Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов Кулешова Анна Александровна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. Спектроскопические исследования взаимодействия флуоресцетных красителей с биологическими объектами (по данным литературы) 12

1.1. Физические основы флуоресцентной спектроскопии... 12

1.2. Элементы теории тушения флуоресценции 14

1.3. Спектры поглощения и молекулярная ассоциация красителей в растворах .15

1.4. Флуоресцентные наномаркеры семейства флуоресцеина 19

1.5. Сывороточные альбумины (человеческий, бычий) 21

1.6. Применение флуоресцентных наномаркеров в исследованиях биологического материала .23

ГЛАВА II. Методика эксперимента 31

2.1. Приготовление растворов наномаркеров семейства флуоресцеина для изучения их флуоресцентных характеристик в растворах альбуминов (бычьего, человеческого) .31

2.2. Измерение спектров поглощения и определение степени молекулярной ассоциации и угла между молекулами в ассоциации 31

2.3. Измерение спектрально - люминесцентных характеристик растворов наномаркеров 32

ГЛАВА III. Результаты 35

3.1. Спектральные характеристики флуоресценции наномаркеров в растворах альбуминов 35

3.2. Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах альбуминов. Тушение флуоресценции наномаркеров .43

3.3. Концентрационное тушение флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов 52

3.4. Молекулярная ассоциация наномаркеров семейства флуоресцеина в белковых растворах 60

3.5. Вращательная диффузия наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах белка 86

Основные результаты и выводы 98

Литература .

• Спектры поглощения и молекулярная ассоциация красителей в растворах
• Измерение спектров поглощения и определение степени молекулярной ассоциации и угла между молекулами в ассоциации
• Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах альбуминов. Тушение флуоресценции наномаркеров
• Молекулярная ассоциация наномаркеров семейства флуоресцеина в белковых растворах

Введение к работе

Актуальность работы

Одной из важнейших задач современной физики является изучение биологического материала. С помощью спектроскопических методов проводятся активные исследования по реализации быстрого мониторинга изменения состояния клеток, белков, тканей и других биологических объектов, осуществляемые при небольших количествах исследуемого образца. Метод флуоресцентных наномаркеров (красителей) с каждым годом всё активнее применяется в физике, медицине, фармакологии и биологии, так как позволяет получать информацию об исследуемом материале за минимальные сроки без инвазивного воздействия. С помощью флуоресцентной спектроскопии исследуют, в частности, как нативную структуру белков (сывороточных альбуминов), так и процессы их обратимой и необратимой денатураций, различные модификации их структуры при изменении окружающей внешней среды.

Сывороточные альбумины человека (САЧ) и быка (БСА) являются основными белками плазмы крови, а именно составляют около 70% от всех белков, содержащихся в плазме крови. Сывороточный альбумин синтезируется в печени и секретируется её клетками в кровь. Размеры молекул альбумина невелики, но концентрация высока, и он определяет коллоидно-осмотическое давление в плазме. Сывороточные белки (человеческий и бычий) имеют похожую структуру, так как принадлежат одному гомологическому семейству белков. Молекулы сывороточных альбуминов состоят из цепочки аминокислотных остатков: человеческий насчитывает 585 аминокислотных остатков, бычий – 582. Эти небольшие глобулярные белки обладают схожим значением изоэлектрической точки pI (для САЧ её значение составляет 4,7; для БСА – 4,9). При соответствующих pH во вторичной структуре оба белка имеют приблизительно одинаковые содержания регулярных структур.

Одной из основных функций данных белков является транспорт физиологических метаболитов, переносимых кровью, чему способствует большая площадь поверхности множества молекул альбумина. Сам механизм связывания обширного круга лигандов определяется наличием у сывороточных альбуминов специфических участков -связывающих центров. Есть центры, отвечающие за связывания с ионами металлов, с длинноцепочечными жирными кислотами, с лигандами со свободной SH-группой. Значительный интерес представляют I и II центры (неспецифические лекарственные центры связывания), присоединяющие малые органические молекулы.

Большую роль в изучении физико – химических свойств связывающих центров белков играет метод флуоресцентных наномаркеров (зондов), чрезвычайно чувствительных к

малейшим изменениям окружающей белка среды. Флуоресцентная спектроскопия позволяет анализировать данные подобных трансформаций и изменений. Повышение информативности спектральных методов (поглощения и флуоресценции) возможно за счет применения ряда красителей, физико-химические свойства которых, влияющие на взаимодействие их молекул с белками, изменяются с некоторым шагом. К такому ряду красителей можно отнести красители семейства флуоресцеина. В данном ряду атом водорода у флуоресцеина (Ф) заменяется галогеном: бромом у эозина (Э), йодом у эритрозина (Эр), хлором и йодом у бенгальского розового (БР). При этом ионы Ф диссоциированы в основном на карбоксильной группе, а для галоген-замещенных производных – на гидроксильной. Кроме того, эффект тяжелого атома является основной причиной изменения квантовых выходов флуоресценции и фосфоресценции, поляризации флуоресценции и среднего времени жизни возбужденного состояния молекул.

Цель диссертационной работы заключалась в исследовании спектрально-флуоресцентных, спектрально-поляризационных и абсорбционных характеристик наномаркеров семейства флуоресцеина (Ф, Э, Эр и БР) в растворах САЧ и БСА для различных pH среды и определении параметров поведения наномаркеров, связанных с белками. В соответствии с поставленной целью в работе были изучены следующие основные задачи.

1. Измерение спектрально-флуоресцентных характеристик наномаркеров в растворах сывороточных альбуминов при различных концентрациях и значениях pH. Анализ изменений этих характеристик в растворах белков и установление их природы.

2. Проведение анализа процессов тушения флуоресценции наномаркеров флуоресцеина и его галоген – производных в растворах САЧ и БСА при разных pH и определение параметров этих процессов: константы связывания с белками и коэффициента кооперативности.

3. Исследование спектров поглощения наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ и БСА при их различных концентрациях и значениях pH. Анализ процессов молекулярной ассоциации молекул красителей. Определение эффективности таких процессов, структуры ассоциатов и влияния белков на процессы комплексообразования.

4. Измерение спектров поляризованной флуоресценции наномаркеров. Определение параметров вращательной диффузии наномаркеров в растворах САЧ и БСА при варьировании pH.

Научная новизна работы

5. Установлено, что для всех исследованных красителей в растворах, содержащих альбумины, значения интенсивности в максимумах спектров флуоресценции, значительно меньше аналогичных значений для буферных растворов этих красителей. С увеличением значения pH тушение флуоресценции производных флуоресцеина (Э, Эр, БР) под действием белков уменьшается. Вид зависимости I(pH) для Ф не совпадает с аналогичной зависимостью для его галоген – производных для низких значений pH (рН < 5,0).

6. Установлена независимость степени анизотропии флуоресценции молекул галоген-производных флуоресцеина от pH среды.

7. Определены коэффициенты вращательной диффузии флуоресцеина, эозина, эритрозина и бенгальского розового и установлено их уменьшение в растворах САЧ и БСА в широком диапазоне значений pH.

8. Показано, что при взаимодействии с сывороточными альбуминами изменения спектрально-флуоресцентных характеристик галоген-производных флуоресцеина (Э, Эр, БР) имеют схожие закономерности и отличаются от характеристик самого флуоресцеина.

9. Установлено уменьшение степени ассоциации красителей семейства флуоресцеина в растворах белков по сравнению с буферными растворами, сопровождающееся изменением структуры ассоциатов.

10. Обнаружено, что при увеличении значения электроотрицательности боковых атомов радикалов в молекулах красителей семейства флуоресцеина их связывание с сывороточными альбуминами уменьшается в области от pI белков до физиологического pH = 7,4.

11. Для наномаркеров семейства флуоресцеина установлено уменьшение вращательной диффузии и увеличение времени вращательной релаксации в растворах САЧ и БСА по сравнению с их буферными растворами.

Практическая значимость работы:

Полученные в диссертационной работе данные по взаимодействию наномаркеров семейства флуоресцеина с сывороточными альбуминами при различных значениях pH имеют существенное значение для понимания и моделирования механизма связывания наномаркеров с белком и дают информацию о влиянии окружающей биологический объект и флуоресцентный краситель среды на процесс их взаимодействия.

Результаты об эффективности связывания флуоресцентного красителя с сывороточными альбуминами позволяют получить модель взаимодействия белков с лекарственными

препаратами и оценить факторы, влияющие на него, и в соответствии с полученной информацией модифицировать данный процесс. Этот механизм может быть использован при создании или усовершенствовании медицинских препаратов.

Достоверность представленных в диссертационной работе результатов подтверждается многократной повторяемостью экспериментов, а также соответствием результатов экспериментов априорной информации и теоретическим данным.

Положения, выносимые на защиту:

12. Длинноволновое смещение спектров флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов связано с изменением дипольного момента молекул при возбуждении. Замещение атомами брома, йода, хлора в структуре флуоресцеина вызывает в ряду ФЭЭрБР изменение конфигурации и жесткости ядерной системы и, как следствие, увеличение дипольного момента молекул при возбуждении.

13. Увеличение значения степени анизотропии флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ или БСА обусловлено связыванием наномаркеров с белками, вызывающим уменьшение вращательной диффузии для галоген – производных флуоресцеина более чем на порядок.

14. Уменьшение вращательной диффузии для 3,5 < pH < 8,0, как в буферных растворах, так и в растворах САЧ или БСА в ряду ФЭЭрБР связано с увеличением электроотрицательности радикалов боковых групп молекул в том же порядке.

15. Одинаковый характер спектрально-флуоресцентных зависимостей и закономерностей для констант связывания наномаркеров семейства флуоресцеина с САЧ и БСА от значения pH объясняется тем фактом, что зависимость зарядов обоих альбуминов от pH имеет практически идентичный характер, с той лишь разницей, что БСА положительно заряжен при pH < 4,9 и отрицательно заряжен при pH > 4,9, а САЧ в целом положительно заряжен при pH < 4,7 и отрицательно заряжен при pH > 4,7.

16. Уменьшение степени молекулярной ассоциации наномаркеров и изменение структуры ассоциатов в растворах САЧ и БСА связано с уменьшением их степени сродства к молекулам зондов (коэффициент кооперативности n < 1). Поэтому молекулы наномаркеров связываются только с одним связывающим центром сывороточных альбуминов и к нему уже не могут присоединяться другие молекулы красителя, которые не могут также присоединяться к остальным центрам. В результате в среде, окружающей белок, концентрация молекул красителя уменьшается и наблюдается уменьшение степени ассоциации.

6. Нелинейный характер концентрационного тушения флуоресценции наномаркеров (зависимостей Штерна - Фолмера ₀ — 1 от \Q\) обусловлен наличием нескольких

типов механизмов (ковалентный, ионный) образования комплекса флуоресцентный краситель - белок.

Апробация работы

Воспроизводимость результатов, их соответствие известным экспериментальным исследованиям обеспечивают достоверность полученных и проанализированных данных. По полученным в диссертационной работе результатам были опубликованы 23 печатные работы, из которых 7 - статьи в рецензируемых журналах, входящие в состав перечня ВАК. Также результаты представлены на российских и международных конференциях: «Week of Doctoral Students 2013» (WDS 2013), Прага, Чешская Республика (4-7 июнь, 2013); XVII, XVIII, XIX, XX и XXI всероссийские конференции «Структура и динамика молекулярных систем», Яльчик, Россия (28 июня - 2 июля, 2010; 4-9 июля, 2011; 25-30 июня, 2012; 24-29 июня, 2013; 22-27 июня, 2014); XVII и XVIII международные конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов», Москва, Россия (12-15 апреля, 2010; 11-15 апреля, 2011); VII, VIII международные конференции «Фундаментальные проблемы оптики» Санкт-Петербург, Россия (15-19 октября, 2012; 20-24 октября, 2014); VIII международная конференция молодых ученых и специалистов «Оптика-2013» Санкт-Петербург, Россия (14 - 18 октября, 2013); V и VI Троицкие конференции «Медицинская физика и инновации в медицине», Троицк, Россия (4-8 июня, 2012; 2-6 июня, 2014).

Личный вклад автора заключается в выборе объектов исследования, проведении измерений и интерпретации полученных результатов. Содержание диссертации и основные положения, выносимые на защиту, отражают персональный вклад автора в опубликованные работы. Подготовка к публикации полученных результатов проводилась совместно с соавторами, причём вклад диссертанта был определяющим.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, трёх глав, в первой из которых представлен обзор литературы по теме диссертации, во второй изложена методика эксперимента, а в третьей приведены экспериментальные результаты и их обсуждение, заключения и библиографии. Общий объём диссертации 121 страница, включающих 62 рисунка и 1 таблицу. Библиография содержит 133 наименования.

Спектры поглощения и молекулярная ассоциация красителей в растворах

Под термином флуоресценция понимают разрешенный по спину излучательный переход молекулы из возбужденного состояния (с синглетного уровня S1) в основное состояние (S0): S1 — S0 + фл . (1.1) Характерные величины скоростей испускания такого перехода имеют порядок 108 с-1, в соответствии со столь высоким значением скорости испускания времена затухания 10-11 – 10-8 сек. Временем жизни называют средний период времени, в течение которого флуорофор пребывает в возбужденном состоянии.

Выделяют следующие основные характеристики, закономерности для процесса флуоресценции: время затухания; для спектров поглощения и люминесценции справедливо правило Левшина (правило зеркальной симметрии); квантовый и энергетический выходы; стоксов сдвиг [1 – 3].

Явление стоксового сдвига, получившее своё название в честь наблюдавшего его ученого Дж. Стокса, заключается в том, что спектр излучения вместе с его максимумом перемещены сравнительно спектра поглощения и его максимума в длинноволновую область, то есть прослеживается убыль энергии. Формулировка закона Стокса, изложенная выше, дополнена внесёнными Ломмелем поправками и выражается в виде неравенства: hmaxлюм hmaxпогл. (1.2) Для флуоресцентных веществ, находящихся в растворах, устойчиво регистрируется уменьшение энергии между возбуждением и испусканием. Основное объяснение возникновения такого эффекта заключается в быстрой релаксации на нижний колебательный уровень состояния S1. В добавлении к этому, как правило, осуществляется переход на возбужденные колебательные уровни S0, являющийся причиной дополнительной убыли колебательной энергии. Эффект Стокса усиливается также благодаря взаимодействию растворителя с флуорофором, и реакции, происходящие в возбужденных состояниях, вносят свой вклад в это явление.

Значительную часть информации о процессах флуоресценции получают благодаря времени затухания и выходу люминесценции, который бывает квантовым или энергетическим. Энергетический выход является отношением испускаемой в виде люминесценции энергии к поглощенной возбуждающим светом энергии. Из-за стоксовых потерь его величина меньше единицы. Квантовый выход (Q) представляет собой отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных и может быть определен следующим образом: Q= Г/(Г+), (1.3) где – константа скорости безызлучательной дезактивации флуоресцирующего вещества; Г – константа скорости излучательной дезактивации флуорофора. В случае, когда Г квантовый выход близок к единице. Чем больше значение квантового выхода, тем эффективнее флуоресцентные свойства вещества. Для нефлуоресцирующих веществ величина квантового выхода или равна нулю или стремится к нему. Время жизни возбужденного состояния определяется уравнением: = 1/(Г + ). (1.4) При отсутствии безызлучательных процессов (при = 0), время жизни флуорофора называется собственным временем жизни (0) и определяется по формуле: 0 = 1/Г. (1.5) Таким образом, можно найти соотношение между временем жизни и квантовым выходом: Q1 = /0. (1.6) 1.2. Элементы теории тушения флуоресценции Большое влияние на выход люминесценции оказывают внешние воздействия, которые могут служить причиной тушения свечения. Из-за внутри - и межмолекулярных взаимодействий происходит уменьшение значения квантового выхода изучаемого вещества, именно этот процесс называется тушением флуоресценции, которое можно наблюдать, например, при добавлении посторонних примесей в раствор с люминесцирующими соединениями. Тушителями называются вещества, вызывающие данный эффект. Также тушение флуоресценции может быть вызвано температурными или концентрационными (большое количество флуоресцирующего вещества) воздействиями.

Как правило, механизм тушения связывают с развитием безызлучательных процессов потери энергии возбуждения (за счёт увеличения числа столкновений частиц, образования нелюминесцирующих комплексов и т.д.). Важную роль в люминесцентных исследованиях играет учёт тушения, влияющего на интенсивность люминесценции.

Множество различных механизмов, вызывающих безызлучательную релаксацию состояния Si, приводят к процессу тушения флуоресценции. Проводят исследования с широким кругом специфических тушителей флуоресценции, так как различные факторы воздействуют не одинаково на флуорофоры.

В качестве тушителей обычно выступают такие вещества как молекулярный кислород, йодид, ксенон, атомы тяжелых металлов, они индуцируют переход Si — Ті, осуществляемый в результате спин-орбитального связывания.

Измерение спектров поглощения и определение степени молекулярной ассоциации и угла между молекулами в ассоциации

Для исследования были сначала приготовлены буферные растворы с различными рН: 1) 0,1 M CH3COOH – KOH (pH 3,5-5,0); 2) 0,1 M KH2PO4 – 0,1 M NaOH (pH 6,0-8,0). Затем из буферных растворов были приготовлены растворы наномаркеров флуоресцеина (Ф), эозина (Э), эритрозина (Эр) и бенгальского розового (БР) со значениями концентраций 3 - 50 мкМ. Для исследования влияния белка на спектрально-люминесцентные характеристики в растворы с перечисленными выше наномаркерами (3 мкМ) добавляли сывороточный альбумин человека САЧ или бычий сывороточный альбумин БСА различной концентрации (10 – 150 мкМ) при различных значениях pH (3,5 – 8,0). Для оценки возможного влияния растворов сывороточных альбуминов и флуоресцентных маркеров на изменение pH буферных растворов за счет многократного приготовления образцов и измерений при одних и тех же условиях, было показано, что влияние красителей, САЧ и БСА на значение pH минимально. 2.2. Измерение спектров поглощения и определение степени молекулярной ассоциации и угла между молекулами в ассоциации

Измерение спектров поглощения данных наномаркеров в буферных растворах и растворах сывороточных альбуминов были проведены на спектрофотометре Perkin Elmer Lambda 35 при комнатной температуре. Спектры поглощения наномаркеров в растворах регистрировались в диапазоне 300 - 700 нм, использовались стандартные кварцевые кюветы 10х10 мм. Выделение спектров мономеров и димеров осуществлялось путем выделения из суммарного спектра гауссовых компонент с помощью программы UVWINLAB (PerkinElmer). Доля мономеров Х в исследованных растворах определялась как отношение погл , где SМ - площадь спектра поглощения мономеров, Sпроаст гграст погл ОГЛ погл площадь спектра поглощения раствора. При этом степень ассоциации равна 1-Х. Угол у между молекулами красителей в ассоциате (димере) определялся по формуле[129] 2Ї /мУд tg = , (2.1) 2 /vм J д где fм и f - силы осцилляторов в коротковолновой полосе димера и длинноволновой полосе димера, соответственно, равные площадям соответствующих спектров; Vм и уд -частоты максимумов длинноволновых и коротковолновых спектров димера. 2.3. Измерение спектрально-люминесцентных характеристик растворов наномаркеров.

Измерения флуоресцентных характеристик наномаркеров в растворах без и с сывороточными альбуминами (БСА или САЧ) проводились на спектрофлуориметре Perkin Elmer LS 55 при комнатной температуре. Флуоресценция красителей исследовалась в следующих условиях a) Флуоресцеин возбуждение длиной волны /1возб = 440 нм, флуоресценция регистрировалась в области 450 - 700 нм. b) Эозин возбуждение длиной волны /Івозб = 520 нм, флуоресценция регистрировалась в области 530 - 700 нм. c) Эритрозин возбуждение длиной волны /1возб = 530 нм, флуоресценция регистрировалась в области 540 - 700 нм. d) Бенгальский Розовый возбуждение длиной волны /1возб = 540 нм, флуоресценция регистрировалась в области 550 - 700 нм. Полученные спектры обрабатывались программой FLWINLAB (Perkin Elmer). Степень анизотропии г определялась по формуле г = , (2.2) /и + 2// где 1\\ - параллельная электрическому вектору возбуждающего света составляющая поляризованной флуоресценции; 1± - перпендикулярная электрическому вектору возбуждающего света составляющая поляризованной флуоресценции.

Для определения параметров вращательной диффузии наномаркеров были рассчитаны значения г красителей, при этом исследования проводились при различных значений вязкости г\ исследуемых образцов. Вязкость растворов изменялась путем добавления различных концентраций сахарозы. Теоретическая зависимость — где Т - абсолютная температура; rj - вязкость раствора; V - объем раствора; к - постоянная Больцмана; то - среднее время жизни возбужденных молекул; Го - предельная анизотропия излучения. Т Уравнение (2.3) описывает линейную зависимость — от —, т.е. может Г Г быть представлено в виде 1 T = A — + B, r r\ где А - коэффициент наклона прямой — г (тЛ , равный (2.4) ki0 А = V-к (2.5) а B есть отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат, равный В (2.6) Для каждого из растворов методом наименьших квадратов были построены зависимости — г (тЛ и определены значения А и В. Используя формулы (2.4 2.6) можно записать выражение для молекулярного объема V кт0В А (2.7) Используя известные значения т0 по формуле (2.7) были вычислены значения молекулярного объема для всех исследованных систем, а затем эффективный гидродинамический радиус Эйнштейна а = 3\ 3V 4-71 (2.8) Используя полученные значения молекулярного объема V, были определены время вращательной релаксации (или разупорядочивания вследствие тепловой диффузии) f флуорофора и коэффициент вращательной диффузии Г вращ по формулам:

Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах альбуминов. Тушение флуоресценции наномаркеров

Из рис. 3.1- 3.4. видно, что при растворении молекул наномаркеров в растворах белков наблюдается изменение не только спектральных, но и энергетических характеристик свечения (например, интенсивности флуоресценции). В этом параграфе представлены результаты исследования влияния белков и рН среды на флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина.

На рис. 3.9 и 3.10 представлены зависимости интенсивности в максимуме спектров флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина от pH в буферных растворах без и с добавлением БСА и САЧ. Как видно из рис. 3.9 и рис. 3.10 в растворах, содержащих белки, для всех четырех исследованных маркеров интенсивность в максимуме спектров флуоресценции в растворах альбуминов уменьшается по сравнению с буферными растворами.

Для растворов Ф (рис. 3.9 и рис. 3.10), не содержащих БСА и САЧ, c увеличением pH происходит рост интенсивности его флуоресценции, связанное с увеличением отрицательного заряда зонда при повышении pH. Молекулы Ф обладают слабой флуоресценцией при низких значениях pH растворов (меньше 5,5), так как находятся в слабо положительно заряженной форме. При добавлении в буферные растворы Ф белков для всей исследуемой области pH интенсивность свечения красителя уменьшается. Это уменьшение интенсивности флуоресценции обусловлено взаимодействием красителя с белком при связывании.

Из рис. 3.9 и рис. 3.10 видно, что самое слабое взаимодействие красителя с белком происходит при низких pH, когда молекулы альбумина и наномаркера положительно заряжены. При 7,0 pH 8,0 исследуемые объекты имеют отрицательный заряд, что вызывает незначительное тушение Рис. 3.9. Зависимости интенсивности в максимуме спектров флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина от pH: Ф (1, 2); Эр (3, 4); Э (5, 6); БР (7,8) в буферном растворе (1, 3, 5, 7) и с добавлением БСА (150 мкМ) (2, 4, 6, 8).

Зависимости интенсивности в максимуме спектров флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина от pH: Ф (1, 2); Эр (3, 4); Э (5, 6); БР (7,8) в буферном растворе (1, 3, 5, 7) и с добавлением САЧ (150 мкМ) (2, 4, 6, 8). флуоресценции. При 5,0 pH 6,0 происходит эффективное связывание БСА или САЧ с Ф (наблюдается наибольшее тушение флуоресценции красителя), так как в данном диапазоне pH молекулы альбуминов слабо отрицательно заряжены, а молекулы Ф нейтральны.

Для буферных растворов Эр уменьшение значения интенсивности флуоресценции зонда Эр в растворах без БСА и без САЧ наблюдается только при 3,5 pH 5,5 (рис. 3.9 и рис. 3.10, кривые 3). Это объясняется увеличением отрицательного заряда Эр и увеличением дипольной экранировки молекулами воды. При pH 5,5 интенсивность флуоресценции этого зонда практически не изменяется. Обусловлено это неизменностью заряда данного наномаркера, находящегося в дианионной форме. При добавлении БСА и САЧ в раствор с Эр видно (рис. 3.9 и рис. 3.10, кривые 4), что интенсивность флуоресценции красителя меньше, чем в растворах не содержащих белки, что объясняется интенсивным связыванием молекул наномаркера с альбуминами. При этом наиболее эффективное тушение флуоресценции красителя белками происходит при pH 5,0. Обусловлено это тем, что в данном диапазоне pH молекулы белков в целом положительно заряжены, а Эр находится или в нейтральной (pH 3,6) или в отрицательно заряженной форме моноаниона (3,6 pH 5,0).

В областях pH 5,0 белки и Эр в целом заряжены отрицательно, поэтому они слабо взаимодействуют друг с другом, вызывая незначительное тушение флуоресценции красителя.

Аналогичная зависимость Iфmлa x от pH наблюдается и для Э в буферных растворах: с увеличением pH наблюдается уменьшение Iфmлa x , достигая при pH 5,0 постоянного значения (рис. 3.9 и рис. 3.10). Наблюдаемая для Э зависимость Iфmлa x от pH растворов объясняется изменением заряда молекул красителя: при 3,0 pH 5,0 молекулы красителя слабо отрицательно заряжены и находятся в форме моноанионов, экранировка дипольными молекулами воды отсутствует, при больших pH молекулы Э становятся сильно отрицательно заряженными, принимают форму дианионов, что вызывает их экранировку дипольными молекулами воды. Зависимость Iфmлa x от pH для Э изменяется в растворах сывороточных альбуминов, что наглядно демонстрируется на рис. 3.9 и рис. 3.10 (кривые 6). В этом случае за счет электростатического взаимодействия наномаркера с БСА или с САЧ с ростом pH раствора наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции маркера. При этом Iфmлa x для всех рН меньше аналогичной величины для водных растворов эозина. Во всем рассматриваемом диапазоне pH (от 3,5 до 8,0) молекулы красителя заряжены отрицательно и находятся в форме дианионов, молекулы же альбуминов при значениях pH pI (изоэлектрической точка, равная значению 4,9 для БСА и 4,7 для САЧ) заряжены положительно, при значениях pH pI молекулы белков в целом отрицательно заряжены, но как БСА, так и САЧ имеют некоторые участки с положительным зарядом, с которыми и происходит связывание наномаркера. При увеличении pH количество положительно заряженных участков белка сокращается и эффективность присоединения Э к белкам уменьшается, поэтому и наблюдается уменьшение интенсивности флуоресценции Э (рис. 3.9 и рис. 3.10, кривые 6).

Зависимости интенсивности флуоресценции БР от pH (3,5 - 8,0) в буферных растворах и растворах с БСА и с САЧ представлены на рис. 3.9 и рис. 3.10, кривые 7 и 8. В буферных растворах БР наблюдается уменьшение Iфmлa x только при pH 4,0, а затем с ростом pH практически не изменяется. Такое поведение объясняется тем, что при pH 4,0 молекулы БР находятся в форме дианионов и имеют значительный отрицательный заряд, что вызывает их экранировку дипольными молекулами воды. При 3,5 pH 4,0 молекулы БР являются моноанионами, и имеют незначительный отрицательный заряд, и поэтому экранировка дипольными молекулами воды практически отсутствует. растворах БСА или САЧ Iфл БР изменяется от pH следующим иах образом: при увеличении значения pH I ф красителя растёт, но за счёт эффекта тушения флуоресценции красителя белками оно меньше аналогичной величины для буферного раствора наномаркера (рис. 3.9 и рис. 3.10, кривые 8). При pH 5,0 интенсивность флуоресценции БР в растворах белков низкая из-за эффективного связывания данного наномаркера с БСА и с САЧ. При больших значениях pH молекулы БР находятся в дианионной форме, а молекулы сывороточных альбуминов отрицательно заряжены, что приводит к малоэффективному связыванию белков с молекулами красителя, что сопровождается незначительным тушением флуоресценции зонда в белковых растворах (рис. 3.9 и рис. 3.10, кривые 8).

Молекулярная ассоциация наномаркеров семейства флуоресцеина в белковых растворах

Методами флуоресцентной спектроскопии исследованы спектрально-флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина (флуоресцеина (Ф) и его галоген – производных – эритрозина (Эр), эозина (Э), бенгальского розового (БР)) в растворах сывороточных альбуминов для различных значений pH. Для всех наномаркеров в растворах белков зафиксировано смещение их спектра флуоресценции в длинноволновую область, обусловленное изменением дипольных моментов флуорофоров при их возбуждении. Показано, что для Эр, Э и Ф дипольный момент уменьшается, для БР – увеличивается.

Обнаружено тушение флуоресценции наномаркеров в растворах сывороточных альбуминов. С увеличением значения pH тушение флуоресценции производных флуоресцеина (Э, Эр, БР) под действием белков уменьшается линейно, с одинаковым коэффициентом наклона А для БР в растворах обоих белков и с различными для Э и Эр. Причем для Э он больше для САЧ, в то время как для Эр он больше для БСА. Вид зависимости тушения флуоресценции Ф от рН среды сильно отличается от зависимостей для его галоген–производных: имеет немонотонный характер для растворов обоих белков, что объясняется характером взаимодействия Ф и белков. 3. Впервые по тушению флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина определены константы их связывания с сывороточными альбуминами (САЧ и БСА) в диапазоне значений pH (3,5 – 8,0). Показано, что наличие более электроотрицательных атомов в структурной формуле наномаркера приводит к менее эффективному связыванию с белками в области значений pH от изоэлектрической точки белков (pI САЧ 4,7; pI БСА 4,9) до физиологического значения pH (7,4). Получены зависимости констант тушения флуоресцентных зондов в растворах с БСА или с САЧ от pH. Рассчитаны коэффициенты кооперативности (коэффициенты Хилла) для всех исследуемых растворов, установлено влияние pH среды на параметры тушения флуоресценции. 4. Зарегистрировано изменение характеристик поляризованной флуоресценции и параметров вращательной диффузии наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов в широком диапазоне pH (3,5 – 8,0). Показано, что степень анизотропии флуоресценции наномаркеров и время их вращательной релаксации в растворах белков возрастают, а коэффициент вращательной диффузии наномаркеров в растворах белков уменьшается за счет связывания наномаркеров с сывороточными альбуминами. Из экспериментальных данных рассчитаны параметры вращательной диффузии наномаркеров, характеризующие их связывание с белками ( Dвращ ; ; Rэфф ) для различных рН. Вид зависимостей для исследуемых характеристик поляризованной флуоресценции различаются для флуоресцеина и его галоген – производных. Установлено, что при увеличении электроотрицательности радикалов боковых групп (в порядке флуоресцеин, эритрозин, эозин, бенгальский розовый) значения характеристик r, возрастают, а Dвращ уменьшается для 3,5 pH 8,0, как в растворах без белков, так и с САЧ и БСА.

Методом абсорбционной спектроскопии исследованы процессы ассоциации наномаркеров семейства флуоресцеина в буферных растворах и растворах сывороточных альбуминов (САЧ и БСА). Определены значения степени ассоциации молекул наномаркеров. Установлено, что в растворах сывороточных альбуминов связывание наномаркеров с белком сопровождается уменьшением степени молекулярной ассоциации. При этом чем больше значение электроотрицательности боковых радикалов галоген – производных флуоресцеина, тем меньше ассоциатов образуется в белковых растворах красителя.

Исследованы структуры образующих ассоциатов молекул семейства флуоресцеина в буферных растворах и растворах белков. Показано, что в буферных растворах с ростом рН для БР, Э и Эр наблюдается увеличения угла между мономерными молекулами в димере. Для Ф в области pH 6,0 при увеличении рН наблюдается уменьшение у, в то время как в области pH 6,0 увеличение рН приводит к увеличению этого угла. В растворах белков изменения углов между молекулами в димере Ау зависят как от концентрации молекул красителя, так и от рН среды. Для Э и БР при увеличении концентрации красителя в растворе БСА угол между молекулами в димере уменьшается. С уменьшением рН в растворе Э и БР в БСА наблюдается уменьшение у. Для Эр зависимость Ау( С, рН ) имеет противоположный вид по сравнению с Э и БР. Причем для Э, БР и Эр зависимости Лу(С) линейны. В то время как зависимости Лу( рН) для Э и БР линейны, а для Эр наблюдается минимум при рН = 6,0. Для Ф в растворах БСА зависимости Лу( рН) и Ау(С) немонотонные с минимумом при рН = 6,0 и С = 30 мкМ. Аналогичные зависимости для Э, БР и Эр наблюдаются и для растворов данных красителей в САЧ. Значительное отличие в зависимости Лу( рН) наблюдается в растворах Ф в САЧ и БСА. Если для Ф в растворах БСА при рН = 6,0 наблюдается минимум в этой зависимости, то для растворов Ф в САЧ при рН = 6,0 наблюдается максимум.

Впервые показано, что наличие сильно электроотрицательных атомов в молекулах галоген-производных флуоресцеина приводит к изменению их спектрально-флуоресцентных характеристик (зависящих от эффективности связывания наномаркеров с альбуминами) и абсорбционных характеристик (обусловленных уменьшением степени ассоциации молекул и изменением структуры ассоциатов), к возрастанию степени анизотропии флуоресценции, к увеличению времени вращательной релаксации наномаркеров и к уменьшению их коэффициента вращательной диффузии.