Функциональные производные терпенофенолов Сукрушева Ольга Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Литературный обзор

Функциональные производные на основе пространственно-затрудненных фенолов

Фенольные антиоксиданты группы ИХФАНов

Ионы

Скулачева

Антиоксиданты на основе гидрофильных полимеров и пространственно-затрудненных фенолов

Серосодержащие производные пространственно-затрудненных фенолов

1.5.1 Синтез и свойства гидроксибензилсульфидов

1.5.2 Синтез и свойства -(гидроксиарил)алкилсульфидов

Гибридные производные на основе терпенофенолов Алкилирование фенола винилбензолом

Обсуждение результатов

Алкилирование изоборнилфенолов стиролом Алкилирование изоборнилфенолов аллилбензолом

Синтез карбоксисодержащих соединений на основе 2,6-диизо-борнил-4-метилфенола

Синтез функциональных производных 2-изоборнил-6 метилфенола и 2,6-диизоборнилфенола

Синтез серосодержащих производных на основе

изоборнилфенолов

Исследование биологической активности и антиоксидантных свойств активности

Первичное тестирование биологической алкил(арил)изоборнилфенолов биологической активности биологической

2.6.2 Первичное тестирование серосодержащих производных

2.6.3 Результаты первичного тестирования активности серосодержащих производных

2.7 Исследование антирадикальной активности гибридных структур

на основе изоборнилфенолов

Глава 3 Экспериментальная часть

3.1 Приборы и реактивы

3.2 Методика алкилирования изоборнилфенолов стиролом

3.3 Методика алкилирование изоборнилфенолов аллилбензолом

3.4 Синтез карбоксисодержащих производных на основе 2,6-диизо-борнил-4-метилфенола

3.5 Синтез функциональных производных 2-изоборнил-6-метилфе-нола и 2,6-диизоборнилфенола

3.6 Синтез серосодержащих производных на основе изоборнилфе-нолов Исследование биологической активности и антиоксидантных свойств

Заключение 98

Сокращения и обозначения 100

Список использованных источников

• Антиоксиданты на основе гидрофильных полимеров и пространственно-затрудненных фенолов
• Синтез карбоксисодержащих соединений на основе 2,6-диизо-борнил-4-метилфенола
• Первичное тестирование биологической алкил(арил)изоборнилфенолов биологической активности биологической
• Синтез функциональных производных 2-изоборнил-6-метилфе-нола и 2,6-диизоборнилфенола

Введение к работе

Актуальность работы. Пространственно-затрудненные фенолы (ПЗФ) являются наиболее представительным и популярным классом среди синтетических антиоксидантов (АО). Благодаря низкой токсичности, а также способности эффективно ингибировать процессы свободнорадикаль-ного окисления алкилированные фенолы используются для продления сроков службы и улучшения эксплуатационных качеств органических веществ и материалов. Алкилфенолы проявляют и биологическую активность, в том числе антибактериальные, противовоспалительные, противоопухолевые, радиопротекторные и ДНК-протекторные свойства, отдельные представители этого класса используются в качестве лекарственных препаратов.

Развитие современного мирового производства АО направлено на синтез многофункциональных структур. Основным подходом к получению данных соединений является введение дополнительных функциональных групп в молекулы фенолов. Такая модификация может привести к появлению новой активности, либо к усилению уже имеющейся. Кроме того, возможно увеличение растворимости, появление свойств, способствующих адресной доставке соединений к защищаемой биосистеме и снижению уровня их токсичности.

Известно, что терпенофенолы, содержащие в качестве объемных заместителей изоборниль-ный фрагмент, являются физиологически активными веществами и обладают противовоспалительной, гемореологической и мембранопротекторной активностью, нейропротекторным и ретинопротекторным действием, влияют на мозговой кровоток и могут найти применение в фармацевтической промышленности для создания новых лекарственных препаратов. Кроме того, данные соединения могут применяться в качестве термостабилизаторов полимерных композиций, при переработке жидких продуктов пиролиза. Введение дополнительных функциональных групп в молекулу изоборнилфенолов приводит к появлению новых свойств.

Таким образом, практически важным и актуальным направлением является синтез на основе изоборнилфенолов полифункциональных или гибридных структур, проявляющих комбинированное действие: сочетание антиоксидантной активности с другим функциональным действием.

Цель работы: синтез и исследование антирадикальных и антиоксидантных свойств новых функциональных производных на основе изоборнилфенолов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. синтез гибридных фенолов, содержащих изоборнильный и 1-фенилэтильный или 1-фенилпропильный фрагменты;

2. введение функциональных групп (аллильной, гидроксипропильной и бромпропильной) в пара-положение изоборнилфенолов;

3. синтез серосодержащих и карбоксисодержащих производных на основе изоборнилфенолов;

4. изучение антирадикальной и антиоксидантной активности, первичное тестирование токсичности.

Научная новизна работы. Впервые исследовано алкилирование изоборнилфенолов стиролом и аллилбензолом в присутствии различных гомогенных и гетерогенных катализаторов. Синтезированы изоборнилфенолы с 1-фенилэтильным или 1-фенилпропильным заместителями. Получены и охарактеризованы индивидуальные диастереомеры 2-изоборнил-6-(1-фенилэтил)фе-

нола и 2-изоборнил-4-метил-6-(1-фенилэтил)фенола. Показана эффективность различных гомогенных и гетерогенных катализаторов для алкилирования изоборнилфенолов стиролом и аллилбензолом.

Впервые осуществлена модификация изоборнилфенолов путем введения аллильной, гидроксипропильной и галогенпропильной групп в пара-положение по отношению к гидроксильной группе фенола.

Синтезированы новые серосодержащие производные изоборнилфенолов с атомами серы в составе различных функциональных групп.

Для увеличения растворимости и, соответственно, биодоступности 2,6-диизоборнил-4-метилфенола получены его карбоксисодержащие производные.

Теоретическая и практическая значимость. Синтезированы новые гибридные антиоксиданты, представляющие собой производные изоборнилфенолов с 1-фенилэтильным или 1-фенилпропильным заместителями. Установлено, что эффективным катализатором алкилиро-вания изоборнилфенолов стиролом является пара-толуолсульфокислота (5 моль%), алкилирования аллилбензолом – сульфокатионит ФИБАН К-1 (10 масс%).

Для получения перспективных антиоксидантов осуществлен синтез 4-(2,6-диизоборнил-4-метилфенокси)-4-оксобутановой кислоты, 4-аллил-2-изоборнил-6-метилфенола, 4-аллил-2,6-ди-изоборнилфенола, 4-(-гидроксипропил)-2-изоборнил-6-метилфенола, 4-(-гидроксипропил)-2,6-диизоборнилфенола, 4-(-бромпропил)-2-изоборнил-6-метилфенола и 4-(-хлорпропил)-2,6-диизо-борнилфенола.

Синтезировано 10 серосодержащих производных различного строения на основе изоборнил-фенолов. Установлены оптимальные условия для введения тиольной группы в пара-положение изоборнилфенолов.

Установлено, что синтезированные соединения являются весьма активными антиоксидантами. Величина константы скорости взаимодействия с пероксидными радикалами k₇ возрастает с увеличением числа алкильных заместителей и при замене фенилэтильного на фенил-пропильный заместитель. Наибольшая антирадикальная активность отмечена для 2-изоборнил-6-(1-фенилпропил)-4-метилфенола. Показано, что введение гидроксипропильной, бромпропильной и серосодержащих групп в структуру 2-изоборнил-6-метилфенола приводит к увеличению антирадикальной активности. Среди серосодержащих производных наибольшей антирадикальной активностью обладает 1,2-бис[(4-гидрокси-3-изоборнил-5-метил-фенил)пропилтио]этан.

Первичное биотестирование с использованием в качестве тест-объекта эритроцитов крови лабораторных мышей показало, что алкил(арил)изоборнилфенолы обладают антиоксидантной и мембранопротекторной активностью, сопоставимой с активностью 2,6-диизоборнил-4-метил-фенола (Диборнол). Установлено, что среди серосодержащих производных наибольшей антиоксидантной и мембранопротекторной активностью обладает 1,2-бис[(4-гидрокси-3-изоборнил-5-метил-фенил)пропилтио]этан.

Синтезированные функциональные производные изоборнилфенолов могут применяться в качестве антиокислителей и стабилизаторов различного назначения, а также перспективны с точки зрения дальнейшего исследования в качестве препаратов для терапии заболеваний, связанных с нарушениями окислительно-восстановительных процессов в организме.

Методология и методы исследования. Для исследования строения полученных соединений использованы современные спектральные физико-химические методы анализа: ИК-, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия, элементный анализ. Оценку антирадикальной активности проводили волюмометрическим методом. Исследование цитотоксичности, мембранопротекторной и антиоксидантной активности синтезированных соединений проводили на модельной клеточной системе с использованием эритроцитов крови лабораторных мышей.

Положения выносимые на защиту:

5. Оптимальные условия синтеза фенолов с изоборнильным и 1-фенилэтильным или 1-фенилпропильным заместителями.

6. Новые функциональные производные изоборнилфенолов, содержащие аллильную, гидроксипропильную, галогенпропильную и карбоксильную группы.

7. Новые серосодержащие производные различного строения на основе изоборнилфенолов, адаптированные методы их синтеза.

8. Закономерности, связывающие природу и структуру заместителей с антирадикальной, антиоксидантной и мембранопротекторной активностью производных изоборнилфенолов.

Личный вклад автора заключается в планировании и выполнении экспериментальной работы, установлении структуры всех синтезированных соединений, систематизации и анализе литературных данных, участии в подготовке публикаций, написании диссертации.

Степень достоверности результатов. Достоверность полученных в работе результатов обеспечивается систематическим использованием необходимых для доказательства строения органических соединений современных физико-химических методов, таких как ИК- и ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия и элементный анализ. Тестирование антирадикальной, антиоксидантной и мембранопротекторной активности синтезированных соединений выполнено с привлечением многократно апробированных ранее методов оценки ключевых параметров, связанных с характеристикой этих свойств.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на VIII Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Калининград, 2013), Всероссийской научной конференции «Химия и фармакология растительных веществ» (Сыктывкар, 2014), Междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической химии «MOBI-CHEM 2014» (Крым, Новый Свет, 2014), IV, V и VI Всероссийской молодежной научной конференции «Химия и технология новых веществ и материалов» (Сыктывкар, 2014, 2015, 2016), VI Международной конференции Российского химического общества имени Д.И. Менделеева «Химическая технология и биотехнология новых материалов и продуктов» (Москва, 2014), IX Международной конференции молодых ученых «Менделеев-2015» (Санкт-Петербург, 2015), IX Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2015); X конкурсе проектов молодых учёных в рамках выставки «Химия-2016» (Москва, 2016), Кластере конференций по органической химии «ОргХим-2016» (Санкт-Петербург, 2016), XX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 2016).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей, 13 тезисов докладов и две заявки на патент.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института химии Коми НЦ УрО РАН по темам «Развитие методологии асимметрического органического

синтеза; получение физиологически активных веществ на основе функциональных производных изопреноидов, порфиринов и гетероциклических соединений. Получение новых веществ и материалов, научные основы химии и технологии экологически безопасной комплексной переработки растительного сырья» (№ гос. регистрации 01201255403); «Поиск новых реакций и совершенствование методов получения природных изопреноидов, порфиринов и гетероциклических соединений; научные основы химии и технологии экологически безопасной комплексной переработки растительного сырья» (№ гос. регистрации 0413-2014-0001). Работа поддержана УрО РАН в рамках Программы «Разработка методов получения химических веществ и создание новых материалов» на 2015–2017 гг., проект № 15-6-3-6 «Синтез новых гибридных антиоксидантов на основе терпенофенолов»; Российским фондом фундаментальных исследований (проекты 15-29-01220_офи-м; 16-33-00338 мол_а), Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «У.М.Н.И.К» (договор №4799ГУ1/2014).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит 13 рисунков, 40 схем, 5 таблиц. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, заключения и списка использованной литературы (153 наименования).

Антиоксиданты на основе гидрофильных полимеров и пространственно-затрудненных фенолов

Большинство фенольных антиоксидантов обладают липофильными свойствами, вследствие чего они медленнее, чем гидрофильные молекулы, транспортируются в организме и с большим трудом проникают в ткани и клетки. Это ограничивает эффективность их применения в экстренных случаях свободно-радикальных патологий, таких как ишемия, радиационное поражение, острый респиратропный дистресс-синдром и т.д. В связи с этим представляет интерес создание и изучение антиоксидантных препаратов с гидрофильными свойствами [7].

В Институте биохимической физики РАН им. Н.М. Эмануэля были получены водорастворимые производные ионола - Фенозан К 8 и ИХФАНы 9, которые проявляют антиоксидантные, противовоспалительные, радиозащитные, противоожоговые, антивирусные и анальгетические свойства [5, 8, 42, 43]. Установлено, что Фенозан К повышает устойчивость животных и растений к действию стрессовых факторов [44, 45], а также применяется в медицине в качестве противоэпилептического препарата [46]. t-Bu t-Bu HO—f \—CH2CH2COOK HO— %—(СН2)т-С І /= /=S \—(CH2)2-NtRX" -Bu t-Bu I 8 9 R = H, C8H17, C10H21, C8H17, C12H25, Ci6H33 x = CI, Br, I ИХФАНы относятся к новой группе антиоксидантов «поплавкового» типа. Наличие положительно заряженного четвертичного атома азота позволяет удерживать молекулу антиоксиданта на поверхности клеточной мембраны. Благодаря гидрофобному фрагменту происходит фиксирование молекулы во внутримембранном пространстве (поплавковый эффект) [47, 48]. Стоит отметить, что ИХФАНы не обладают местным и общетоксическим действием, не оказывают влияния на эмбриогенез и развитие потомства, а также регулируют рост клеток растений [49]. Кроме того, химический дизайн ИХФАНов позволяет рассматривать их в качестве перспективных препаратов для лечения болезни Альцгеймера [48].

Присутствие в структуре ИХФАНов фрагмента экранированного фенола обеспечивает им антиоксидантные свойства, фрагмента триметиламиноэтанола -антихолинэстеразную активность [50]. Свойства ИХФАНов в значительной степени зависят от их химической структуры и условий окисления. По данным исследований, проведенных in vitro, оптимальным сочетанием антиоксидантной и антихолинэстеразной активностей обладает ИХФАН-10-С-10, у которого алкильный заместитель содержит 10 атомов углерода [50]. Кроме того, установлено, что в растворе липидов гибридные АО эффективно тормозят окисление метилолеата: ИХФАН-9-С-9 и ИХФАН-10-С-10 в гомогенных и гетерогенных растворах превосходят по своей активности -токоферол и дибунол [51]. Аналоги, имеющие длинноцепочечные заместители у кватернизированного атома азота, за счет образования микрогетерогенных систем проявляют относительно низкое брутто-ингибирующее действие, которое повышается с ростом длины заместителя при атоме азота. Авторы полагают, что размеры бислойных структур, образуемых ИХФАНами, имеющими при атоме азота заместители, длина цепи которых сопоставима с длиной цепи высших жирных кислот в структуре фосфолипидов (18-12 углеродных атомов), будут соответствовать толщине биологических мембран. Данное обстоятельство обеспечивает максимальное удерживание в мембранах и ингибирование не ферментативных процессов окисления на внутренней цитоплазматической и наружной стороне клеточных мембран [51].

В настоящее время активно развиваются исследования, направленные на создание антиоксидантов, адресованных внутрь митохондрий, поскольку в последних образуется значительное количество АФК, которые инициируют цепные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) и представляют большую опасность для живых систем [52]. Производные витамина Е и убихинона, Mito Vit-E 10 и Mito-Q 11, содержащие положительно заряженные гидрофобные ионы децил-три-фенилфосфония и способствующие проникновению через фосфолипидный бислой биологических мембран, являются антиоксидантами «направленного митохондриального действия» [29, 53].

Установлено, что антиоксиданты, подобные Mito Vit-E, накапливаются в митохондриях в концентрациях, превышающих их содержание в крови в 100-500 раз, и при этом более эффективно, чем -токоферол защищают митохондрии от окислительных повреждений. Кроме того, добавление Mito-Q в пищу крысам способствует существенному улучшению сердечных функций после ишемии/реперфузии, а также предотвращает повреждение ткани сердца и дисфункцию митохондрий [7]. Однако недостатком антиоксидантов этого класса является малый зазор между антиоксидантными и прооксидантными свойствами [54]. В Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского под руководством академика РАН В.М. Скулачева синтезирован другой ряд антиоксидантов, состоящих из производных пластохинона и проникающего катиона 12-15 (SkQ) [54, 55].

Наиболее выраженные антиоксидантные свойства и биологическая активность выявлена у соединения 13. В микромолярных концентрациях SkQ1, подобно 11 (Mito-Q), оказывает сильный прооксидантный эффект. Однако стоит отметить, что между антиоксидантными и прооксидантными свойствами для SkQ1 концентрационный зазор составил около 1000, в то время как для Mito-Q он оказался меньше 2 [54].

Эксперименты на живых организмах показали, что SkQ увеличивают продолжительность жизни грибов (Podospora), ракообразных (Cereodaphnia), насекомых (Drosophila) и мышей [56], а также способствуют ускорению заживления кожных ран у животных [57]. Кроме того, проведенные исследования на модели ишемии почки и компрессионной ишемии головного мозга показали, что SkQ обладают выраженным нефро- и нейропротекторным действием [58].

Синтез карбоксисодержащих соединений на основе 2,6-диизо-борнил-4-метилфенола

Как было сказано выше, алкилированные фенолы являются эффективными ингибиторами свободно-радикальных процессов и широко используются в качестве стабилизаторов в различных отраслях промышленности. Ингибирующая активность алкилфенолов во многом определяется объемом и положением заместителей в ароматическом ядре.

Ранее с использованием различных химических и биологических тестов было показано, что по своей антиоксидантной активности 2,6-диизоборнил-4-метилфенол превосходит широко применяемый в промышленности ионол – 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол. 2,6-диизоборнил-4-метилфенол 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол Кроме того было установлено, что ионол и 2,6-диизоборнил-4-метилфенол относятся к соединениям с разными типами механизма антирадикальной активности, что может быть обусловлено строением алкильных заместителей.

С целью выявления роли терпенового фрагмента в антиоксидантной активности синтезированы фенолы, содержащие в своей структуре 2 В главах 1 и 2 соединения имеют самостоятельную нумерацию изоборнильный и трет-бутильный фрагменты 1, 21 [120]. Данные о кинетических характеристиках и физико-химических свойствах изоборнилфенолов, содержащих метильные и трет-бутильные заместители в орто-положении свидетельствуют о конкурентном влиянии донорной способности и экранирующих эффектов алкильного заместителя в орто-положении к гидрокси-группе [129]. В продолжение работы по определению роли объемных заместителей различной природы на антирадикальную активность в структуру изоборнилфенолов был введен 1-фенилэтильный фрагмент путем алкилирования рацемических 2-изоборнил-4-метилфенола рац-3a, 2-изоборнилфенола рац-3b и 2-изоборнил-6-метилфенола рац-3c стиролом с использованием в качестве катализатора пара-толуолсульфокислоты (psOHH2O) (5 моль%) (схема 32) [130, 131]. Реакцию проводили в течение 2–4 ч при нагревании до 100 С без растворителя, варьируя соотношение исходных реагентов.

Алкилирование протекает с практически полной конверсией исходных реагентов (таблица 1). В случае 2-изоборнил-4-метилфенола 3a алкилирование проходит с хорошим выходом 2-изоборнил-4-метил-6-(1-фенилэтил)фенола 5a (79-85%) без изомеризации терпенового заместителя исходного фенола. Также селективно образуется 2-изоборнил-4-(1-фениэтил)-6-метилфенол 6c (85%).

Взаимодействие фенола 3b со стиролом дает смесь продуктов орто- и пара-алкилирования – 2-изоборнил-6-(1-фенилэтил)фенола 5b и 2-изоборнил-4-(1-фениэтил)фенола 6b, соответственно. При использовании эквимолярных количеств 3b и стирола или избытка исходного фенола 3b преобладает продукт орто-алкилирования 5b ( 57%). Таблица 1 - Алкилирование изоборнилфенолов стиролом

Исходный фенол Соотношение фенол:стирол Время, ч Конверсия, % Содержание в продуктах алкилирования, % Поскольку исходными соединениями были рацемические изоборнил-фенолы, а в ходе реакции формируется дополнительный хиральный центр при атоме С17, то продукты алкилирования представляют собой смесь диастереомеров в соотношении 1:1 (схема 33). Методом колоночной хроматографии удалось разделить смеси диастереомеров 5а и 5b. В случае соединений 6b и 6c выделить индивидуальные диастереомеры не удалось.

Схема 33 Структуры полученных соединений установлены на основании данных ЯМР-спектроскопии (рисунок 1). В спектрах ЯМР 1Н продуктов реакции 5a,b 6Ь,с помимо сигналов характерных для терпенового заместителя в области сильного поля присутствуют сигналы 1-фенилэтильного фрагмента: сигнал протона Н17 в области 4.35-4.45 м.д. в виде мультиплета, дублет при 1.73 м.д. соответствует метильной группе СН318, сигналы протонов ароматического кольца (7.30-7.40 м.д.).

Подтверждением образования диастереомеров является удвоение сигналов в спектрах ЯМР 13С и 1Н. Например, в спектре ЯМР 1Н смеси диастереомеров продукта 5а наблюдаются два синглета с химическими сдвигами 0.67 и 0.80 м.д., соответствующие протонам метильной группы С10. Протон гидроксильной группы также дает два сигнала при 4.49 и 4.51 м.д.

В спектре ЯМР 13С той же смеси диастереомеров 5а сигналы некоторых углеродных атомов представлены двумя линиями, близкими по химическим сдвигам, соответствующими сигналам атомов углерода диастереомеров. В частности, наблюдаются двойные сигналы для атомов углерода метильных групп терпенового фрагмента С10 (12.13 и 12.26 м.д.) и С9 (20.30 и 20.38 м.д.), а также арильного атома углерода, связанного с гидроксильной группой (150.54 и 150.38 м.д.). Таким образом, алкилированием рацемических изоборнилфенолов стиролом в присутствии psOHH2O получены новые гибридные антиоксиданты, содержащие в одной молекуле объемный терпеновый и 1-фенилэтильный фрагменты.

Первичное тестирование биологической алкил(арил)изоборнилфенолов биологической активности биологической

Среди гибридных антиоксидантов особое место занимают серосодержащие производные пространственно-затрудненных фенолов. Отличительной чертой данных соединений является наличие в структуре их молекул двух реакционных центров – фенольного фрагмента и бивалентного атома серы, что позволяет тормозить окислительный процесс двумя путями – взаимодействием с пероксид-ными радикалами и гидропероксидами.

С целью поиска новых биоантиоксидантов в настоящей работе на основе соединений 21 и 27 (мезо-форма) синтезированы новые серосодержащие антиоксиданты (схема 38, 39) [146-149].

Сульфид 28 с выходом 84% был получен при перемешивании бромпроизводного 27 с Na2S9H2O в этаноле по известной методике [71]. Доказательством образования соединения 28 являются данные ЯМР 1Н, 13С, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии. В спектре ЯМР 1H синглет при 4.11 м.д. соответствует протонам Н17 и Н17; сигналы атомов углерода СН2-групп, связанных с атомом S, в спектре ЯМР 13C находятся в области 65.86 м.д.

Известно, что при взаимодействии галогеналканов с тиомочевиной образуются галогениды S-алкилизотиурония, обработка которых водным раствором щелочи приводит к соответствующим алкантиолам. Описан способ получения -(3,5-диметил-4-гидроксифенил)алкан-тиолов-1 с выходом до 90% путем щелочного гидролиза соответствующих солей изотиурония в среде н-бутанола [105]. Однако осуществить синтез тиола 34 через соль изотиурония 29 по описанной выше методике не удалось. Проведение щелочного гидролиза соли изотиурония 29 в среде спиртовых растворителей (н-бутанол, этанол и метанол) приводит к образованию соответствующего эфира 30, 31 и 33 что подтверждено методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Варьирование температуры реакционной смеси, мольного отношение исходных компонентов и использование более слабого основания K2CO3 вместо NaOH также не способствует образованию тиола 34. Бензильное положение тиоацетной и изотиурониевой групп обуславливает склонность этих соединений к реакциям SN1, что способствует протеканию побочных процессов с образованием эфиров 30, 31 и 33. Реагенты и условия: i Na2S9H20/EtOH; ii CS(NH2)2/BuOH; iii NaOH/ЕЮН; iv NaOH/BuOH; v NaOH/MeOH; vi KSAc/Me2CO; vii K2C03/MeOH/Me2CO; viii LiAl /EtiO Схема 38 Осуществлена попытка получить тиол 34 через тиоацетат 32. Однако проведение реакции в среде ацетон/метанол (1:1) при комнатной температуре с использованием соли К2С03 также приводит к образованию эфира 33 [150]. Получить тиол 34 с выходом 66% удалось путем восстановления тиоацетата 32 с использованием ЬіАІЩ в среде безводного диэтилового эфира. Подтверждением образования соединения 34 являются данные ЯМР-спектроскопии. Образование соединения 34 подтверждено спектральными данными. Наличие в спектре COSY кросс-пиков между сигналами протонов метиленовой группы в положении 17 при 3.77 м.д. и протона тиольной группы при 1.60-1.79 м.д. свидетельствует о спин-спиновом взаимодействии между ними. 8 ОН

Среди серосодержащих фенольных антиоксидантов следует отметить (гидроксиарил)алкилсульфиды, которые обладают комплексом практически важных свойств: высокой противоокислительной активностью, термостабиль ностью, способностью эффективно ингибировать ПОЛ в биосистемах. Ярким представителем данного класса соединений является бис-[3,5-ди-трет-бутил-4 гидроксифенил)пропил]сульфид (тиофан, СО-3), известный как термостабилизатор полимерных композиций на основе полиэтилена и полипропилена. Выявлен широкий спектр биологической активности тиофана [91-94]. На основе 4-бромпропил-2-изоборнил-6-метилфенола 21 получен сульфид 36 - аналог тиофана, а также другие серосодержащие производные 35, 37-40 (схема 38).

Взаимодействие бромпроизводного 21 с 1,2-этандитиолом в присутствии КOH в среде изопропанола приводит к образованию бис-сульфида 35 с выходом 92%. Структура соединения 35 подтверждена спектральными методами анализа. В спектре ЯМР 1Н присутствуют сигналы, характерные для протонов пропильного фрагмента в виде триплетов, а также сигналы протонов этильного мостика в виде синглетов при 2.72 и 2.86 м.д. В масс-спектре содержится пик с m/z 662, соответствующий молекулярному иону [М]+. 13 \ Реагенты и условия: i (CH2SH)2/КОН/iPrOH; ii Na2S9H2O/EtOH; iii CS(NH2)2/BuOH; iv NaOH/BuOH/кипячение; v NaOH/BuOH/ комнатная температура; vi KSAc/Me2CO; vii K2CO3/MeOH/Me2CO/0 C Схема 39 Сульфид 36 с выходом 92% был получен аналогично продукту 28. Доказательством структуры сульфида 36 является пик с m/z 602 в масс-спектре, соответствующий молекулярному иону [M]+, а также данные ЯМР-спектроскопии. В спектре ЯМР 13С наблюдается смещение сигналов атомов углерода С19 (31.45м.д.) и С20 (31.57 м.д.) в область сильного поля в отличие от исходного бромпроизводного 21 (33.32 и 34.24 м.д.). Известен способ получения бензильных тиолов взаимодействием бензильного тиоацетата с К2СО3 в присутствии метанола [150]. Однако при использовании данной методики из тиоацетата 40 был полученен дисульфид 38 с выходом 88%. Подтверждением образования соединения 38 является пик с m/z 662 в масс-спектре, соответствующий молекулярному иону [М]+ дисульфида 38. Соединение 38 также получено с выходом 72% при гидролизе соли изотиурония 37 нагревая с NaOH до 95 С. Стоит отметить, что снижение температуры реакционной смеси до комнатной приводит к образованию тиола 39 с выходом 57%, вторым продуктом реакции является дисульфид 38 с выходом 29%. При 0 C реакция практически не протекает. Производное 37 не может образовывать бензильный катион, что предотвращает побочные реакции SN1 и позволяет использовать гидролиз соли изотиурония для перехода к тиольным производным.

Известно, что тиолы могут быть получены с хорошими выходами путем восстановления соответствующих дисульфидов. Так, в работе П.И. Пинко [105] при восстановлении бис-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил] дисульфида цинком в НСl получен тиол с выходом до 89%. С использованием данного метода был получен тиол 39 с выходом 61%. Стоит отметить, что, несмотря на длительное проведение реакции (28 ч) и существенный избыток Zn и НСl (39:Zn:НСl = 1:21:21), реакция протекает с неполной конверсией (68%) (схема 40).

Синтез функциональных производных 2-изоборнил-6-метилфе-нола и 2,6-диизоборнилфенола

Метод II. К раствору 0.10 г (0.16 ммоль) дисульфида 38 в 5 мл бензола и добавляли порциями 0.22 г (3.36 ммоль) порошка цинка, а затем прикапывали 0.14 мл (4.57 ммоль) соляной кислоты. Реакционную смесь перемешивали 28 ч в атмосфере аргона при 20 С. К реакционной смеси добавляли воду, органический слой отделяли и высушивали безводным Na2SO4. После удаления растворителя в вакууме остаток разделяли методом колоночной хроматографии. Выход 61%. Светло-желтое масло. Масс-спектр, m/z: 318.21 [М]+, C20H30OS. Вычислено: М 318.15. ИК-спектр (тонкий слой), , см-1: 3570 (ОН); 2947, 2875, 1475, 1450 (CH2, СН3); 2565 (SH); 1600 (С=С); 875 (аром. C-H). Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, CDCl3, , м.д., J/Гц): 0.82 (с, 3Н, СН310); 0.89 (с, 3Н, СН39), 0.94 (с, 3Н, СН38); 1.33-1.51 (м, 3Н, Н5, Н6, SH); 1.61-1.72 (м, 2Н, Н3, Н6); 1.84-1.96 (м, 4Н, Н4, Н5, H19); 2.19-2.25 (м, 1Н, Н3); 2.27 (с, 3Н, СН317); 2.51-2.59 (м, 2Н, СН320); 2.66 (т, 2Н, J = 7.2 Гц, Н18); 3.10 (т, 1Н, J = 8.7 Гц, Н2); 4.58 (с, 1Н, ОН); 6.81 (с, 1Н, Н16); 7.00 (с, 1Н, Н14). Спектр ЯМР 13С (75 МГц, CDCl3): 12.48 (С10); 16.23 (С17); 20.34 (С9); 21.45 (С8); 23.93 (С20); 27.58 (С5); 33.91 (С19); 34.30 (С3); 35.84 (С18); 40.18 (С6); 45.61 и 45.87 (С2, С4); 48.10 (С7); 49.70 (С1); 122.56 (С15); 126.03 (С14); 128.02 (С16); 128.82 (С13); 131.94 (С11); 151.21 (С12). 3-[(4-Гидрокси-3-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-экзо-2-ил)-5-метил-фенил)пропил]этантиоат (40). К раствору 0.10 г (0.27 ммоль) бромида 21 в 10 мл ацетона и добавляли 0.06 г (0.54 ммоль) тиоацетата калия. Реакцию смесь нагревали до кипения и перемешивали 1 ч в токе аргона. Ацетон упаривали при пониженном давлении. К остатку добавляли 40 мл диэтилового эфира и воду. Органический слой отделяли, промывали водой (320 мл), высушивали безводным Na2SO4. После удаления растворителя в вакууме получали 0.087 г (90%) продукта 40 в виде желтого масла. Масс-спектр, m/z: 360.11 [М]+, C22H32O2S. Вычислено: М 360.21. ИК-спектр (тонкий слой), , см-1: 3512 (ОН); 2947, 2875, 1477, 1450 (CH2, СН3); 1689 (C=O); 1598 (С=С); 875 (аром. C-H); 734, 628 (C-S). Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, CDCl3, , м.д., J/Гц): 0.80 (с, 3Н, СН310); 0.88 (с, 3Н, СН39), 0.92 (с, 3Н, СН38); 1.36-1.48 (м, 2Н, Н5, Н6); 1.60-1.68 (м, 2Н, Н3, Н6); 1.84-1.92 (м, 4Н, Н4, Н5, H19); 2.16-2.21 (м, 1Н, Н3); 2.26 (с, 3Н, СН317); 2.36 (с, 3Н, СН322); 2.61 (т, 2Н, J = 7.8 Гц, Н18); 2.89 (т, 2Н, J = 7.2 Гц, Н20); 3.08 (т, 1Н, J = 9.0 Гц, Н2); 4.49 (с, 1Н, ОН); 6.80 (с, 1Н, Н14); 6.97 (с, 1Н, Н16). Спектр ЯМР 13С (75 МГц, CDCl3): 12.46 (С10); 16.23 (С17); 20.33 (С9); 21.45 (С8); 27.58 (С5); 28.57 (С18); 31.42 (С19); 34.28 и 34.42 (С6, С20); 40.15 (С3); 45.61 и 45.85 (С2, С4); 48.09 (С7); 49.70 (С1); 122.57 (С15); 126.01 (С14); 127.99 (С16); 128.84 (С13); 131.81 (С11); 151.26 (С12), 195.91 (С21).

Исследование антиоксидантной и мембранопротекторной активности и токсичности синтезированных соединений. Для оценки токсичности, антиоксидантной и мембранопротекторной активности соединений использовали 0.5% (v/v) суспензию эритроцитов лабораторных мышей в фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7.4). Исследуемые вещества предварительно растворяли в ацетоне.

Токсичность соединений оценивали (in vitro) по их способности индуцировать гемолиз. Растворы соединений вносили в суспензию эритроцитов и инкубировали при 37 С в течение 5 ч в термостатируемом шейкере Biosan ES-20 (Латвия). Контрольные образцы содержали соответствующий объем растворителя. О наличии цитотоксичности судили по степени гемолиза эритроцитов через 1, 3 и 5 ч инкубации. Мембранопротекторную и антиоксидантную активность определяли по степени ингибирования Н2О2-индуцированного гемолиза, торможения накопления вторичных продуктов ПОЛ и окисления оксигемоглобина в эритроцитах. С этой целью спустя 30 мин после внесения в суспензию эритроцитов растворов исследуемых соединений инициировали гемолиз раствором пероксида водорода (0.006%). Затем реакционную смесь инкубировали в термостатируемом шейкере при медленном перемешивании и 37 С в течение 5 ч. Каждый час из инкубационной среды отбирали аликвоту, центрифугировали 5 мин (1600 g), степень гемолиза определяли по содержанию гемоглобина в супернатанте на спектрофотометре Thermo Spectromic Genesys 20 (США) при X 524 нм. Процент гемолиза рассчитывали по отношению к полному гемолизу образца. Содержание вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобрабитуровой кислотой (ТБК-АП), определяли спектрофотометрически. Для оценки накопления продуктов окисления гемоглобина анализировали спектр поглощения в интервале длин волн 540-640 нм. Содержание различных форм гемоглобина (oxyHb, metHb и ferrylHb) рассчитывали с учетом соответствующих коэффициентов экстинкции. Каждый эксперимент проводили в 5-6 повторностях. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Office Excel 2007.