственно (р 0,05). Причем, после проведения ПТТ у данной группы больных активность протеасом в опухолевой ткани оставалась неизменной, хотя уровень кальпаинов увеличивался почти в 3 раза.
Представленные данные свидетельствуют о том, что не только уровни транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50, HIF-1, ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2 являются значимыми маркерами, определяющими особенности развития опухоли почки, но и важным показателем является уровень протеинкиназы p-mTOR. Исходно низкое содержание данного показателя до начала лечения эверолимусом связано с более высокой его эффективностью. В свою очередь, исходно низкие значения активности внутриклеточного протеолиза и их динамические изменения также могут рассматриваться в качестве предикторов ответа на ПТТ эверолимусом.