Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Куприянович Юлия Николаевна

Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов
<
Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Куприянович Юлия Николаевна. Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.03 / Куприянович Юлия Николаевна; [Место защиты: Иркут. ин-т химии им. А.Е. Фаворского СО РАН].- Иркутск, 2009.- 142 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-2/232

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Ферментативное окисление ароматических соединений In Vivo и In Vitro 9

1.1. Оксидоредуктазные ферменты. Лакказа. Пероксидаза 10

1.2. Основные типы связей и структур в макромолекулах лигнина 17

1.3. Дегидрогенизационная полимеризация фенольных предшественников лигнина. Bulk- и end-wise- дегидрополимеры 21

1.4. Органический синтез в условиях in vitro ферменткатализируемых реакций 26

1.4.1. Окисление фенольных соединений в присутствии оксидоредуктазных ферментов 27

1.4.2. Ферменткатализируемая полимеризация виниловых соединений 33

1.4.3. Использование ферментативного катализа для получения электропроводящих полимеров 34

Глава 2. Ферменткатализируемое окисление фенольных соединений

2.1. Субстратная специфичность и кинетические характеристики оксидоредуктазных ферментов 39

2.2. Дегидрополимеризация фенольных соединений, катализируемая ферментами. Исследование химической структуры полимеров 48

2.2.1.Ферментативное окисление 2-метоксифенола (гваякола) 49

2.2.2. Ферментативное окисление 2,6-диметоксифенола (сирингола) 64

2.2.3. Ферментативное окисление фенолов с гваяцилпропановым типом замещения кольца. Окисление феруловой кислоты 76

2.2.4. Ферментативное окисление эвгенола 86

2.2.5. Ферментативное окисление а-гваяцилпропанола 92

2.2.6. Роль динамических условий и природы фермента в процессах дегидрополимеризации фенольных соединений 97

2.3. Окислительная полимеризация пиррола в присутствии пероксидазы хрена 103

Глава 3. Объекты исследования и методика эксперимента

3.1. Исходные вещества 109

3.2. Методы определения активности ферментов 110

3.3. Определение биохимических и кинетических характеристик ферментов 110

3.4. Ферментативное окисление фенольных субстратов

3.4.1. Окисление гваякола 111

3.4.2. Окисление сирингола 112

3.4.3. Окисление феруловой кислоты 113

3.4.4. Окисление эвгенола 115

3.4.5. Окисление а-гваяцилпропанола 115

3.5. Окисление пиррола 116

3.6. Молекулярно-массовый анализ полимеров 117

3.7. Спектроскопия ЯМР 117

3.8. ЭПР 118

3.9. Определение электронной проводимости полипирролов 118

3.10. Хроматографические методы 119

Выводы 120

Список литературы 122

Приложение 1 140

Введение к работе

В последнее время резко возрос интерес к in vitro ферментативно катализируемому органическому синтезу [1]. Несмотря на то, что эффективность и рациональность биотехнологических методов проверена столетиями, возможность использования индивидуальных ферментных препаратов появилась не так давно. Связано это как с совершенствованием методик скрининга продуцентов ферментов, методов выделения и очистки, так и с появлением рекомбинантных ферментов [2]. В настоящее время промышленное получение технических ферментов является экономически выгодным, о чем свидетельствует возрастающий объем продаж на мировом рынке. Ужесточение требований к экологической безопасности химических процессов также является одной из причин все возрастающего интереса к ферментативному катализу [3].

Использование ферментов в органическом синтезе имеет ряд преимуществ:

катализируемая ферментами реакция протекает в мягких в отношении температуры, давления, рН условиях и не является энергоемкой;

ферменты как катализаторы имеют высокую энантио-, регио- и хемоселективность, что обеспечивает возможность получения новых функционализированных соединений, в том числе и лекарственных препаратов;

ферменты являются природными нетоксичными катализаторами, а ферментативный катализ представляет собой пример "зеленой" химии и является экологически обоснованным [4, 5].

В промышленных биокаталитических процессах широко используются различные ферменты [1, 6-8]. Особый интерес представляют собой оксидоредуктазные ферменты, основными субстратами которых являются фенолы и ароматические амины. Каталитические свойства этих ферментов дают возможность их использования в целлюлозно-бумажной промышленности

для биоделигнификации, детоксикации и обесцвечивания сточных вод, разрушения ксенобиотиков, получения древесно-волокнистых плит без токсичных связующих [4, 9-13]. Широкое применение находят эти ферменты в медицине при создании различного рода диагностикумов и биосенсоров [2]. Оксидоредуктазные ферменты обнаружены в биологических объектах различного уровня организации, от прокариот до высших организмов. Естественной биологической функцией оксидоредуктаз является окисление фенольных соединений и участие в процессах биосинтеза и биодеструкции веществ лигниновой природы [14-16]. Лигнин - один из самых распространенных природных полимеров. Но, несмотря на многолетние исследования, остаются открытыми вопросы о строении этого биополимера, его структурной организации и особенностях биосинтеза [17-20].

Исследование процесса ферментативной дегидрополимеризации фенольных соединений, моделирующих структурные элементы лигнина, представляет интерес с точки зрения установления закономерностей формирования сложной макромолекулы этого полимера [21-23]. Актуальной задачей в этом плане является исследование взаимосвязи между условиями ферментативного окисления in vitro и регионаправленностью, а также макромолекулярными характеристиками дегидрополимеров. В первую очередь, это вариации скорости поступления субстрата в зону реакции и соотношения фермент - субстрат, которые позволяют получить структуры различного топологического строения: end-wise- и bulk-типа. Решение данной задачи может служить более широким целям, а, именно, создать основу для возможности регулирования процесса ферментативного окисления и направленного синтеза полимеров с заданными свойствами.

Лакказа и пероксидаза являются наиболее доступными ферментами класса оксидоредуктаз. Субстратная специфичность этих ферментов позволяет вовлекать в реакции окисления широкий круг субстратов, включая о-, п-дифенолы, аминофенолы, ароматические амины, полифенолы и полиамины, некоторые неорганические ионы [24]. Существенно расширить область

практического применения этих ферментов возможно при использовании эффективных фермент-медиаторных систем, способных катализировать окисление субстратов, которые в обычных условиях не окисляются или подвергаются окислению с невысокой скоростью [15, 25-28]. Обширные исследования, ведущиеся в направлении поиска новых активных форм оксидоредуктазных ферментов, их модификации, повышающей стабильность и диапазон действия, а также работы, связанные с ферментативным синтезом полимеров, подтверждают значимость развития биокатализа в этой области.

Исследование процессов ферментативного окисления фенольных соединений под действием оксидоредуктазных ферментов дает возможность расширить представления о процессах лигнификации. Знание закономерностей процессов дегидрополимеризации позволяет развить подходы к ферменткатализируемому синтезу полимеров на основе не только фенолов, но и других практически значимых мономеров, таких как анилин, пиррол, тиофен.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении закономерностей ферментативного окисления моно- и дизамещенных фенолов, азотсодержащих гетероциклических соединений в различных динамических условиях, исследовании строения и свойств продуктов дегидрополимеризации. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- изучение основных физико-химических характеристик и субстратной
специфичности лакказы Trametes versicolor и пероксидазы хрена для
подбора оптимальных условий окисления субстратов;

- исследование динамики ферментативного окисления мономерных
предшественников лигнина (гваякола, сирингола, феруловой кислоты, а-
гваяцилпропанола, эвгенола) и N-гетероциклических соединений (на
примере пиррола) в условиях end-wise и bulk протекания процесса;

изучение особенностей химического строения продуктов ферментативного окисления гваякола, сирингола, феруловой кислоты,

а-гваяцилпропанола, эвгенола, пиррола и влияния условий синтеза in vitro

на свойства энзиматических дегидрополимеров.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено систематическое исследование процессов ферментативного окисления ряда фенольных соединений в разных динамических условиях синтеза и установлено, что режим подачи мономера в зону реакции влияет на параметры химической структуры продуктов дегидрополимеризации: соотношение образующихся арил-арильных и арил-эфирных связей в полимерах, молекулярную массу, степень конденсированности и полидисперсности, термическую устойчивость.

Проведено исследование влияния природы фермента на направленность
протекания процессов окислительного сочетания фенольных

предшественников лигнина, катализируемых лакказной и пероксидазной системами. Получены количественные характеристики внутримолекулярных арил-арильных и арил-эфирных связей в фенольных дегидрополимерах endwise- и bulk-типов. Показано, что лакказа в условиях in vitro способствует протеканию таких процессов как деметоксилирование ароматических субстратов, окисление боковой пропановой цепи и, в ряде случаев, реакций разрыва ароматического кольца. Для соединений с гваяцилпропановым типом замещения кольца направление реакции зависит от степени окисленности атома Са алифатической цепи.

Впервые изучены особенности ферментативного окисления в присутствии пероксидазы хрена N-гетероциклических соединений на примере пиррола. Установлено, что скорость реакции и степень конверсии субстрата можно регулировать введением медиатора. В присутствии различных допантов получены электропроводящие композиты полипиррола.

Полученные данные о химической структуре энзиматических дегидрополимеров, закономерностях катализа в присутствии лакказы и пероксидазы, влиянии динамических условий синтеза позволяют планировать новые подходы к изучению процессов формирования соединений нерегулярной

структуры. Выявление взаимосвязи "условия синтеза — строение - свойства" открывает возможности создания в условиях ферменткатализируемого органического синтеза веществ с заданными свойствами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XX-XXIII Международных конференциях по полифенолам (Freising-Weihenstephan, Germany, 2000; Marrakech-Morocco, 2002; Helsinki, Finland, 2004; Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006), 5-м Международном симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент, 2003), III Всероссийской конференции по химии и технологии растительных веществ (Саратов, 2004), VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004), II Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2005), Международной конференции по органической химии "Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности" (С.Петербург, 2006).

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН по теме: "Развитие химии и глубокой переработки древесины: получение новых биологически активных и технически ценных продуктов для медицины, сельского хозяйства и критических технологий" (№ государственной регистрации 0120.0 46380) и при финансовой поддержке РФФИ: грант № 01-03-97-204 "Исследование биокаталитических реакций окисления лигнинов и ароматических соединений -компонентов донных отложений озера Байкал", 2001-2003 гг.; грант № 05-04-97-269 "Биохимическая эволюция вещества лигноцеллюлозных отходов Прибайкалья", 2005-2007 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста,

содержит 18 таблиц, 19 рисунков, 1 приложение. Список литературы включает 183 наименований.

Сокращения, принятые в тексте:

Е - фермент

Л - лакказа

ПХ - пероксидаза хрена

ДГП - дегидрополимер

Км - константа Михаэлиса

Vmax - скорость максимальная

EW - полимеры end-wise-типа

В - полимеры bulk-типа

АК - ароматическое кольцо

СА - степень ароматичности

ПП - полипиррол

СПС - сульфатированный полистирол

АБТС - 2,2'-азино-бис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфонат)аммония

Основные типы связей и структур в макромолекулах лигнина

Лигнин является одним из наиболее распространенных органических полимеров в природе. Будучи обязательным структурным компонентом практически всех наземных растений, он составляет, по подсчетам различных авторов, до 25 % сухой фотосинтезирующей биомассы [60]. С функциональной точки зрения лигнин принимает участие в увеличении прочности клеточных стенок растений, облегчает водный транспорт и препятствует деградации полисахаридов клеточной стенки [17, 61, 62]. Лигнин, вследствие особого характера процесса полимеризации, протекающего при его образовании, имеет очень сложную структуру. Примерно 60 лет назад было признано, что лигнин - это полимер нерегулярного строения, образованный путем энзиматической дегидрогенизационной полимеризации из трех основных предшественников — кониферилового (4), синапового (5) и «-кумарового (6) спиртов [33]: R2 6 (4)R1 = Н, R2 = OCH3 -а (5)R1,R2 = OCH3 СНпОН /мр1 р2 = з—г ьм2им (6)R\R2 = H R1 Это был достаточно упрощенный взгляд, и в настоящее время известно много примеров, подтверждающих, что и другие фенолы могут быть включены в структуру лигнина [63]. Лигнин лиственных пород древесины состоит преимущественно из фенилпропановых единиц синапового (сирингильного) типа. В меньших количествах присутствуют единицы кониферилового (гваяцильного) и кумарового (я-гидроксифенильного) типов. Лигнин хвойных пород построен в основном из фенилпропановых единиц кониферилового типа. Единого соотношения фенилпропановых единиц различного типа в ряду как хвойных, так и лиственных лигнинов дать невозможно, потому что состав лигнина зависит от вида древесины, типа тканей и локализации в клеточной стенке [64-67]. Дегидрогенизационная полимеризация первичных предшественников лигнина - сложный процесс, который почти невозможно изучать in vivo. Существующие представления об этом процессе целиком основаны на модельных опытах дегидрогенизационной полимеризации кониферилового и, в значительно меньшей степени, и-кумарового и синапового спиртов. Лигнины хвойных, в связи с их преимущественным построением из единиц гваяцильного типа, являются более удобным объектом моделирования. Фрейденбергом было показано, что под действием ферментативных систем окисления (лакказа / 02 и пероксидаза / Н202) из кониферилового спирта образуются феноксильные радикалы [17]:

Радикалы спирта далее сочетаются различными способами уже без участия фермента и дают хинонметиды, которые играют ключевую роль в формировании макромолекулы лигнина в качестве реакционноспособных интермедиатов. Димерные хинонметиды превращаются в различные дилигнолы путем присоединения воды или при нуклеофильной атаке бензольного углерода первичным спиртом или хинонметидной группой.

Лигнин не является индивидуальным веществом, а представляет собой смесь нерегулярных сополимеров. Представить его химическое строение в виде структурной формулы невозможно, можно лишь говорить о типах связей между структурными единицами (табл. 1.2.1) и предположительных схемах строения макромолекул. В лигнине имеется два основных типа связей: углерод-кислородные связи (простые эфирные) и углерод-углеродные [33]. Простая эфирная связь образуется, в основном, между ароматическим кольцом и боковой цепочкой, и в небольшом количестве присутствует диарильная простая эфирная связь. Кроме того, в лигнине существуют диалкильные простые эфирные связи.

Структура с алкиларильной простой эфирной связью fi-O-4 (7) является основной структурой в макромолекуле лигнина. Считают, что в связь такого типа вовлечена 1/3 структурных единиц лигнина [68]. Структуры типа пинорезинола (8) относят к структурам лигнанов (димеры фенилпропанов, присутствуют в экстрактивных веществах). Структура со связью а-О-4 существует в лигнине в основном в виде циклической структуры, содержащей одновременно углерод-углеродную связь (3-5 (9) [69]. В небольшом количестве присутствуют нециклические структуры со связью а-О-4 [70]. Структуры с диарильной простой эфирной связью присутствуют, по-видимому, в небольших количествах.

Одним из основных видов структур с углерод-углеродной связью являются структуры со связью ft-5 . Они могут существовать в виде открытой и закрытой (9) (фенилкумаровой) форм. Структуры с бифенильной связью 5-5 (12) также достаточно распространены [33]. Кроме вышеуказанных типов связей в лигнине находят углеродные связи в положениях J3-1 , 5-Г, а-а и другие [16]. Лигнин содержит большое разнообразие функциональных групп - метоксильных, фенольных гидроксильных, первичных и вторичных алифатических гидроксильных, карбонильных (кетонных и альдегидных), некоторое количество карбоксильных групп. Неоднородность лигнина и его полифункциональность являются причиной того, что вопрос о строении лигнина до сих пор не решен однозначно.

Ферменткатализируемая полимеризация виниловых соединений

В последние годы была продемонстрирована возможность ферментативно катализируемой полимеризации виниловых соединений и показана возможность контроля молекулярной массы и выхода полимеров в зависимости от условий синтеза [113, 114]. Проведена ферментативная полимеризация таких соединений как акриламид, метилметакрилат, стирол и его производные, 2-винилнафталина с использованием лакказы, пероксидазы хрена, Мп-зависимой пероксидазы [113, 115-118]. Сообщалось, что лакказа способна катализировать полимеризацию акрил амида в воде в отсутствие инициатора [119], но в большинстве случаев для генерации полимера требовался инициатор - /?-дикетон; в этом случае полимеризация протекала при комнатной температуре и с высокой степенью конверсии мономера. В случае пероксидаза-катализируемой реакции механизм включает на первой стадии генерацию активной формы фермента под действием Н202, затем окисление инициатора под действием фермента с образованием радикальной формы, которая генерирует радикал мономера, и дальнейшая реакция носит характер радикальной цепной полимеризации. При этом концентрация инициатора и пероксида водорода влияет на выход полимера и его молекулярно-массовые характеристики. Была также показана возможность сополимеризации лигнина с акриламидом в присутствии лакказы [120]. Энзиматически полученный полимер был умеренно растворим в воде и водно-диоксановых растворах. Однако, в этих случаях, правильнее было бы говорить не о ферментативной полимеризации, а о фермент-инициируемом процессе. Механизмы полимеризации виниловых соединений под действием окислительного фермента вряд ли будут отличаться от обычной химически-инициируемой радикальной полимеризации. Тем не менее, можно отметить такие преимущества проведения процесса, как возможность регулирования молекулярной массы и полидисперсности полимерных продуктов.

Среди различных применений оксидазных ферментов в биокатализе хочется отметить возможность получения с их помощью таких полимеров, как полианилин и полипиррол, которые, будучи допированы, обладают электропроводящими свойствами. Проводящий комплекс полианилин-сульфатированный полистирол (СПС) был получен с использованием пероксидазы хрена [121, 122] в фосфатном буфере при рН 4.3, а также с иммобилизованным на хитозане ферментом [123]. Лакказа также способна катализировать образование проводящего комплекса [124]. Аналогичный комплекс получали окислением пероксидазами из пальмового дерева [125]. Эти ферменты обладали необычайной стабильностью в широком диапазоне температур и значений рН.

Кроме того, СПС содержит в своем составе противоион для допирования и придает необходимый анионный заряд комплексу, способствуя хорошей водорастворимо сти полимера в ходе реакции. Проводимость пленок и волокон на основе комплекса полианилин / СПС была определена как 10 4 и 10"3 С/см, соответственно. Авторы связывают достаточно низкие значения электропроводности полученного комплекса по сравнению с химически синтезированным полианилином (1-10 С/см) со снижением межцепочечной диффузии заряда из-за пространственного разделения цепей полианилина молекулами СПС, в результате чего полианилиновый комплекс оказывается недостаточно допирован. Действительно, обработка полученных волокон парами НО приводила к увеличению электропроводности до 10"2 С/см. Возможно, оптимизация условий полимеризации и формирования волокон будет способствовать дальнейшему улучшению электропроводящих характеристик полимера.

Аналогичный подход был применен при ферментативном синтезе водорастворимого комплекса поли(о-толуидина) / СПС [126]. Пероксидаза катализировала полимеризацию о-фенилендиамина в водном диоксане, давая растворимый полимер с молекулярным весом 20 кДа. По данным ЯМР полученный полимер состоял из иминофениленовых единиц. В литературе имеются данные о том, что пероксидаза способна катализировать полимеризацию и других аминопроизводных, таких как я-аминобензойная кислота, и-аминофенилметилкарбитол, 2,5-диаминобензсульфонат, производных анилина [56].

Роль подложки при синтезе проводящих форм полианилина обсуждается в работе [127]. Локальное молекулярное окружение, создающее определенный рН и плотность заряда, отличается от такового в основной массе раствора и является своего рода "нанореактором", который однозначно контролирует и направляет ферментативный синтез полианилина. Так, водные мицеллы, образующиеся в присутствии додецилбензсульфоната натрия, служат нанореактором и обеспечивают более низкие значения рН и гидрофобное окружение, что способствует формированию именно проводящих форм полианилина. Аналогичным "нанореактором" служит и ДНК: образующийся в присутствии этой кислоты электроактивный полимерный комплекс открывает новые возможности формирования биосенсоров и диагностикумов [30].

Электропроводящий полипиррол и его производные представляют особый интерес благодаря высокой проводимости и стабильности в окисленном состоянии. Результаты исследований ферментативной полимеризации пиррола появились в литературе совсем недавно. Одна из работ [128] связана с получением водорастворимого комплекса полипиррола с СПС в присутствии пероксидазы хрена. Однако в данной работе вызывает сомнение ферментативный характер процесса: полимеризация проводилась при рН 2.0 в среде НС1. В таких условиях, по нашим данным, ферментативная активность фермента приближается к нулю, а окисление и полимеризация пиррола может протекать неферментативно.

СН3 Было показано, что полимеризация протекает в обоих случаях, но скорость процесса гораздо выше при использовании АБТС. Включение АБТС в реакцию привело к двум важным следствиям: во-первых, реакция протекала достаточно быстро для того, чтобы формировалась полимерная пленка, а не олигомерный осадок, во-вторых, АБТС оставался в полимерной пленке и служил редокс-активным допантом.

Дегидрополимеризация фенольных соединений, катализируемая ферментами. Исследование химической структуры полимеров

Первой ступенью образования макромолекулы лигнина является ферментативная дегидрогенизация фенольных предшественников. Образующиеся в результате этого процесса феноксильные радикалы стабилизированы пятью резонансными структурами (см. раздел 1.2). Частота участия в реакциях сочетания различных положений определяется относительной электронной плотностью. На начальном этапе полимеризации происходит образование димерных структур в результате рекомбинации радикалов. Дальнейший процесс может включать как ферментативную дегидрогенизацию димеров и рекомбинацию образующихся радикальных центров с радикалами мономера или между собой, так и реакции с участием ОН-групп мономеров, димеров и реакционноспособных хинонметидов. Кроме реакций сочетания могут протекать побочные реакции присоединения воды к хинонметидам или деструкции мономерного звена.

Несмотря на общность процессов ферментативного окисления, дегидрогенизация фенолов приводит к различным по строению полимерным продуктам. Нами было проведено исследование продуктов ферментативного окисления ряда фенольных соединений, а также, с привлечением квантово-химических расчетов, исследованы процессы дегидрогенизационной полимеризации гваякола и сирингола. 2.2.1. Ферментативное окисление 2-метоксифенола (гваякола) Сочетание радикалов возможно шестью способами с образованием соответствующих эфиров, пероксидов и дифенильных структур (табл. 2.2.1.1). Нами были выполнены квантово-химические расчеты теплот образования АН/ продуктов реакции радикала с молекулой в полуэмпирическом приближении AMI [131] и показано, что могут возникать два типа физически устойчивых интермедиатов - радикал-аддуктов. Образуются они посредством связей О-С и С-С.

Образование таутомеров радикала этого соединения завершает стадию инициирования. Квантово-химические вычисления свидетельствуют о том, что при образовании соединений, содержащих три мономерных фрагмента (терфенилов), по-прежнему самым вероятным остается процесс рекомбинации радикалов посредством сочетания С-С.

Наименее выгодны реакции, приводящие к образованию о-терфенила (здесь о-, м-, п- — относительное расположение двух крайних АК как заместителей при среднем кольце), дальнейшее развитие цепи по этому направлению, вероятно, невозможно. Относительный выход м- и и-терфенилов согласно расчетам составляет приблизительно 7:3, соответственно.

Многие исследователи сообщали о том, что гваякол окисляется системой пероксидазы с образованием продукта красного цвета [17, 38]. В работе [132] при действии пероксида водорода и пероксидазы на раствор гваякола в ацетатном буфере (рН 5) был получен красно-коричневый осадок с металлическим блеском, в составе которого удалось идентифицировать 6-6 димер и 4-4 дифенохинон. Под действием Mn-зависимой пероксидазы в водно-органических системах были получены полимерные продукты на основе гваякола и было показано, что мономерные единицы в полимерах связаны ариларильными и арил-эфирными связями [94]. Полимеры, образующиеся из гваякола, имеют нерегулярное строение. Для нас представлял интерес анализ распределения различных типов связей и структурных фрагментов в полимерах, а также влияние таких параметров как динамическая концентрация мономера в процессе полимеризации и характер окислительной системы на химическую неоднородность образующегося полимерного продукта. Для этого в присутствии лакказы и пероксидазы было проведено окисление гваякола в режиме однократного добавления субстрата (В-полимер) и при медленном введении мономера (EW-полимер).

Окисление гваякола в присутствии лакказы Полимерные продукты, полученные в условиях лакказного окисления, представляют собой твердые вещества красно-коричневого цвета. Их растворы в органических растворителях приобретают темно-красную окраску, обусловленную наличием полосы поглощения (400-560 нм) в видимой области спектра. В работе [133] длинноволновое поглощение приписано дифенохинонам. Форма этой полосы чувствительна к условиям получения полимера (рис. 2.2.1.1). В УФ-спектре В-полимера она узкая и почти симметричная. У EW-полимера в этой области спектра наблюдается очень широкая полоса поглощения, контур которой представляет собой огибающую, как минимум, двух компонент. Из вида спектров следует, что строение дифенохиноидных фрагментов полимеров определяется условиями их получения.

Спектры ЯМР Н и С полимеров содержат сигналы, характеризующие наличие одних и тех же структур. В спектрах ЯМР Н полимеров, зарегистрированных в растворе ГМФА-dig, наблюдаются резонансные сигналы фенольных групп ОН (свидетельство того, что реакция ограничения цепи С-С не является исчерпывающей), атомов водорода ароматических колец и метоксильных групп.

В спектре ЯМР С наблюдаются характерные уширенные сигналы полимерных соединений. Резонансные сигналы в области 190-180 м.д. принадлежат группам С=0 п- и о-хиноидных структур. В диапазоне 154-150 м.д. лежат сигналы атомов С2 хиноидных структур, а также атомов С2, С4 структур, образующихся путем С-О-С сочетания.

Методы определения активности ферментов

Термостабильность фермента изучали при 40, 50, 60 С в воде и 0.1 М ацетатном буфере рН 4.5. Активность фермента контролировали по окислению сирингалдазина (0.1 М ацетатный буфер рН 5.5, 15 мкМ сирингалдазин, є525 65000 M W). рН-стабильность пероксидазы и рН-оптимум действия определяли в интервале рН от 2.5 до 7.5 при 24 С в 0.1 М ацетатном, фосфатном и универсальном буфере. Термостабильность фермента изучали при 45, 60 С в воде, 0.1 М фосфатном буфере рН 5.9 и водно-спиртовых растворах (25, 50, 75 % ЕЮН). Активность фермента контролировали по окислению о-дианизидина. Зависимость скорости окисления от концентрации Н202 исследовали в интервале от 0.04 до 40 мМ на примере окисления АБТС (0.36 мМ), гваякола (9 мМ), феруловой кислоты (1мМ).

Синтез EW-полимера: 20 мл 10 % водно-спиртового (9:1) раствора гваякола дозировано (по каплям) приливали к 60 мл раствора лакказы (54 мл воды и 6 мл раствора фермента с активностью 1.2 ед/мл). Контроль за ходом реакции осуществляли методом ВЭЖХ по содержанию в растворе гваякола. Реакцию проводили при 22 С в течение 10 суток. Выпавший полимер отфильтровывали, фильтрат экстрагировали хлороформом. Упаренный экстракт объединяли с осадком, промывали водой, фильтровали, сушили в вакууме. Выход полимера составил 85 %, элементный состав (% масс): С 78.72, Н6.28.

Синтез В-полимера: к раствору лакказы (54 мл воды и 6 мл раствора фермента с активностью 1.2 ед/мл) однократно добавляли 20 мл 10 % водно-спиртового (9:1) раствора гваякола. Реакцию проводили при 22 С в течение 10 суток до полного исчезновения в растворе гваякола. Выпавший осадок отфильтровывали, фильтрат экстрагировали хлороформом. Упаренный экстракт объединяли с осадком, промывали водой, фильтровали, сушили в вакууме. Выход полимера составил 87 %, элементный состав (% масс): С 79.30, Н 5.66.

Синтез EW-полимера проводили следующим образом: к раствору, содержащему 100 мл 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.0), 100 мл этанола, 50 мл воды, 2 мл 1 % водного раствора пероксидазы хрена (активность фермента составляла 540 ед/мг) по каплям добавляли 1 % спиртовый раствор гваякола, содержащий 0.5 % Н202. Введение субстрата прекращали при появлении пика гваякола в пробах, анализируемых методом ВЭЖХ. Реакцию вели при перемешивании, при температуре 22 С в течение 6 суток. По окончании реакции раствор подкисляли 2 н H2SO4 до рН 2.5. Осадок центрифугировали, промывали водой и повторно центрифугировали, фильтровали, сушили в вакууме. Выход полимера составил 96 %, элементный состав (% масс): С 64.30, Н4.88.

Для синтеза В-полимера к раствору, содержащему 100 мл 0.1 М фосфатного буфера (рН 5.9 или рН 7.0), 100 мл 1 % спиртового раствора гваякола, 100 мл 0.3 % водного раствора Н202 добавляли 2 мл 1 % водного раствора пероксидазы хрена (активность фермента составляла 540 ед/мг). При добавлении фермента раствор приобретал темно-красную окраску. Через 2-3 часа раствор начинал мутнеть, после чего возобновляли перемешивание: Окисление проводили при периодическом перемешивании, при температуре 22 С в течение 10 суток. По окончании реакции раствор подкисляли 2 н H2SO4 до рН 2.5. Через сутки осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили в вакууме. Выход полимера (рН 5.9) составил 28 %, элементный состав (% масс): С 68.11, Н 5.25; выход полимера (рН 7.0) составил 98.5 %, элементный состав (% масс): С 68.09, Н 5.17.

Синтез EW-полимера: к раствору фермента лакказы (50 мл, активность 0.22 ед/мл) по каплям приливали 100 мл 0.2 % водно-спиртового (60:1) раствора сирингола. Контроль содержания в реакционной смеси сирингола осуществляли методом ВЭЖХ. При появлении в пробе сирингола добавление мономера прекращали. Реакцию вели при температуре 22 С в течение 6 суток. Выпавший осадок отфильтровывали и промывали водой, затем сушили в вакууме. Выход полимера составил 99.5 %. Элементный состав (% масс): С 62.30, Н 7.81.

Синтез В-полимера: к раствору фермента лакказы (50 мл, активность 0.22 ед/мл) однократно добавляли 25 мл 0.8 % водно-спиртового (15:1) раствора сирингола. Реакцию вели при температуре 22 С в течение 6 суток до исчезновения в растворе свободного мономера. Выпавший полимер отфильтровывали и промывали водой, затем сушили в вакууме. Выход полимера составил 96.8 %. Элементный состав (% масс): С 62.43, Н 7.23.

Окисление сирингола в присутствии пероксидазы осуществляли при рН 7.0. Для этого при В-полимеризации к раствору, содержащему 100 мл 0.1 М фосфатного буфера, 5 мл 4 % спиртового раствора сирингола, 1 мл 1 % водного раствора фермента (активность фермента составляла 530 ед/мг), 45 мл этанола, 100 мл воды, добавляли 0.8 мл 30 % раствора Н202. EW-полимеризацию проводили в аналогичных условиях, с той лишь разницей, что добавление субстрата (1 % спиртовый раствор сирингола, содержащий 0.66 % Н202) производили по каплям. Реакцию вели при температуре 22 С в течение 6 суток. Как и в случае окисления в присутствии лакказы, окисление сирингола пероксидазной системой имело упорядоченный характер. В ходе реакции окисления образовывались окрашенные (хиноидные) продукты, затем происходило осадкообразование, раствор обесцвечивался, и, далее, цикл окисления повторялся. Выход продуктов окисления, в расчете на исходный мономер, составил: EW - 54 % (элементный состав (% масс): С 65.78, Н 5.69), В - 53.5 % (элементный состав (% масс): С 64.32, Н 5.44).