Введение к работе
Актуальность темы. В последнее время в лазерной физике наблюдается все большее смещение интересов и концентрация усилий больших групп исследователей на изучении сложных молекулярных систем, в том числе растворов органических молекул и биологических объектов. С одной стороны, указанная тенденция обусловлена прогрессом, достигнутым в разработке совершенно новых методов лазерного детектирования различных физико-химических превращений и изменений, протекающих в жидкостях и биологических системах, а с другой - это вызвано исключительной научной и практической важностью разрабатываемых проблем. В качестве примера одного из новых научных направлений, возникшего совсем недавно и связанного с изучением сложных молекулярных и биологических систем, достаточно назвать биомедицинскую оптику.
Характерной особенностью жидких молекулярных систем являются флуктуации микроплотности, микрополярности и других микрохарактеристик среды, вызванные тепловым движением молекул и их сегментов. В биологических объектах наряду с тепловыми флуктуациями существуют также градиенты полярности, плотности, вязкости и т.д., обусловленные значительной пространственной гетерогенностью указанных структур. Пространственно-тепловые флуктуации и структурная гетерогенность в жидких молекулярных системах приводит к спектральной гетерогенности флуоресцентных проб в растворах и биологических объектах.
Актуальность исследования этого явления в растворах связана с их широким распространением в физике, химии, биологии и медицине. В квантовой электронике растворы красителей используются в качестве активных лазерных сред, затворов, нелинейных преобразователей света, фоторефрактивных материалов. В химии растворы сложных органических молекул являются базовыми объектами для изучения многих реакций, и в первую очередь, переноса заряда в различных электронных состояниях. Здесь учет флуктуационной природы электронных спектров сложных органических молекул может в будущем сьпрать
2 решающую роль в целенаправлешюм управлении химическими реакциями, так как известно, что сольвагациошше условия сильно влияют на их скорость и механизм. В последнее время стала ясна исключительная важность изучения эффектов пространственно-флуктационной природы в биофизике, ввиду широкого распространения метода флуоресцентного зонда и значительного изменения структуры и характеристик биологических систем на расстояниях сравнимых с размерами молекулы флуорофора. Как показано в данной работе, последнее обстоятельство представляет уникальную возможность селективного возбуждения путем перестройки частоты света отдельных групп флуоресцирующих центров с пространственным разрешением в несколько ангстрем, т.е. на молекулярном уровне этот подход может послужить основой ранней диагностики патологических изменений клеток, вызванных различными причинами, в том числе, облучением людей низкоинтенсивной радиацией.
Связь работы с крупными научными программами и темами. Отдельные этапы работы выполнялись в рамках различных программ и проектов:
- Республиканская комплексная программа "Исследование сверхбыстрых
процессов релаксации и обмена в сложных органических соединениях методами
лазерной кинетической спектроскопии", 1986-1990 гг. (тема "Спектроскопия
2.206");
- Государственная программа по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, 1991-
1995 гг. (раздел 9.І.П., тема "Мембрана");
- Республиканская комплексная программа "Разработка методов кинетической
спектроскопии высокого временного разрешения", 1991-1995 гг. (тема
"Спектроскопия 3.01в");
Республиканская комплексная программа "Закономерности взаимодействия света с веществом и физические основы использования генерации света", 1996-2000 гг.(тема "Квант 17");
Проект Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь "Лазерная селективная спектроскопия с высоким временным разрешением различных природных объектов", 1992-1994 гг;
Проект Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь "Пико- и фемтосекундная спектроскопия органических систем с динамическим неоднородным упшрением электронных спектров", 1995-1997 гг.
Проект Международного научно-технического центра "Лазеры с синхронизацией мод и их применение", 1997-2000 гг.
Лель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в обнаружении, всестороннем доказательстве и использовании для исследования различных процессов нового и важного эффекта, динамического неоднородого упшрения электрошгых спектров сложных органических молекул в жидких растворах и модельных биологических мембранах.
Основные задачи работы, вытекающие из поставленной цели, можно сформулировать следующим образом:
построение физической модели, экспериментальное обнаружение и исследование динамического неоднородного уширения электронных спектров красителей в жидких растворах;
выяснение механизмов спектральной релаксации в двух- и трехкомпонентных растворах красителей при стоксовом и антистоксовом возбуждении;
исследование особенностей вращения электродипольных молекул флуорофоров в полярных растворах и модельных мембранах;
изучение направленного (дисперсного) переноса энергии в полимерных пленках, активированных красителями и фотосинтетическими пигментами;
исследование характера неоднородного уширения электронных спектров и разработка спектроскопической модели флуоресцентньи зондов в модельных биологических мембранах;
использование спектроскопии красного краевого возбуждения для изучения микрохарактеристик модельных биологических мембран;
разработка и создание лазерной аппаратуры, а также методов регистрации спектрально-кинетических характеристик флуоресценции с высоким (10"10-10"9 сек) временным разрешением.
4 Методы проведённого исследования. При выполнении данной работы были разработаны и использовались на различных стадиях исследований несколько лазерных спсктрофлуориметров. Все они включали в качестве источников возбуждения ТЕА-азотные лазеры оригинальной конструкции и накачиваемые ими РОС-лазеры на красителях. Основу регистрирующей системы составляли стробоскопические осциллографы или вольтметры, а также скоростные фотоумножители. Спектрофлуориметры позволяли регистрировать мпювешше спектры флуоресценции и анизотропии испускания (предельное разрешение 200 псек) и кинетику послесвечения с деконволюцией импульса флуоресценции и разложением на экспоненты при широком варьировании частоты возбуждения (337 нм, 365-750 нм). Различные способы измерений на лазерных спектрофлуориметрах защищены 6 авторскими свидетельствами на изобретения.
Научная новизна полученных результатов. В диссертации обнаружено новое явление - динамическое неоднородное уширение электронных спектров двух- и трехкомпонентных растворов красителей. Впервые измерены мгновенные спектры флуоресценции и спектры длительности послесвечения жидких растворов при стоксовом и шгшстоксовом возбуждении. Впервые установлено, что вследствие дополнительного (по отношению к чисто тепловому) вращению молекулы флуорофора в процессе межмолекулярной конфигурационной релаксации скорость деполяризации флуоресценции растворов сложных молекул зависит от частоты регистрации и возбуждения. Развиты представления о направленном харакгере безызлучательного индуктивно-резонансного переноса энергии электронного возбуждения в системах с неоднородно-уширенными спектрами. Впервые показано, что направленный (дисперсный) перенос энергии приводит к длинноволновому сдвигу спектров концентрированных растворов красителей и фотосинтетических пигментов во времени.
В диссертации впервые дано физическое обоснование и получены доказательства спектральной гетерогенности мономерных молекул флуоресцентных зондов в модельных биологических мембранах - лецитшювых липосомах и тенях эритроцитов человека. Впервые, с помощью специальных экспериментов по переносу энергии, доказано, что пространственное разрешение
5 метода флуоресцентного зонда при сканировании частоты возбуждения на красном склоне спектра поглощения флуорофора составляет менее нанометра. Впервые, с помощью модифицированного электрооптического абсорбционного и эмиссионного методов измерены дитюльные моменты в различных электронных состоящих амфифильных флуоресцентных зондов и на этой основе с использованием спектроскопии красного краевого возбуждения получены количествешгъге данные о локальной диэлектрической константе модельных биологических мембран, включая тени эритроцитов крови человека.
В процессе выполнения диссертации разработан типоряд ТЕА-азотных лазеров с коротким (<10'9 сек) импульсом генерации, которые не имеют аналогов в СНГ и предназначены для накачки перестраиваемых субнано- и гшкосекундішх РОС-лазеров на красителях. Создан полностью автоматизированный лазерный спектроф луориметр.
Практическая значимость полученных результатов. Результаты работ автора по динамике формирования спектров испускания и вращению зондов в растворах и мембранах, а также результаты развития этих работ другими исследователями нашли отражение в ряде монографий и учебных пособий, относящихся к различным областям физики, химии, биофизике, в том числе:
Nernkovich N.A., Rubinov A.N., Tomin V.I. Inhomogeneous broadening of electronic spectra of dye molecules I Topics in fluorescence spectroscopy: Ed. Lakowicz J.R.- New York: Plenum Press, 1991.- Vol. 2: Principles.- P. 367-428.
Topics in fluorescence spectroscopy: Biochemical Applications / Ed. Lakowicz J.R.-New York: Plenum Press, 1991.- Vol. 3.
Сольватохромия: Проблемы и методы./ Под. ред. Н. Г. Бахшиева. - Л.: Изд-во Лешппр. ун-та, 1989. - 320 с.
Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. - Киев: Наукова думка, 1988. - 280С.
Demchenko А. P. Ultraviolet spectroscopy of proteins. - Berlin: Springer, 1986. - 320 p.
Гайсенок В. А., Саржевский A. M. Анизотропия поглощения и люминесценции многоатомных молекул. - Минск: Университетское, 1986. - 315 с.
- Левшин Л. В., Салецкий А. М. Люминесценция и ее измерения: Молекулярная люминесценция. - М: Изд-во МГУ, 1989. - 272 с.
Разработанный автором метод исследования распределения физических характеристик мембран клеток с высоким пространственным разрешением планируется адаптировать к применению в клинической практике с целью ранней диагностики патологий щитовидной железы у детей и подростков.
В практическом плане значительный интерес представляют разработанные азотные лазеры с поперечным разрядом низкого и высокого давления, которые используются в таких организациях как НИИ Прикладных физических проблем им. А.Н. Севченко при БГУ (г. Минск). Институт тепло- и массообмена им. А.В. Лыкова НАН Б (г. Минск), НИИ ядерных проблем при БГУ (г. Минск), Объединенный институт ядерных исследований РАН (г. Дубна), Институт химии поверхности НАН Украины (г. Киев) и др. Созданный в процессе выполнения работы автоматизированный лазерный: спектрофлуориметр внедрен в НИИ ядерных проблем при БГУ (г. Минск).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Электронные спектры сложных органических молекул в двух- и трехкомпонентных жидких растворах характеризуются динамическим неоднородным уширением.
-
Выделение избытка энергии межмолекулярных взаимодействий в процессе конфигурационной релаксации приводит к дополнительному (по отношению к чисто тепловому) вращению молекул флуоресцентных зондов в полярных растворах и модельных биологических мембранах.
-
Безызлучательный шідуктивно-резонансіплй перенос энергии электронного возбуждения между химически идентичными молекулами сложных органических соединений в твердых концентрированных растворах вызывает сдвиг спектра флуоресценции во времени, диапазон которого зависит от частоты возбуждающего света.
-
Для молекул флуоресцентных зондов в фосфолшшдных бислойных мембранах характерна спектральная неоднородность. В отличие от растворов она
7 одновременно носит статический и динамический характер, что обусловлено, с одной стороны, распределением флуорофоров по глубине мембраны, а с другой -флуктуациями энергии межмолекулярных взаимодействий для каждой глубины локализации зонда.
5. Исследование характеристик флуоресценции при сканировании частоты возбуждения по красному склону спектра поглощения зонда позволяет получать информацию о распределении микрохарактеристик внутри мембраны с пространственным разрешением, сравнимым с размерами молекулы флуорофора.
Личный вклад соискателя. Содержание диссертации отражает персональный вклад автора в опубликованные работы. Постановка некоторых проблем, а также обсуждение их результатов осуществлялись совместно с академиком А.Н. Рубиновым и профессором В.И. Томиным. Автором осуществлен выбор направлений исследований, сформулирована и обоснована постановка всех экспериментальных и теоретических исследований, проведеїшьгх в период с 1980 по 1998 гг., разработана методика эксперимента и выполнены первые исследования спектральной релаксации в растворах с наносекундным времешшм разрешением при широком варьировании частоты возбуждения. Работы за период с 1985 по 1998 гг. выполнялись автором совместно с руководимыми им сотрудниками и аспирантами. В данной работе частично использованы результаты, вошедшие в кандидатские диссертации Д.М. Гакамского и Ю.В. Звиневича, которые выполнены под научным руководством автора и успешно защищены. Обобщите научных результатов, представлеіпшх к защите сделано лично автором.
Аппробания результатов диссертации» Результаты диссертации представлялись в 62 докладах (в т. ч. - 23 с зачтеїшем, из mrx 11 приглашешшх и/или пленарных) на следующих конференциях:
Лазеры на основе сложных органических соединений и их применение (Душанбе, 1977г.,.Ужгород, 1980 г.);
Международная конференция по люминесценции (Сегед, 1979 г.);
Сибирское совещание по спектроскопии (Томск, 1981 г.);
Всесоюзное совещание по люминесценции (Самарканд, 1979 г., Харьков , 1982
г.);
Республиканская школа-семинар по лазерному, оптическому и спектральному приборостроению (Минск, 1983 и 1985 гг.);
Международная конференция «Оптическая спектроскопия» (Райнхардсбрун, 1984 г., Айзенах, 1988 г.);
Всесоюзное совещание «Люминесценция молекул и кристаллов» (Таллин, 1987
г.);
Всесоюзное совещаіше «Органические люмшюфоры и их применение в народном хозяйстве» (Харьков, 1987 г.);
Семинар «Лазерная спектроскопия сложных молекул» (Лохусалу, 1988 г.);
Международная конфереіщия по когереігпюй и нелинейной оптике (Минск, 1988 г.);
Всесоюзный съезд по спектроскопии (Киев, 1988 г.);
Международный симпозиум «Сверхбыстрые процессы в спектроскопии» (Нойбранденбург, 1989 г., Байроут, 1991 г., Вильнюс, 1993 г.);
Международная конференция «Статистическая механика химических реакций в жидкости» (Новосибирск, 1989 г.);
Международная конференция « Применение лазеров в науках о жизни » (Москва, 1990 г., Ювяскула, 1992 г., Минск, 1994 г., Йена, 1996 г.);
Всесоюзное совещание по фотохимии (Новосибирск, 1989 г.);
Европейский конгресс по молекулярной спектроскопии (Дрезден, 1989 г., Вена, 1992 г.);
Международная конфереіщия по лазерной спектроскопии (Печ, 1989 г.);
Конгресс международной комиссии по оптике (Будапешт, 1993 г.);
ШРАС симпозиум по фотохимии (Прага, 1994 г.);
Северный симпозиум по компьютерным расчетам (Эспоо, 1993 г.);
Международный симпозиум по биомедицинской оптике (Будапешт, 1993 г., Лос-Анжелес, 1994 г., Сан Хосе 1995 г. ,1998 г.);
Международная конференция по люминесценции (Москва, 1994 г.);
Симпозиум по биомедицинской оптике «Европа'94» (Лилль, 1994 г.);
Международная конференция по лазерной физике и спектроскопии (Гродно, 1995 и 1997 гг.);
Международный симпозиум по фотофизике и фотохимии молекул и ионов (Санкт-Петербург, 1996 г.);
Европейская конференция по лазерам и электрооптике (Гамбург, 1996 г.);
Международная конференция «Свет и биологические системы» (Вроцлав, 1995
г.);
Русско-немецкий семинар по лазерной физике (Бонн, 1996 г.);
Международная конференция но методам и применениям флуоресцентной спектроскопии (Берлин, 1997 г.);
Европейская конфереіщия по спектроскопии биологических молекул (Сап Лоренцо, 1997 г.).
Опубликованность результатов. Результаты диссертации опубликованы в 1 монографии и 5 препринтах, 53 статьях (в том числе 3 обзорные статьи, 12 статей в меиедународных журналах, 24 статьи в журналах СНГ, 14 статей в сборниках трудов международных конференций), в шести описаниях изобретешга к авторским свидетельствам, а также в 62 тезисах конференций. Общий объём опубликованных материалов составляет 637 страниц.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 7 глав, основных выводов, приложения, списка использованных источников и содержит 205 страниц текста, вкшочая 49 рисунков, 13 таблиц и список литературы из 314 наименований.
