Содержание к диссертации
Введение
2. Биологическое значение и химические свойства дигидрокверцетина и его аналогов. (литературный обзор)
2.1. Классификация и структура флавоиоидных соединений 6
2.2. Антиоксидантные свойства флавоноидов 11
2.3. Биологическое действие флавоноидов 14
2.4. Флавоноиды как лекарственные препараты и биологически активные добавки к пище 19
2.5. Дигидрокверцетин — нахождение в природе и способы выделения 23
2.6. Физико-химические и химические свойства дигидрокверцетина 29
2.6.1. Строение и свойства дигидрокверцетина 29
2.6.2. Реакции по гидроксильным группам
2.6.2.1. Метильные производные дигидрокверцетина 33
2.6.2.2. Бензильные производные дигидрокверцетина 37
2.6.2.3. Ацнльные производные дигидрокверцетина 37
2.6.2.4. Фосфорилированные производные дигидрокверцетина 39
2.6.3. Смешанные эфиры дигидрокверцетина 40
2.6.4. Реакции с участием карбонильной группы
2.6.4.1. Оксимпроизводное дигидрокверцетина 42
2.6.4.2. Реакции восстановления карбонильной группы 43
2.6.5. Реакции замещения в ароматическом кольце 44
2.6.6. Комплсксообразующая способность с ионами переходных металлов 46
3. Исследование синтеза фосфорсодержащих соединений на основе частично защищенного дигидрокверцетина (обсуждение результатов)
3.1. Синтез и изучение строения частично защищенных производных дигидрокверцетина 51
3.2. Взаимодействие производных дигидрокверцетина с фосфорилирующими реагентами 55
3.3. Химические свойства Рш производных алкилированных эфиров дигидрокверцетина 59
3.4. Образование нового вида циклофосфопатных систем 64
3.5. Изучение химических свойств фостонов 75
3.6. Фосфорилирование ацетилированных эфиров дигидрокверцетина 76
3.7. Химические свойства Рш производных ацетилированных эфиров дигидрокверцетина 82
3.8. Удаление протекторных группировок 88
3.9. Исследование цитотоксической активности 89
4. Экспериментальная часть 91
5. Выводы 106
6. Приложение 107
7. Литература
- Биологическое действие флавоноидов
- Ацнльные производные дигидрокверцетина
- Взаимодействие производных дигидрокверцетина с фосфорилирующими реагентами
- Фосфорилирование ацетилированных эфиров дигидрокверцетина
Введение к работе
1. Введение
Флавоноиды (бензопираны) составляют большой класс сложных гетероциклических соединений, широко распространенных в растительном мире [1, 2]. В 1936 году А. Сент-Дьёрди и группа немецких учёных показали [3], что целый ряд флавоноидов обладает ярко выраженной биологической активностью, свойственной классическим витаминам. Они частично снимают остроту авитаминоза С, уменьшают проницаемость и ломкость капиллярных кровеносных сосудов. По этой причине флавоноидные соединения также стали относить к витаминам и называть витамином Р (от англ. permeability -проницаемость). Типичными представителями веществ с этой активностью являются катехин, кверцетин, и его гликозид рутин. Сегодня они широко используются при лечении многих заболеваний кровеносных сосудов, гипертонии, кори, скарлатины, сыпного тифа, лучевой болезни и т.д.
В 40-50-х годах прошлого столетия был выделен из коры дугласовой пихты и охарактеризован дигидрокверцетин (таксифолин) - аналог кверцетина, гидрированный в положения 2 и 3 [4, 5]. О выделении дигидрокверцетина из древесины лиственницы даурской было сообщено в 1968 г [6]. Этот продукт обладает особенно высокой Р-витаминозной активностью, и еще целым рядом других важных и полезных свойств, отсутствующих у большинства биофлавоноидов. Он проявляет высокую антиоксидантную активность, устойчив к автоокислению, является малотоксичным веществом [7]. Дешевым возобновляемым сырьем для промышленного получения дигидрокверцетина является комлевая часть древесины лиственниц сибирской (Larix sibirica L.) и даурской (Larix dahurica Т.) возможности выделения его показаны в ряде патентов [8, 9, 10]. Все сказанное выше позволяет рассматривать дигидрокверцстин в качестве перспективного, природного биорегулятора.
Необходимо отметить, что дигидрокверцетин обладает и рядом особенностей, затрудняющих его широкое использование в практических целях, в частности, имеет плохую водорастворимость. С учетом сказанного возникла необходимость изучения его химических трансформаций, в том числе связанных с приданием молекуле флавоноида большей полярности. Одним из направлений превращений дигидрокверцетина может стать его фосфорилирование. Известно, что многие фосфорилированные продукты обладают физиологической активностью. В качестве фосфорилирующих реагентов представляются особенно перспективными амиды фосфористой кислоты. Между тем эта область химии дигидрокверцетина ещё не получила развития: в литературе отсутствуют данные о получении производных трех-и пятивалентного фосфора рассматриваемых производных флавоноида.
Целью настоящей работы явилось изучение фосфорилирования частично защищенных производных дигидрокверцетина доступными реагентами трехвалентного фосфора, а также исследование химических особенностей полученных соединений. Эта задача была сопряжена со стремлением создать новые лекарственные средства. Поэтому синтезированные соединения послужили объектами совместного исследования авторов работы и сотрудников РОНЦ им. Н.Н. Блохина, при этом были получены перспективные результаты.
Диссертационная работа по традиции состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов и экспериментальной части. Литературный обзор посвящен вопросам биологического значения и химических свойств дигидрокверцетина и его аналогов. Как нам кажется, его чтение поможет лучшему пониманию полученных нами результатов.
Биологическое действие флавоноидов
Антиоксидантная активность флавоноидных соединений обуславливает также их способность защищать липопротеины низкой плотности от окисления [29]. Negre-Salvayre [29] показал, что кверцетин и рутин в высоких концентрациях (20 мкМ) ингибировали окисление липидов низкой плотности в лимфоидных клетках при облучении их ультрафиолетовым излучением, а в малых концентрациях (ОД-3 мкМ) они осуществляли прямую защиту клеток от цитотоксического действия окисленных липидов низкой плотности, увеличивая их резистентность. Существует интересный факт: потребление красного вина коррелирует с понижением смертности от сердечнососудистых заболеваний, в патогенезе которых ключевым звеном является окисление липидов низкой плотности. Этот эффект описывают как «французский парадокс» и объясняется он наличием в красном вине флавоноидных соединений, обладающих высокой антиокислительной активностью [16].
Антиоксидантное действие флавоноидов может быть обусловлено не только их способностью нейтрализовать активные формы кислорода и обрывать цепные свободнорадикальиые реакции, но и способностью связывать ионы железа [19, 30], Так Бродский А.В. и соавт. [19] установили, что рутин ингибировал НАДФ-зависимое перекисное окисление липидов в микросомах печени крыс. Известно, что НАДФ-зависимое перекисное окисление липидов инициируется на уровне НАДФ-цитохром Р-450-редуктазы, протекает в присутствии ионов железа и предотвращается при связывании ионов железа комплексообразующими агентами. Антиоксидантное действие рутина в этом случае реализуется, главным образом, благодаря его хелатирующим свойствам. По данным литературы, некоторые флавоноидные соединения образуют комплексы с ионами железа [30,31],
Вклад основных механизмов действия флавоноидов: механизма связывания ионов железа с образованием неактивного комплекса и механизма прямого взаимодействия флавоноидов со свободными радикалами в антиоксидантную активность этих соединений зависит от состава реакционной среды, т.е. от стехиометрического соотношения ионов железа и флавоноидов, рН среды и др. [19].
Для флавоноидов характерен широкий спектр биологической активности и лечебных свойств. Они обладают низкой токсичностью, разнообразным действием на организм животных и человека, поэтому широко используются в медицине, фармации и пищевой промышленности. В настоящее время выявлено более 40 видов биологической активности флавоноидов [32,33]. Будучи постоянными и универсальными компонентами растительных тканей, флавоноиды несут значительную функциональную нагрузку. Однако биологическая роль и функции флавоноидных соединений в растительных и животных тканях, смысл и механизм их метаболических превращений во многом не ясны. Но все же некоторые функции изучены достаточно подробно. Многообразие биологического действия флавоноидных соединений обусловлена разнообразием их структур и локализацией в растении, а также сложностью ферментных взаимопревращений.
Так, за последние годы стало очевидным, что флавоноидиые пигменты выполняют роль фильтров в растениях, защищая ткани от вредного воздействия УФ-лучей [2]. На примере культивируемых клеток розы (Rosa damescena) было показано, что если клетки облучать летальной дозой УФ-света (254 нм) и затем произвести отбор на устойчивость к такому облучению, постепенно увеличивая дозу, то выживать будут только те клетки, которые способны синтезировать в ответ на облучение повышенные количества фенольных соединений, в частности флавоноидов [1].
М.Н. Запрометовым [34] эксперементально доказано, что растения способны не только синтезировать флавоноиды, но и подвергать их глубокому катаболизму с образованием продуктов первичного обмена веществ вплоть до углекислоты, что подтверждено и другими исследователями [35]. Таким образом, полифенольные соединения могут выполнять роль запасных или резервных веществ в метаболизме растений.
Флавоноиды участвуют в процессах роста растений. Хотя наиболее интенсивное образование этих соединений происходит в молодых, энергично растущих тканях, сами по себе они способны не только стимулировать ростовые процессы, но и подавлять их. Направление и степень воздействия на рост и развитие растений определяются строением флавоноидов и их конфигурацией [36].
Ацнльные производные дигидрокверцетина
Классическим методом определения строения флавоноидов является щелочной гидролиз. Реакция протекает через промежуточное образование р-дикарбонильного соединения, которое может далее распадаться различными путями. Если кольцо А является производным флюроглюцина, как это часто имеет место, то для обеих систем возможно расщепление по направлению (в) [103].
Излишне говорить, что потребовались значительные усилия, чтобы заменить эти сложные химические методы деструкции методами спектроскопии. К сожалению, ИК-спектроскопия оказалась непригодной, так как валентным колебаниям карбонильной группы флавонов и изофлавонов почти всегда соответствует полоса поглощения в области 1650 см"1 и ее положение не зависит от типа замещения; лишь при наличии гидроксогруппы в положении 3 эта полоса смещена в область более низких частот [104]. Но в работе [105] обработаны и представлены значения полос поглощения для флавонов, флавонолов, гликозидов флавонол ов и флавононолов. Также обсуждено возникновение характеристических полос поглощения ОН, СО, OR, АгОС, и СОС групп.
Более пригодна для установления строения УФ-спектроскопия [106, 107]. Как правило, в спектре флавоноидов имеются два максимума при значениях длин волн около 250 и 297 нм. Но существует тенденция к смещению таковых значений в более длинноволновую область 265-270 нм и 330- 340 нм при наличии в кольце А или В гидроксогрупп. Метод масспектрометрии (электронного удара) часто применяли для установления строения флавоноидов [І08]. В работах [109, ПО, 111] представлены и обсуждены масс-спектры для 43 флавонов и флавонолов, 7 изофлавонов, 18 изофлавононов и дигидрофлавонолов, 11 халконов и дигидрохал конов. Однако полученные данные были несколько противоречивыми для фрагментов расщепления кольца В.
Еще более полезна для установления строения флавоноидов спекроскопия ЛМР [112, 113, 114]. Обычно нелегко точно отнести сигналы в спектре ПМР, хотя сигнал протона в положении 3 должен быть синглетом и поэтому его можно отличить от других сигналов, а по наличию или отсутствию этого сигнала можно отличить флавоны от флавонолов [112]. Наиболее перспективным методом является спектроскопия ЯМР 13С [113, 114, 115]. В работах [113, 115] были изучены спектры ЯМР 13С для дигидрофлавонов, дигидрофлавонолов, флаванов, халконов, флавонолов, изофлавонов и некоторых их гликозидов в дейтерированном дим етил сульфоксиде.
Вычисленные на основе простых моделей значения химических сдвигов хорошо согласуются с экспериментальными данными, за исключением значений для С-3 , С-5\и С-6. Химический сдвиг атома углерода карбонильной группы С-4 является определяющей величиной для многих флавоноидов ( 180-190 м.д.).
В последнее время в сферу структурных исследований биофлавоноидов активно внедряется метод рентгеноструктурного анализа, дающий наглядное представление о пространственном расположении молекул. Среди исследованных этим методом флавоноидов преобладают соединения с флавоновым и флавоноловым скелетом. Значительно меньше изучены флавоноидные соединения с насыщенной гетероциклической системой, имеющие более сложную стереохимическую структуру в связи с наличием в молекуле центров хиральности и способные существовать в виде оптически активных стерео изомеров. При этом объектами исследования служили флаваноновые соединения с одним центом хиралыюсти и, как правило, находящиеся в оптически неактивной форме: нарингенин, гесперетин, онисилин и др.
Работа [116] посвящена рентге неструктурному исследованию оптически активного флаванонола дигидрокверцетина, обладающего правым вращением. Его выделяли из опилок древесины лиственницы сибирской путем водно-ацетоновой экстракции при нагревании и очищали методом полупрепаративной ВЭЖХ. Кристаллы дигидрокверцетина для рентге неструктурного анализа получали из водио-этанольного раствора при комнатной температуре.
Независимые молекулы в ячейке кристалла дигидрокверцетина (IX). Гетероциклическое кольцо молекулы имеет конформацию несимметричного кресла с плоской системой четырех атомов 0(1)-С(8а)-С(4а)-С(4). В молекуле дигидрокверцетина торсионный угол вокруг связи О(1)-С(2 С(9)-С(10) (см. рис. 2) составляет 78,4. В различных флавоноидных соединениях расположение замещенного фенильного кольца относительно гетероциклической системы варьирует от почти параллельного до почти перпендикулярного. Это может быть связано с низким барьером вращения кольца В вокруг ординарной связи С(1)-С(10), а также с различным окружением молекул в кристалле.
Взаимодействие производных дигидрокверцетина с фосфорилирующими реагентами
Основная задача настоящей работы заключалась в изучении реакций фосфорилирования производными кислот трехвалентного фосфора частично защищенного дигидрокверцетина. В качестве объектов для целенаправленного фосфорилирования по свободным гидроксильным группам были выбраны тетраалкилированные и тетраацилированные производные дигидрокверцетина.
Строение полученных эфиров дигидрокверцетина 1-3 было подтверждено методом ЛМР-спектроскопии на ядрах Н и 13С. Для исходного дигидрокверцетина и эфира 3 подтверждены структуры методом PC А и соответствуют литературным данным [117, 127]. Из данных рентгеноструктурного анализа молекулы дигидрокверцетина следует, что его гетероциклическое кольцо имеет кон формацию несимметричного полукресла с плоской системой четырех атомов О-], С-9, С-4, С-3 (рис. 5). Угол поворота плоскости кольца В по отношению к плоскости гетероциклического кольца вокруг связи С(2)-С(9) (рис. 5) равен 68,0. В независимой молекуле реализуется внутримолекулярная водородная связь между кислородным атомом карбонильной группы и атомом водорода гидроксильной группы в пятом положении (рис. 5).
Строение молекулы дигидрокверцетина. Молекулы дигидрокверцетина в кристалле объединены друг с другом и с гидратиыми молекулами воды межмолекулярными водородными связями в сложный структурный мотив (рис. 7).
Кристаллическая структура дигидрокверцетина в ячейке. Таким образом, входящие в кристаллическую ячейку пять молекул воды, играют важную роль в формировании упаковки.
Геометрия центрального остова молекулы тетраацетата 3 не меняется (рис. 8). Молекулы исходного дигидрокверцетина и тетраацетата 3 несколько отличаются разворотом кольца В (рис. 9). Угол
Сопоставление геометрии молекул дигидрокверцетина и эфира 3. Полученный 3,3\4\7-тетраацетатЗ формирует в кристалле димеры (рис. 10) посредством образования бифуркатпой водородной связи за счет атома водорода незащищенной ги дроке ильной группы в положении 5 и атома кислорода карбонильной группы,
Пространственная организация эфира 1 впервые изучена методом РСА. Из данных рентге неструктурного анализа следует, что геометрические характеристики молекулы также изменяются мало, за исключением угла поворота кольца «В». В эфире 1 угол поворота плоскости кольца В по отношению к плоскости гетероциклического кольца вокруг связи С(2)-С(9) (рис. 10) равен 47.9. Впрочем, в различных флавоиоидпых соединениях этот угол варьируется в широких пределах: от 0 до 90. Это может быть связано с низким барьером вращения кольца В вокруг ординарной связи С(2)-С(9), а также с различным окружением молекул в кристалле. Общий вид молекулы 1 приведен на рис. 10 и на рис. 11 сравнение его с молекулой исходного дигидрокверцетина.
В кристалле тетраметилата молекулы связаны в цепочки (рис. 12) в отличие от дигидрокверцетина, кристаллическая структура которого представляет собой слоистые «стопки» (рис. 6).
Взаимодействие производных дигидрокверцетина с фосфорилирующими реагентами. Следующий этап работы заключался в фосфорилировании полученных производных дигидрокверцетина 1-3 моно-, ди-, и трифункциональньши фосфорилирующими реагентами. Фосфиты эфиров 1-3 были нами получены по общей методике при взаимодействии эквимольных количеств производных дигидрокверцетина 1-3 и амидов фосфористой кислоты. Выбор фосфорилирующих реагентов определялся их активностью и доступностью для синтеза. Также, амиды фосфористой кислоты хорошо зарекомендовали себя в синтезе нуклеотидов, фосфолипидов и фосфорилированных Сахаров.
Все реакции были проведены в среде абсолютного бензола, при нагревании реакционной смеси до 70-80 С, в интервале времени от 15-20 минут до восьми часов.
Контроль за ходом реакций осуществляли методом ТСХ и ЯМР-спектроскопии на ядрах 3Р. Первым направлением в работе явилось изучение фосфорилирования 3 ,4 ,5,7-тетраметилдигидрокверцетина 1 амидофосфитным методом. В качестве фосфорилирующего реагента использовали 5,5-диметил-2-диэтиламидо-1,3,2-диоксафосфоринан (1М,Ы-диэтиламидонеопентиленфосфит), полученный по стандартной методике [144а]. Данный процесс протекает в присутствии гидрохлорида ди этил амина, выступающего в качестве катализатора реакции. Реакционную массу нагревали в течение 6 часов.
Фосфорилирование ацетилированных эфиров дигидрокверцетина
Параллельно с 3 ,4 ,5,7-алкилированными производными мы изучали фосфорилирование 3\4\3,7-тетраацетата дигидрокверцетина (3) по ароматической гидроксильнои группе, находящейся при атоме углерода в пятом положении. В качестве фосфорилирующего реагента использовали 5,5-диметил-2-хлор-1,3,2-диоксифосфориан (N,N-диэтиламидонеопентиленфосфит), полученный по стандартной методике [144а]. Данный процесс также протекает в бензоле, в присутствии гидрохлорида диэтил амина, взятого в качестве катализатора реакции фосфорилирования. Реакционную массу нагревали при температуре кипения растворителя в течение 80 минут. По окончанию взаимодействия, в фосфорном спектре отсутствует синглетный сигнал с химическим сдвигом 147 м.д,, характерный для исходного фосфорилирующего реагента и появляется синглетный сигнал 7-неопентиленфосфита 3,3 ,4 -триацетата дигидрокверцетина с химическим сдвигом 114 м.д. [145а].
Очевидно, из-за наличия прочной внутримолекулярной связи между атомом водорода гидроксильной группы в С-5 положении молекулы и атомом кислорода карбонильной группы, процесс фосфорилирования по формально свободной гидроксильной группе не протекает, а происходит предварительное удаление протекторной ацетильной функции с последующей атакой фосфамидов по гидроксильному остатку при атоме углерода в 7 положении. Этот вывод был сделан на основе данных ЯМР-спектроскопии Н и 3С, которые представлены и обсуждены ниже. Первый акт реакции осуществляется по известной в органической химии схеме - деацетилированию вторичных аминов [158]:
По-видимому, указанное направление реакции фосфорилирования связано с тем, что атом кислорода гидроксильной группы в положении 7 более нуклеофилен, чем другие аналогичные реакционные центры молекулы частично ацетилированного флавоноида [43]. Далее было изучено фосфорилирование тетра-О-ацетилового эфира дигидрокверцетина тетраэтилдиамидоэтилфосфитом [1446].
Процесс протекает при температуре кипения растворителя в течение 0,5 часа в присутствии каталитического количества гидрохлорида диэтиламина. Об окончании реакции судили с помощью методов ТСХ и ЛМР-спектроскопии на ядрах 31Р. По завершении процесса фосфорилирования в фосфорном спектре отсутствует синглетный сигнал с химическим сдвигом 134 м.д., характерный для исходного фосфорилирующего реагента и появляется синглетный сигнал диэтиламидоэтилфосфита 3,3 ,4 —триацетата дигидрокверцетина 26 с химическим сдвигом 144 м.д. [1456]. Производное 26, в виду его большой лабильности, без выделения из реакционной массы ввели во взаимодействие с серой.
Затем соединение 3 было введено в реакции фосфорилирования трехфункциональным фосфорилирующим реагентом, в качестве которого использовался гексаэтилтриамид фосфористой кислоты.
При взаимодействии тетраацетата дигидрокверцетина 3 с гексаэтилтриамидом фосфористой кислоты [144в] через 20 минут нагревания образуется открытоцепной диамидофосфит 3,3 ,4 -три-0 79 ацетилового эфира дигидрокверцетина 27 с химическим сдвигом 6 Р ІЗІм.д. [145в]. P(NEt2)3 ОАс При этом в фосфорном спектре отсутствует синглетныи сигнал с химическим сдвигом 118 м.д., характерный для исходного фосфорилирующего реагента. В том случае, если первичный амидофосфит 27 нагревать еще в течение получаса, то наблюдается межмолекулярное взаимодействие 2-х молекул тетраэтилдиамидофосфита тетраацетата дигидрокверцетина. t,C PNEt2 + P(NEt2)3 ОАс
Наблюдение за ходом процесса методом ЯМР Р показывает, что интегральная интенсивность сигнала с химическим сдвигом 131 м.д. уменьшается, а интенсивность сигнала с химическим сдвигом 139 м.д. синхронно увеличивается.
Вероятно, происходит сближение амидофосфитных групп в такой степени, что между ними происходит перераспределение электронной плотности, например, по схеме:
![Синтез и исследование новых амфифильных соединений на основе производных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонана](/i/i/4708/551014.png "Синтез и исследование новых амфифильных соединений на основе производных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонана Веремеева Полина Николаевна")
