Когерентная фазовая микроскопия : растровый метод регистрации внутриклеточной динамики Иванов, Алексей Борисович

Введение к работе

Актуальность работы. Изучение динамических процессов в

живых клетках и их органеллах, является одним из фундаментальных

направлений биологии. В оптических методах в последние годы особое

внимание привлекают методы фазовой или интерференционной

микроскопии, которые благодаря уникальным свойствам фазовых

изображений открывают новые перспективы получения количественной

информации о процессах в живых клетках. Методы фазовой или

интерференционной микроскопии привлекают в последние годы особое

внимание из-за уникальных свойств фазовых изображений и перспективы

получения новой количественной информации о процессах в живых

клетках. В этих методах изображения представлены в виде распределения

физически значимой величины - оптической разности хода, которая

зависит от структуры и свойств объекта. Современные методы фазовой

микроскопии неинвазивны, обладают высокой чувствительностью к

изменению показателя преломления и параметров структуры объекта.

Поскольку живая клетка является важным объектом многих исследований,

то для регистрации происходящих в ней процессов были также

разработаны различные методы, в т.ч. трек-диаграмм и кадровой съемки.

Однако, до настоящего времени не были известны такие изображения

объекта, в которых одновременно содержится информация как о

структуре, так и о динамических характеристиках объекта. В диссертации

представлены результаты разработки растрового метода регистрации

динамических процессов (РРДП). Этот метод является дальнейшим

развитием метода динамической фазовой микроскопии (ДФМ) и позволяет

обнаруживать области динамической активности на фазовых

изображениях живых клеток и органелл. В разработанном ранее в МИРЭА

методе ДФМ регистрация морфологии и динамики разделялись, и

динамические процессы регистрировались в виде трек-диаграмм в точках фиксированной на топограмме линии. Методом ДФМ была получена информация о пространственных и временных характеристиках метаболических процессов в различных клетках. Автором был сделан следующий шаг в решении проблемы одновременной регистрации структуры и локальных процессов в клетке. В его основе лежит использование неизвестного ранее свойства растровых фазовых изображений, которое состоит в возможности разделения пространственных и временных характеристик объекта. Метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) свободен от основного недостатка ДФМ, в котором регистрация динамических процессов производилась только в точках заранее выбранной линии (скан-линии) на фазовом изображении объекта. Реализация метода РРДП позволила одновременно получить информацию в реальном времени о локализации и интенсивности динамических процессов на всем фазовом изображении клетки. Полученная методами фазовой микроскопии информация дополнит фундаментальные знания о процессах в живых клетках и позволит разработать новые методы диагностики и лечения заболеваний на клеточном уровне.

Цель работы и задачи исследования. Целью диссертационной работы является разработка метода обнаружения и регистрации динамических процессов в живых биологических объектах, с помощью КФМ "Эйрискан". Метод должен обеспечить получение новых количественных данных из фазовых изображений, полученных на КФМ "Эйрискан", для определения функционального состояния живых клеток и органелл. Разработанные алгоритмы и программный комплекс должны обеспечить обнаружение и регистрацию внутриклеточных динамических процессов в реальном времени. Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

разработать метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП), обеспечивающий обнаружение активных областей в изображении объекта и оценку их частотных характеристик;

определить оптимальные режимы сканирования фазового изображения для регистрации динамических процессов;

реализовать разработанные алгоритмы в прикладном программном обеспечении WinTluck для исследований динамических процессов в клетке на КФМ «Эйрискан»;

апробировать метод РРДП на фазовых изображениях биологических объектов - эритроцитах, клетках Т-лимфоцитов, опухолевых клетках НСТ-116 и т.д. Показать принципиальную возможность получения новой информации о функциональном состоянии объекта.

Методы исследования. Для решения поставленной задачи применялись экспериментальные и теоретические методы. В разработанных автором алгоритмах использовались методы цифровой обработки сигналов и изображений, спектрального анализа дискретных сигналов и расчета дискретных фильтров с заданными свойствами. Для создания автоматизированного программного комплекса исследования динамики живых биообъектов использовались методы объектно- ориентированного программирования и алгоритмы компьютерной графики.

Научная новизна работы 1. Разработан метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) для обнаружения и регистрации локальных областей активности в

статических фазовых изображениях с размерами порядка нескольких пикселей (до 70 - 100 нм).

1. 1. Разработанный на основе метода РРДП и КФМ «Эйрискан» программно-аппаратный комплекс позволяет обнаруживать и регистрировать динамические процессы в живых биологических объектах с временным разрешением до 1 мс.

   2. Экспериментально показана принципиальная возможность использования метода РРДП для диагностики функционального состояния биообъектов различной природы (клеток и органелл), что свидетельствует об универсальности метода как инструмента исследования функционального состояния и метаболических процессов в живых клетках.

   Основные положения, выносимые на защиту

   1. 2. 1. Разработан оригинальный, не имеющий аналогов метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) для обнаружения и регистрации локальных временных процессов в фазовых изображениях живых биологических объектов.

         2. Созданный на основе КФМ «Эйрискан» и метода РРДП аппаратно- программный комплекс WinTluck позволяет обнаруживать локальные динамические процессы в областях с размерами до 70 нм и регистрировать их с временным разрешением до 1 мс.

         3. Апробация метода РРДП на живых биологических объектах показала принципиальную возможность применения метода в биологии и медицине.

         Практическая значимость и реализация научных результатов

         1. Полученные в ходе работы результаты показывают перспективу использования метода РРДП в фундаментальных исследованиях метаболических процессов в живых клетках. Дальнейшее развитие метода

         РРДП может быть основой для изучения механизмов передачи сигналов в

         клетках и органеллах, а так же применения в медицине как средства экспресс диагностики функционального состояния клеток и органелл.

         1. 2. 3. 1. Важными достоинствами метода РРДП являются: неинвазивность, высокая чувствительность, интерактивность и возможность регистрировать метаболические процессы в реальном времени на участках изображения размерами порядка 20х20 нм.

                  2. Реализованный в РРДП подход, разработанные алгоритмы исследования динамических процессов и программное обеспечение были использованы в научных исследованиях в области биологии и медицины.

                  3. Созданное программное обеспечение позволяет автоматизировать процесс обнаружения внутриклеточных сигналов и диагностики функционального состояния живой клетки на КФМ «Эйрискан». Апробация работы

                  Основные научные результаты по теме диссертации были представлены на российских и международных научных конференциях: международная научная конференция Laser Applications in Life Sciences (LALS) 2007 Москва, 3-я международная российско-германская студенческая конференция «Информационные технологии в современной жизни» Германия 2008, 56-я Научно - техническая конференция МИРЭА, 3-я Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» Троицк 2008, международная конференция «Topical Meeting on Optoinformatics 2008» Санкт-Петербург, 3-я Всероссийская научно- практическая конференция "Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты" 2010 Москва, 4-ая Троицкая конференция "Медицинская физика и инновации в медицине" 2010 Москва, Роснанофорум 2009. Публикации

                  Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 10

                  научных работах, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК. Структура и объем работы

                  Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и одного приложения. Диссертация содержит 105 страниц машинописного текста, список литературы, включающий 67 наименований, одну таблицу и 46 рисунков.

                  Похожие диссертации на Когерентная фазовая микроскопия : растровый метод регистрации внутриклеточной динамики

                  

                  Теория и методы проектирования растровых осветительных устройств для микроскопии и ряда приложенийНатаровский Сергей Николаевич

                  Формирование и анализ изображений в микроскопии видимой и ИК области спектра методами спектрофотометрииМельников, Алексей Владимирович

                  Разработка и исследование временных методов регистрации слабых световых сигналовСуковатый Антон Николаевич

                  

                  Дифференциальный метод оперативной регистрации УФ облученности в трех биологически активных областяхГоликов Алексей Валерьевич

                  Исследование воздействия ультрафиолетового излучения на материальные объекты, методы его измерения и устройства регистрацииТомский, Константин Абрамович

                  

                  Метод уменьшения погрешности оптико-электронных спектральных приборов с многоэлементной фотоэлектрической регистрацией спектраДемин, Анатолий Петрович

                  

                  Динамика вагонов при сходе с рельсов и обоснование технических решений регистрации сходаСалтыков Дмитрий Николаевич

                  Исследование и разработка микрофлюидных устройств для анализа биологических объектов методами микроскопии высокого разрешенияКухтевич, Игорь Владимирович

                  Автоматизация обработки изображений медико-биологических препаратов крови, полученных при микроскопии методом темного поляЖук, Сергей Владимирович

                  Повышение точности трехкоординатных измерений геометрических параметров изделий в компьютерной микроскопии методами продольной фокусировки и триангуляцииЛатонов, Игорь Владимирович