Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Краткий обзор научной литературы по теме работы . 12
Глава 2. Комбинированный спектроскопический метод одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме непрерывного мониторинга . 49
Глава 3. Лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции . 76
Глава 4. Спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур . 97
Заключение. 110
Список литературы с участием А.В. Рябовой. 113
Список цитируемой литературы. 115
- Краткий обзор научной литературы по теме работы
- Комбинированный спектроскопический метод одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме непрерывного мониторинга
- Лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции
- Спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур
Введение к работе
Актуальность работы
В применении лазерной флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии особую роль играют фотосенсибилизаторы, позволяющие избирательно и интенсивно воздействовать светом на пораженные ткани1. До сих пор не найдено идеального фотосенсибилизатора, сочетающего в себе высокую эффективность взаимодействия с лазерным излучением, безопасность в применении и отсутствие побочных эффектов2. В настоящее время используются несколько различных схем для оценки эффективности фотосенсибилизаторов. В общих чертах их можно разделить на биохимические и физические. В первой группе методов используют животных, а также культуры живых клеток в среде, приближенной к физиологическим условиям, и оценивают фототоксичность препаратов, места их внутриклеточного накопления, фармакокинетику3"5. В группе физических следует выделить методы измерения времени жизни и скорости тушения синглетного кислорода при лазерном излучении для оценки возможного окислительного эффекта в биологической ткани6"8. Эти методы, дополняя друг друга, требуют больших временных затрат, но все равно не дают окончательного ответа об эффективности изучаемого соединения в качестве фотосенсибилизатора.
Совокупность лазерно-спектроскопических методов оценки взаимодействия лазерного излучения с фотосенсибилизаторами позволит проводить многосторонний анализ работы фотосенсибилизаторов. Значимость создания такого высокоинформативного метода для определения эффективности фотосенсибилизаторов неоспорима. В основу комбинированного спектроскопического метода анализа для оценки эффективности фотосенсибилизаторов лег разработанный ранее в Лаборатории лазерной
РОС. НАЦИОНАЛЬНА»" ' БИБЛИОТЕКА
С.-Петербург ^_ 3
ОЭ 200 ^кт %
< і ііііі
биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ им. A.M. Прохорова РАН метод измерения степени оксигенации гемоглобина9. Комбинированный спектроскопический метод позволяет одновременно в реальном масштабе времени измерять и анализировать изменение степени оксигенации биологического объекта по спектрам поглощения, изменение концентрации активного вещества по спектрам флуоресценции и измерение оптических свойств исследуемой ткани по спектрам рассеяния лазерного излучения. Одновременное определение всех этих параметров во время лазерного облучения в режиме мониторинга делает возможным сразу вычислять квантовый выход генерации синглетного кислорода, склонность фотосенсибилизатора к фотобличингу и уровень его взаимодействия с биомолекулами, что позволяет определить уровень фотодинамической активности фотосенсибилизатора и установить механизм фотодинамической реакции. Поэтому перспективность использования комбинированного спектроскопического метода для продуктивного скрининга больших объемов новых химических соединений несомненна, а его разработка является своевременной и актуальной задачей.
Цель работы
Разработка комбинированного спектроскопического метода анализа эффективности сенсибилизаторов различного механизма действия при воздействии лазерного излучения на модельные биологические среды, клеточные суспензии и живые ткани.
Спектроскопические исследования эффективности новых перспективных для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии фотосенсибилизаторов.
Решаемые задачи
-
Разработать экспериментальную установку, позволяющую одновременно в режиме мониторинга при лазерном воздействии измерять спектры поглощения, флуоресценции, а также интенсивность обратного рассеяния лазерного излучения исследуемого биологического объекта, содержащего фотосенсибилизатор.
-
Разработать комбинированный спектроскопический метод по одновременному измерению спектров лазерной индуцированной флуоресценции (для определения интенсивности флуоресценции фотосенсибилизатора), спектров поглощения (для определения концентрации гемоглобина и степени его оксигенации) и спектров рассеяния биологических образцов (для определения уровня разрушений эритроцитов), содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме мониторинга.
-
Выявить спектроскопические критерии оценки эффективности генерации синілетного кислорода и его дезактивации в биологических средах при лазерном воздействии в зависимости от концентрации взаимодействующих веществ.
-
Разработать математический алгоритм лазерно-индуцированной генерации и тушения синглетного кислорода в биологических средах.
-
Провести комбинированные спектроскопические и лазерно-флуоресцентные исследования фотосенсибилизаторов (сульфированный фталоцианин алюминия (Фотосенс), Фталосенс, Хлорин Е6, индоцианин-грин (Кардиогрин)) в биологических средах при лазерном воздействии с различной длиной волны и мощностью облучения. Произвести сравнительную оценку этих соединений в качестве фотосенсибилизаторов при сопоставлении четырех одновременно измеряемых в режиме мониторинга для каждого фотосенсибилизатора
параметрах (концентрация гемоглобина, степень оксигенации гемоглобина, флуоресценция фотосенсибилизатора, уровень разрушения эритроцитов).
-
Разработать лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции.
-
Использовать разработанный лазерно-спектроскипический метод для количественного определения перекиси водорода, образующейся при фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами in vitro и при темновой каталитической терапии с использованием сульфированного фталоцианина кобальта (Терафтал).
-
Разработать спектроскопическую лазерно-флуоресцентную методику определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур при приготовлении липосомальных лекарственных форм на основе принципа статического тушения флуоресценции свободного фотосенсибилизатора при комплексообразовании.
Научная новизна исследования
-
Впервые разработан комбинированный спектроскопический метод анализа эффективности сенсибилизаторов с использованием одновременного измерения и математической обработки спектров флуоресценции, поглощения и рассеяния при лазерном облучении в режиме мониторинга.
-
С помощью разработанного комбинированного спектроскопического метода одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме мониторинга
предложен механизм, объясняющий нелинейную зависимость интенсивности флуоресценции Фотосенса от концентрации кислорода.
-
Доказано усиление каталитической активности нефлуоресцирующего сульфированного фталоцианина кобальта при лазерном воздействии с помощью разработанного спектроскопического метода с использованием флуоресцирующей сенсорной системы 0Ч-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин -пероксидаза).
-
Разработана новая спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика для количественного определения включения сульфированного фгалоцианина алюминия (Фотосенса) внутрь липосомальных наноструктур.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработанный комбинированный спектроскопический метод позволяет одновременно измерять спектры лазерной индуцированной флуореспенции в диапазоне длин волн 690-900 нм, спектры поглощения в диапазоне длин волн 450-630 нм и спектры рассеянного назад лазерного излучения от биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в диапазоне длин волн 660-680 нм в режиме мониторинга.
-
Разработанные спектрально-флуоресцентный комплекс и методы обработки спектров биологических объектов обеспечивают необходимую точность и чувствительность оценки эффективности фотосенсибилизаторов, действующих по механизму передачи электронного возбуждения от фотосенсибилизатора к молекулярному кислороду.
-
Разработанный комбинированный метод позволяет эффективно проводить исследования взаимодействия лазерного излучения с биологическими
объектами, содержащими фотосенсибилизаторы, в диапазоне лазерного излучения от 10 до 800 мВт/см2, с длиной волны от 532 нм до 810 нм.
-
Разработанный математический алгоритм лазерно-индуцированной генерации и тушения синглетного кислорода в биологических средах, содержащих фотосенсибилизаторы, позволяет делать точные дозиметрические расчеты для тестируемого фотосенсибилизатора.
-
Лазерное воздействие длины волны 680 нм в дозах порядка 200 мВт/см2 в течение временного интервала до 20 минут оказывает индуцирующее действие на каталитическую систему сульфированный фталоцианин кобальта (Терафтал) - аскорбиновая кислота.
-
Анализ форм спектров флуоресценции и интенсивности флуоресценции анионных и катионных производных фталоцианинов позволяет определять количество анионного фотосенсибилизатора сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенса) внутри липосомальных наноструктур и в окружающем их растворе.
Практическая значимость
С помощью разработанного комбинированного спектроскопического лазерно-флуоресцентного метода был исследован ряд новых фотосенсибилизаторов, наиболее перспективные из которых были включены в программу внедрения фотосенсибилизаторов в клиническую практику, выполняемую в соответствии с научно-технической программой Правительства Москвы и РАН "Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний" на 2004-2006 гг.
Найденные критерии эффективности фотосенсибилизаторов используются для сравнительной оценки фотосенсибилизаторов в зависимости от типа фотосенсибилизатора и предполагаемой области его применения.
Спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика количественного определения включения сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенс) в липосомальные наноструктуры в настоящее время внедрена в технологию производства липосомальных форм Фотосенса.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ряде научных конференций: на всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты (Москва, 2004-2006 г.г.); на конференции SPIE International Symposium BiOS, Biomedical Optics (San Jose, California, USA, 2005); на IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); на International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics Saratov Fall Meeting (Saratov, 2005), на 11 -th Congress of the European Society for Photobiology (Aix-les-Bains, France, 2005), на Днях экономики Москвы в Баварии (Мюнхен, Германия, 2005), на международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 19 печатных работ, из них 4 в российских реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций, 7 публикаций в материалах российских конференций и 8 публикации в материалах зарубежных конференций.
Объем и структура диссертации. Доклад состоит из введения, четырех глав и заключения. Содержание диссертации изложено на 120 страницах, иллюстрировано 42 рисунками, включает 2 таблицы. Список цитируемых статей в
обзоре литературы включает 74 публикации без участия автора, 19 публикаций с участием автора.
Краткий обзор научной литературы по теме работы
Воздействие лазерного излучения на биологический материал или реакция живой ткани на это излучение обусловлено взаимодействием фотонов и молекул или соединений молекул ткани. Атомарные и молекулярные процессы и последующие биологические реакции выяснены еще не полностью. Известные процессы могут быть подразделены на фотохимическое взаимодействие, термическое взаимодействие и нелинейные процессы. Области доминирующего типа взаимодействия лазерного излучения с биообъектами. Степень того или иного воздействия зависит от свойств лазерного излучения (длина волны, плотность энергии, длительность облучения и частота повторения) и от свойств биологического материала (коэффициент поглощения, коэффициент рассеивания, плотность и т.д.)1.
Биологические ткани являются оптически неоднородными поглощающими средами со средним показателем преломления большим, чем у воздуха, поэтому на границе раздела «биообъект — воздух» часть излучения отражается (Френелевское отражение), а остальная часть проникает в биоткань (рис. 1.2.). За счет многократного рассеяния и поглощения лазерный пучок уширяется и затухает при распространении в биоткани. Объемное рассеяние является причиной распространения значительной доли излучения в обратном направлении (обратное рассеяние). Клеточные мембраны, ядра и органеллы, такие, как митохондрии, а также гранулы меланина в клетках, являются основными рассеивателями для многих биотканей. Поглощенный свет преобразуется в тепло, переизлучается в виде флуоресценции, а также инициирует фотобиохимические реакции . Спектр поглощения определяется типом доминирующих поглощающих центров и содержанием воды в биоткани.
Взаимодействие света с кожей Важной характеристикой биоткани является коэффициент поглощения - Ца, измеряемый в см"1, физический смысл которого — вероятность поглощения на единицу длины пути. Величина, обратная Ua, имеет смысл среднего пути фотона до поглощения. Типичное значение для Ца в красном свете составляет 0.3 см"1, и длина свободного пути фотона до поглощения равен 3.3 см.
Вторым, не менее важным параметром, является коэффициент рассеивания -Us, измеряемый в см"1, и обозначающий вероятность фотона быть рассеянным. Для длины пути L фотона вероятность не быть рассеянным равна exp(-jis L), то есть средний путь фотона до рассеяния внутри ткани равен l/u . Типичное значение для биоткани Us составляет 40 см"1, и свободный путь фотона до рассеяния равен 250 цм. То есть, происходит примерно 130 событий рассеяния, прежде чем фотон поглотится. Во время каждого рассеяния траектория фотона отклоняется на угол 0. Среднее значение cos0 характеризует эффективность рассеяния и называется анизотропией рассеяния, g. Для тканей среднее значение g около 0.9, что соответствует отклонению на 26. Приблизительно, фотон должен рассеяться 1/(1-g) или 10 раз, прежде чем фотон потеряет ориентацию начального направления излучения и станет двигаться в случайных направлениях. В течение первых 10 рассеивающих событий фотон проникает вглубь ткани, а в течение последующих 90 рассеивающих событий перед поглощением движется хаотически. Для вычислений о распространении фотонов часто используют редуцированный коэффициент рассеяния, щ , равный Hs (l-g)3.
Теперь рассмотрим прозрачный раствор с коэффициентом поглощения Ца, равным 0.3 см"1 (близким к биологической ткани). В этом растворе нет рассеяния, только затухание света вследствие поглощения. На рисунке 1.3 показано распространение широкого однородного пучка света в таком прозрачном растворе. После ЗО мм распространения начальное излучение 1 Вт/см2 падает до 407 мВт/см2. Затем добавим к этой среде рассеяние, равное рассеянию в биологической ткани (ц Осм"1; g=0.9 или щ см"1).
Свет проникает не так глубоко в ткань, как в среде без рассеяния, но интегральная плотность потока излучения внутри ткани сразу около поверхности Р(0) равна 3.2 Вт/см , что больше чем 1 Вт/см входящего излучения, Ч о- То есть свет, рассеянный в обратную сторону, повышает уровень интегральной плотности излучения вблизи поверхности.
Выражение (1.1) можно с достаточной точностью использовать только для больших глубин внутри ткани. Для z вблизи поверхности выражение (1.1) неверно. На рисунке 1.3 изображены F(z), соответствующая выражению (1.1), (пунктирная линия) и Ч (г), вычисленная по методу Монте-Карло, (сплошная линия). Метод Монте-Карло базируется на численном моделировании транспорта фотонов в рассеивающей среде. Случайное блуждание фотонов внутри образца биоткани прослеживается от точки влета в образец до его поглощения или выхода из образца .
Значения 5 падают с увеличением длины волны до тех пор, пока в инфракрасной области 700 - 1300 нм не станут примерно постоянными. Свет этих длин волн проникает наиболее глубоко внутрь ткани, и эта область называется терапевтическим окном. Следует отметить, что значения 8 для тканей не очень отличаются от значений 5 для опухолей. Хотя опухоль может обладать оптическими свойствами, слегка отличными от свойств окружающих ее нормальных тканей, в основном нет систематического различия между здоровыми тканями и опухолями. Типичное значение 8 может быть 2-7 мм.
Фактор к — коэффициент обратного рассеяния. Величина к непосредственно связана с диффузным отражением, Rd, которое наблюдается в тканях. Диффузное отражение равно суммарному отражению минус зеркальное отражение с границы раздела «воздух-ткань». Типичные значения Rd для тканей при 630 нм составляют 30-40%, что соответствует величине к, равной 4-5.
Комбинированный спектроскопический метод одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме непрерывного мониторинга
Разработанный нами метод оценки взаимодействия лазерного излучения с биологическими объектами, содержащими ФС, основан на одновременном измерении спектров поглощения гемоглобина, рассеянного назад лазерного излучения и индуцированной лазерным излучением флуоресценции ФС в режиме непрерывного мониторинга во время лазерного облучения.
Поскольку основными рассеивающими свет лазера частицами в растворах, содержащих элементы крови, являются целые эритроциты, то по величине обратного рассеяния лазерного излучения можно определить процессы, происходящие с эритроцитами во время облучения. Так, для системы с эритроцитами в случае их гемолиза хорошо наблюдается гиперосмотическое разбухание (увеличение рассеяния вследствие увеличения размеров рассеивающих частиц) и дальнейший лизис (уменьшение рассеяния вследствие уменьшения количества рассеивающих частиц). Анализируя спектры поглощения окси- и дезокси-гемоглобина в диапазоне длин волн 5КН590 нм, принимая во внимания что скорость диссоциации гемоглобина и кислорода измеряется наносекундами51, можно судить о насыщенности системы кислородом. По спектрам индуцированной лазерным излучением флуоресценции, снимаемым одновременно со спектрами поглощения, но в другом диапазоне длин волн (680 -800 нм), определяется концентрация и характер фотобличинга ФС.
Для измерения спектров поглощения и флуоресценции исследуемых образцов мы использовали волоконно-оптический спектрометр ЛЭСА-01 (Биоспек), спектральное разрешение 8 нм при входной щели 200 мкм. Схема экспериментальной установки приведена на рисунке 2.1. В качестве источника света для возбуждения ФС мы использовали полупроводниковый лазерный источник света с длиной волны 680 нм и максимальной мощностью 2 Вт (Биоспек), что позволяло создавать плотности мощности на образце вплоть 1,5 Вт/см. Излучение лазерного источника доставляли к образцу, используя кварцевое волокно, выходной конец которого фиксировался на расстоянии 1,7 см нормально к образцу. Неоднородность распространения света по поверхности образца не превышала 5 %. В то же самое время образец освещали с обратной стороны светом галогеновой лампы невысокой плотности мощности, прошедшим через широкополосный фильтр, пропускающий излучение 450 - 630 нм. После прохождения через образец, диффузно пропущенный свет, вместе с обратно рассеянным лазерным и флуоресцентным, собирались принимающим волокном. Принимающее кварцевое волокно с сердцевиной диаметром 200 мкм размещали под углом 30 к нормали образца на расстоянии 7 мм от образца. Место на образце, с которого принималось излучение, представляло собой окружность диаметром 3 мм, и было расположено в центре пятна лазерного излучения. Выходной конец принимающего волокна подавал излучение на щель спектрометра. Специальный узкополосный фильтр подавлял обратно рассеянное лазерное излучение на длине 680 нм. Конфигурация фильтра позволяла одновременно фиксировать диффузно пропущенный свет в области 450 -630 нм, обратно рассеянное лазерное излучение длины волны 680 нм и индуцированную лазером флуоресценцию в области 690- -850 нм.
Экспериментальная установка для определения эффективности фотосенсибилизаторов в биологических образцах, а —в тонком слое исследуемого образца, б —в образце в объеме, с — фотография проведения облучения образца тонкого слоя, д - зависимость гемолица эритроцитов в тонком слое образца от плотности мощности и времени лазерного облучения. Следует отметить, что одновременное использование источника белого света не вносило вклада в сигнал флуоресценции, возбуждаемый лазером. Во-первых, перед источником белого света стоял блокирующий фильтр, имеющий коэффициент подавления более чем 105 в спектральной области, где регистрировалась флуоресценция ФС (69(К850 нм). Во- вторых, интенсивность сигнала флуоресценции, возбуждаемая источником белого света, пренебрежимо мала по сравнению с сигналом, возбуждаемым лазерным источником, поскольку мощность источника зондирующего белого света на три порядка меньше интенсивности лазерного излучения, а коэффициент экстинкции исследуемых красителей по крайней мере в 10 раз меньше в полосе источника белого света, чем на длине волны лазерного источника. Экспериментально было подтверждено, что при включенном источнике белого света и выключенном лазерном источнике интенсивность сигнала флуоресценции сравнима с шумами.
Необработанные спектральные данные, получаемые в ходе эксперимента через различные промежутки времени после начала облучения, приведены на рисунке 2.2 сверху. В области 450-К 50 нм данные представляют собой спектр диффузного пропускания без нормировки на источник белого света, острый пик на длине волны 675 нм представляет собой рассеянное назад лазерное излучение, а широкий пик в области 69(Н850 - спектр излучения флуоресценции скорректированного в коротковолновой области подавляющим фильтром. Уменьшение интенсивности флуоресценции в процессе лазерного облучения наблюдаемое на рисунке 2 связано с выгоранием ФС, а изменения в области диффузного пропускания (450-И 50 нм) с изменением степени оксигенации гемоглобина. Для количественного определения степени оксигенации гемоглобина спектры диффузного пропускания пересчитывались в спектры поглощения, которые приведены на рисунке 2.2 снизу. Рисунок 2.2. Спектр излучения от образца, собранного принимающим волокном. С помощью специального программного обеспечения спектр делится на ряд областей для вычисления концентрации и степени оксигенации гемоглобина, обратного рассеяния лазерной линии, флуоресценции ФС.
Из рисунка видно, что в процессе лазерного облучения двугорбый спектр поглощения, соответствующий оксигенированному гемоглобину, трансформируется в одногорбый, характерный для дезоксигенированного гемоглобина. Количественное значение степени оксигенации определялось путем моделирования экспериментального спектра поглощения в виде линейной комбинации спектров окси- и дезоксигемоглобина с соответствующими весовыми коэффициентами методом наименьших квадратов . Относительная ошибка при вычислении степени оксигенации составила не более 3%, а абсолютная — не более 10%.
Лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции
М-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин (коммерческое названием Amplex Red , Molecular Probes; далее, феноксазин) широко используется в биохимических исследованиях для детекции перекиси водорода. В присутствии пероксидазы он реагирует с перекисью водорода, образуя сильно флуоресцирующий краситель - резоруфин, при этом также образуется одна молекула кислорода (рис. 3.1 а)6 "66.
Для регистрации перекиси водорода в реальном масштабе времени, в том числе при воздействии светового облучения с контролируемой плотностью мощности, была разработана следующая установка (рис. 3.2).
Исследуемый раствор помещался в стандартную кварцевую кювету толщиной 2 мм. Объем образца составлял 2x10x10 мм. Далее кювету поворачивали в горизонтальное положение и помещали на предметное стекло. Под действием капиллярных сил исследуемый раствор не выливался из кюветы, лишь поверхность раздела приобретала небольшую кривизну. Для возбуждения флуоресценции резоруфина использовался лазер с длиной волны 532 нм и мощностью 10 мВт. Свет от лазера доставлялся к образцу с помощью кварцевого волокна диаметром 200 мкм. Флуоресценция собиралась с помощью такого же волокна, расположенного в непосредственном контакте с доставляющим волокном. Оба волокна располагались под углом 45 градусов по отношению к поверхности образца, а их торцы находились в 1 мм от поверхности образца. При такой геометрии поперечный размер области зондирования составлял порядка 1 мм, а продольный размер - всю толщину образца. На расстоянии 4 см от поверхности образца размещался торец волокна, по которому подводилось. мощное лазерное излучение (1 Вт, 675 нм). Диаметр пятна на поверхности образца составлял 1.6 см, так чтобы весь образец подвергался лазерному воздействию.
При такой геометрии эксперимента зондируемое волокно занимало фиксированное положение относительно образца. Для определения абсолютной концентрации резоруфина проводили калибровку интенсивности флуоресценции при известной концентрации резоруфина в образце. Толщина образца 2 мм была выбрана исходя из того, чтобы при больших концентрациях резоруфина уменьшить влияние эффекта перепоглощения флуоресценции. Кроме того, при такой толщине можно еще не учитывать неоднородность света от терапевтического лазера по глубине при используемых концентрациях красителей до 5 мкМ.
Интенсивность зондирующего лазера выбиралась таким образом, чтобы с одной стороны обеспечить достаточную чувствительность при детектировании резоруфина, а с другой стороны, чтобы эффекты фотодеструкции от этого лазера были минимальны. Это было проконтролировано путем смещения образца на несколько миллиметров в сторону и регистрации при этом измеряемого сигнала. В случае если влияние зондирующего лазера существенно, то локальные изменения сигнала, вызванные воздействием зонда, будут заметны.
По схеме реакции (рис. 3.1.) на одну молекулу перекиси водорода должна образовываться одна молекула резоруфина. Было проведено титрование сенсорной системы феноксазин - перекоксидаза перекисью водорода в разных средах и при разных концентрациях феноксазина. Замечено, что в чистых ДгО и Н20 после достижения максимума в концентрации резоруфина наступает его разрушение при дальнейшем добавлении перекиси водорода (рис. 3.3). Очевидно, что при концентрации резоруфина, сопоставимой с концентрацией феноксазина, они начинают конкурировать между собой за место субстрата в реакции перексидазы. В случае участия резоруфина в реакции разложения перекиси водорода происходит разрыв кольца красителя. Кроме того, в ДгО коэффициент образования резоруфина на единицу добавленной перекиси водорода чуть больше и максимальная его концентрация чуть выше, чем у Н20. Это можно объяснить тем, что в ДгО активные формы кислорода живут дольше в 4-5 раз , чем в Н20, а несомненно, добавленная перекись водорода частично образует активные радикалы, например, гидроксидный радикал68, которые способны перевести феноксазин в резоруфин даже без участия пероксидазы.
Было проведено сравнение эффективности работы сенсорной системы в зависимости от концентрации феноксазина (рис. 3.4). В диапазоне концентраций от 80 до 5 мкМ/литр феноксазина кривые титрования аналогичны друг другу, а на начальном отрезке, равном примерно 1/10 эквимолярной концентрации перекиси водорода от начальной концентрации феноксазина ведут себя линейно, то есть в пределах этого диапазона можно проводить точные измерения перекиси водорода даже в воде.
В присутствии пероксидазы эффект накопления резоруфина во время лазерного излучения в присутствии фотосенсибилизатора гораздо сильнее (рис. 3.6 с, д). Возможно, что образующийся в результате возбуждения фотосенсибилизатора, синглетный кислород тушится об воду таким образом, что образуются молекулы перекиси водорода, ответственные за переход феноксазина в резоруфин, а возможно, этому переходу способствуют и некоторые другие активные формы кислорода, и пероксидаза в этом случае работает не специфично. При непрерывном лазерном облучении сенсорной системы феноксазин -пероксидаза в присутствии фотосенсибилизатора при достаточно высокой концентрации феиоксазина можно увидеть, что кинетическая кривая разрушения резоруфина выходит на плато, не доходя до нуля (рис. 3.7 а.). То есть достигается условие полного отсутствия молекулярного кислорода в растворе.
При добавлении азида натрия (эффективный тушитель синглетного кислорода) в облучаемую сенсорную систему феноксазин - пероксидаза с фотосенсибилизатором в ДгО было замечено, что азид натрия сильно снижает скорость образования резоруфина в присутствии пероксидазы, в отсутствии пероксидазы наоборот, образование резоруфина было в пять раз сильнее, чем без азида натрия (рис. 3.7 б). Это свидетельствует о том, что при облучении A-Phe переходит в резоруфин и без пероксидазы, но не намного быстрее, чем резоруфин обесцвечивается активными формами кислорода. 3.4. Использование сенсорной системы в присутствии лазерного излучения и фотосенсибилизатора для оценки образования перекиси водорода.
В работах Wentworth Р Jr. и некоторых других исследователей59"61 постулируется, что иммуноглобулины и поверхностные антитела способны катализировать процесс преобразования синглетного кислорода в перекись водорода. Поскольку в результате лазерного облучения фотосенсибилизатора образуется большое количество синглетного кислорода, и до сих пор не вполне ясно, какая часть его тушится физически, а какая — претерпевает химические превращения, и каково долевое соотношение между этими химическими превращениями, то было решено подтвердить или опровергнуть факт того, что в процессе лазерного облучения фотосенсибилизатора образовывается перекись водорода. В работе Bueno et all изучали переход резазурина в резоруфин и влияние воздействия излучения на эти красители в присутсвии различных аминов. Ими было продемонстрировано, что резоруфин, также как и резазурин, может разрушаться под воздействием излучения в присутствии третичных аминов. Результатом этого разрушения является разрыв кольца резоруфина и, как следствие, фотобличинг.
Спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур
Субстанция фотосенса получена в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Москва. Яичный фосфатидилхолин (Е80 и EPCS) и РЕ 18:0/18:0/PEG2000 получены от фирмы «Lipoid», Германия; холестерин приобретен у фирмы «Sigma», Германия; сахароза (ГОСТ 5833-75), Россия; Хлороформ (ГОСТ 20015-74), Россия, катионные производные фталоцианина алюминия — октакис-(пиридинометил)-фталоцианин хлоралюминия октохлорид (А1РсРут8) (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»), Москва, производные кобальта, меди и цинка (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»), Москва.
В работе использовали лазерный электронный спектральный анализатор «ЛЭСА-01-Биоспек», вакуумный насос ВН-464А, испаритель ротационный ИР-1М, оборудование фирмы Миллипор, фильтры «Биопал» Nylon № 66 и "Nuclepore» «Drain disc", "PC Membranes"(pa3Mep nop 0,4; 0,2; 0,1 нм), УЗ-ванна (Transsonix T -310), измеряющий размер наночастиц прибор "Наносайзер" (Submicron Particale Sizer Nicomp 380, (США), Мини-экструдер (Avanti Mini-Extruder до 10 мл), диализные мешочки Dialysis sacks, Avg.flat width 25mm (1.0 in), хроматографическая колонка XK26/20 с адаптером, фирма «Amersham Biosciences АВ»; сорбент (гель на основе декстрана)- Sephadex G-50 superfine, фирма «Amersham Biosciences АВ». Методы.
Методика получения лецитиновых многослойных липосом (МСЛ) Фотосенса, Липосомы получали путем редиспергирования 1% раствором Фотосенса тонкой липидной пленки, образованной упариванием в вакууме на роторном испарителе хлороформного раствора липидов (70% водной фазы). Размер многослойных липосом измеряли на приборе «Наносайзер».
Получение моноламмилярных липосом. Дисперсию многослойных липосом измельчали на экструдере, последовательно пропуская дисперсию через фильтры Nucleopore с размерами пор 0,4; 0,2 мкм. Размер однослойных липосом измеряли на приборе «Наносайзер».
Очистка моноламмилярной липосомальной дисперсии. Для очистки липосомальной дисперсии от невключенного в липосомы фотосенса использовали 2 метода:
Метод диализа. Липосомальную дисперсию фотосенса заливали в диализный мешочек, который в свою очередь помещали в химический стакан с водой (500 мл) и оставляли на 2-е суток при постоянном циркулировании водной фазы при помощи магнитной мешалки. Визуально изменение цвета и прозрачности водной фазы не наблюдали, хотя ранее замечено окрашивание воды даже микро количеством фотосенса. При спектрофотометрическом определении фотосенс в водной фазе не обнаружен.
Метод колоночной хроматографии (гель-фильтрация). Хроматографическую колонку набивали кашицей сорбента Sephadex G-50 superfine, уравновешивали сорбент, путем пропускания дистиллированной воды через колонку. Затем, 3 мл липосомальной дисперсии с Фотосенсом вносили через трубочку адаптера на колонку, чтобы препарат равномерно распределялся на всей поверхности сорбента. В качестве элюента использовали дистиллированную воду. Скорость элюирования была равна 0,5 мл/мин. По мере прохождения препарата через колонку происходило разделение липосомальной формы от не включенного Фотосенса. На выходе получали две фракции: I фракция - липосомальная дисперсия синего цвета. Объем раствора 30-40 мл (рН 6,1-6,5); II фракция свободный Фотосенс, голубой прозрачный раствор. Объем раствора 15-25 мл (рН 6,1-6,5). Анализ среднего диаметра однослойных везикул и стандартное отклонение их распределения проводили в проводящем лазерном луче с помощью фотонного корреляционного анализатора на приборе «Наносайзер». Средний размер частиц липосомальной дисперсии фотосенса колебался от 100 до 250 нм. рН. Величину рН липосомальной дисперсии фотосенса определяли потенциометрически. Для исследуемых образцов эта величина составляла 6,3 — 7,3. Количественное определение фотосенса в липосомальной лекарственной форме. Для определения Фотосенса в липосомальной дисперсии были применены стандартная спектрофотометрическая методика прямого определения вещества с использованием величины удельного показателя поглощения (Е) и новый специально разработанный метод определения концентрации несвязанного Фотосенса в растворе через комплексообразование.
Спектрофотометрическая методика прямого определения вещества с использованием величины удельного показателя поглощения (Е). В электронном спектре поглощения фотосенса имеются две полосы поглощения — при 608 + 2 нм и 678 ± 2 нм, при этом максимум при 678 нм имеет аналитическое значение. Было установлено, что спиртовой раствор фотосенса подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в необходимом диапазоне концентраций от 0,003 до 0,008 мг/мл. При исследовании влияния вспомогательных веществ на спектральные характеристики фотосенса показано, что присутствие фосфатидилхолина, холестерина и ПЭГ-липид 2000 не изменяет положения характеристического максимума, однако эти липиды имеют небольшое собственное поглощение (0,01 при длине волны 678 нм). Для количественного определения фотосенса в липосомах в качестве раствора сравнения был использован раствор «пустых» липосом, приготовленных точно так же, как и липосомальная дисперсия, содержащая Фотосенс. Количество Фотосенса определяли в исходной липосомальной дисперсии и двух фракциях, полученных после гель-фильтрации.
Похожие диссертации на Комбинированный спектроскопический метод анализа эффективности сенсибилизаторов в биологических объектах
