Содержание к диссертации
Введение
1. ГАМКд-рецептор и его лиганды: обзор литературы 8
1.1. Структурные особенности ГАМКА-рецептора 9
1.2. Фармакологические особенности подтипов рецептора ГАМКА 10
1.3. Агонисты и антагонисты ГАМК-связывающего центра ГАМКА-рецептора 12
1.3.1. Агонисты ГСЦ ГАМКА-рецептора 12
1.3.2. Антагонисты ГСЦ ГАМКА-рецептора 17
1.4. Модуляторы бензодиазепин-связывающего центра ГАМКА-рецептора 19
1.5. Прочие лиганды ГАМКА-рецептора 25
1.6. Сравнение рецепторов ГАМКА и ГАМКС 28
1.7. Обзор пространственных моделей ГАМКА-рецептора 29
2. Молекулярное моделирование ГАМКА-рецепторов и анализ лиганд-рецепторных взаимодействий для центров связывания ГАМК и бензодиазепинов
2.1. Построение моделей внеклеточного домена ГАМКА-рецепторов 35
2.1.1 Выбор шаблонных белков для моделирования внеклеточного домена ГАМКА-рецепторов 35
2.1.2. Моделирование молекулярной динамики шаблонных белков 43
2.1.3. Построение моделей ГАМКА-рецепторов 44
2.2. Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий для центров связывания ГАМКА-рецепторов 47
2.2.1. Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий центра связывания ГАМК 47
2.2.2. Схема активации и ингибирования ГАМКА-рецептора
2.2.3. Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий для центра связывания бензодиазепинов 59
3. Молекулярное моделирование ГАМКс-рецептора анализ его лиганд-рецепторных комплексов и сравнение с рецептором ГАМКА 71
3.1. Анализ лиганд-рецепторных комплексов рецептора ГАМКс 72
3.2. Оптимизация лиганд-рецепторных комплексов рецепторов ГАМКс методами моделирования молекулярной динамики 73
3.3. Молекулярные факторы, отвечающие за селективность лигандов ГАМКА И ГАМКС рецепторов 76
4. QSAR-модели для лигандов рецепторов ГАМКА: анализ активности и селективности 79
4.1. CoMFA-модели для антагонистов ГАМК-связывающего центра 81
4.2. Построение QSAR-моделей для лигандов бензодиазепин-связывающего центра ГАМКА-рецептора 84
4.2.1. MFTA- и CoMFA-модели для производных имидазобензодиазепина 85
4.2.2. MFTA- и CoMFA-модели производных пиридазина 95
4.3. QSAR-модели для подтипов БСЦ ГАМКА- рецепторов, построенные с помощью искусственных нейронных сетей 200
5. Виртуальный скрининг лигандов рецепторов ГАМКА 105
5.1. Виртуальный скрининг на основе бензодиазепин-связывающего центра ГАМКА-рецептора 105
5.2. Виртуальный скрининг с помощью MFTA-моделей 102
5.3. Виртуальный скрининг на основе фармакофорных отпечатков
Заключение 122
Выводы
- Фармакологические особенности подтипов рецептора ГАМКА
- Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий для центров связывания ГАМКА-рецепторов
- Оптимизация лиганд-рецепторных комплексов рецепторов ГАМКс методами моделирования молекулярной динамики
- Виртуальный скрининг с помощью MFTA-моделей
Введение к работе
Современная органическая химия ставит перед собой в качестве одной из главных целей синтез веществ с заданными физико-химическими, фармакологическими и другими свойствами. Существует несколько основных подходов для разработки и поиска структур таких веществ. С бурным развитием компьютерных методов проводить такой поиск стало значительно быстрее и легче. Методы компьютерной химии, молекулярного моделирования и QSAR позволяют найти вещества с необходимыми свойствами и определенной биологической активностью. Полученные результаты помогают задать направление для дальнейшей модификации структур с учетом многогранных параметров биологической системы или технических условий.
Одной из важных фармакологических мишеней среди рецепторов центральной нервной системы (ЦНС) является рецептор у-аминомасляной кислоты подтипа А (ГАМКА-рецептор), участвующий в важнейших процессах ЦНС и психики человека: процессе быстрой передачи нервного импульса, процессах обучения и формирования памяти, бодрствования и сна. Рецептор ГАМКд напрямую и опосредованно задействован в различных заболеваниях: депрессии, шизофрении, биполярных расстройствах, бессоннице, эпилепсии, алкоголизме и других заболеваниях. Поэтому поиск селективных лигандов ГАМКА рецептора и его подтипов является актуальным и направлен на создание лекарственных средств для лечения этих болезней, а также стимуляции когнитивных процессов.
Для дизайна лигандов рецепторов используются два основных метода: (а) создание библиотеки веществ с потенциальной биологической активностью для последующего биологического скрининга; (б) модификация веществ с известной биологической активностью на основе QSAR-моделей и моделей лиганд-рецепторных комплексов. Библиотеки химических веществ с заданной биологической активностью создаются с помощью виртуального скрининга на основе пространственной структуры биологической мишени или на основе лигандов данной мишени. Для использования первого метода необходимо наличие трехмерной структуры белка. Однако пространственная структура ГАМКА-рецептора в силу ограничений методов молекулярной биологии пока не была получена экспериментально. Вместо этого используют пространственные модели рецепторов, построенные методом моделирования по гомологии, далее с помощью докинга получают лиганд-рецепторные комплексы и оптимизируют их методами моделирования молекулярной динамики.
Рецептор ГАМКд представляет собой макромолекулярный комплекс, состоящий из 5 субъединиц, образующих ионный канал, селективный к ионам хлорида и бикарбоната. Специфичность взаимодействия лигандов с подтипами рецепторов и физиологический ответ организма на них зависят от субъединиц, входящих в состав рецептора. Выделяют семь типов субъединиц - а, (3, у, 6, є, л, 0, среди них различают шесть подтипов сс-субъединиц, по три подтипа Р" и у-субъединиц, также выделяют ГАМКс-рецепторы, являющиеся подтипами ГАМКд-рецепторов, состоящих из pl-З- субъединиц. Во внеклеточном домене ГАМКА-рецептора выделяют два основных центра4 связывания лигандов: ГАМК-связывающий центр (ГСЦ), образованный а- и Р-субъединицами и бензодиазепин-связывающий центр (БСЦ), образованный а- и у-субъединицами.
Целью настоящей диссертационной работы являлся компьютерный дизайн потенциальных лигандов ГАМКл-рецептора на основе молекулярных моделей рецепторов и QSAR.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Построить пространственные модели внеклеточных доменов ГАМКд-рецепторов состава аьбРгУг» а также внеклеточного домена pi ГАМКс-рецептора для изучения лиганд-рецепторных взаимодействий и проведения виртуального скрининга;
• Изучить связывание известных лигандов с ГСЦ и БСЦ, которые объясняют известные зависимости «структура-активность» и «структура-селективность»;
• Изучить механизмы активации и ингибирования рецептора для разработки лигандов, взаимодействие которых с рецептором учитывает эти механизмы на молекулярном уровне;
• Построить QSAR-модели для лигандов ГАМКд-рецепторов, объясняющие зависимости структура-активность и структура-селективность на количественном уровне;
• Разработать систему виртуального скрининга на основе полученных QSAR-моделей для лигандов и моделей внеклеточного домена рецептора и сформировать библиотеки новых потенциальных лигандов.
В диссертации используются следующие обозначения: ГАМК - у-аминомасляная кислота
ГАМКА - рецептор у-аминомасляной кислоты, подтип А; ГАМКс - рецептор у-аминомасляной кислоты, подтип С; ГСЦ - ГАМК-связывающий центр; БСЦ — бензодиазепин-связывающий центр;
QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) - количественные соотношения структура-активность;
3D-QSAR (3 Dimensional Quantitative Structure-Activity Relationships) -количественные соотношения пространственная структура-активность; CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) - сравнительный анализ молекулярных полей;
CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis) - сравнительный анализ индексов сходства;
MFTA (Molecular Field Topology Analysis) - топологический анализ молекулярных полей. ELIC - пентамерный лиганд-зависимый ионный канал бактерии Erwinia chrysanthemi;
GLIC - пентамерный лиганд-зависимый ионный канал бактерии Gloeobacter violaceus;
ММД - моделирование молекулярной динамики;
СКО - среднеквадратичное отклонение;
ЦНС - центральная нервная система.
Нумерация соединений, рисунков и таблиц отдельная в каждой главе.
Прежде чем приступить к изложению полученных результатов, приведем обзор литературы, посвященной структуре и лигандам ГАМКА-рецептора.
Фармакологические особенности подтипов рецептора ГАМКА
Сложная архитектура ГАМКА-рецептора позволяет существовать огромному количеству рецепторов с различным составом субъединиц, входящих в него. В состав ГАМКА-рецепторов ЦНС обязательно входят а и Р субъединицы, дополнительной будет являться у, 5, є или 9 субъединица. ГАМКА-рецепторы располагаются на постсинаптической мембране нейрона, их состав зависит от физиологических, тендерных и возрастных параметров. Основными комбинациями субъединиц в рецепторе в головном мозге являются: хір2у2, а2рхУ2, азРхУг, а4РхУ2, а4р2,зо\ а5 6РхУ2, а6р2,з5; остальные комбинации возможны, но экспериментально не доказаны [1]. Большое разнообразие ГАМКА-рецепторов ставит дополнительные задачи по созданию высокоактивных и высокоселективных аналогов ГАМК. Экспрессия различных подтипов субъединиц ГАМКА-рецептора в определенных участках мозга регулируется различными внешними и внутренними факторами, что оказывает влияние на многогранную картину психики человека и наоборот является ее отражением. Показано участие субъединиц ГАМКА-рецептора в патологических процессах психики человека и заболеваниях ЦНС: алкоголизме, эпилепсии, шизофрении, биполярном аффективном расстройстве, синдроме Ангельмана, синдроме Прадера-Вилли, маниакально-депрессивном психозе, аутизме и ряде других заболеваний [7]. Лиганды ГАМКА-рецепторов могут найти применение при лечении этих заболеваний, агонисты и положительные модуляторы ГАМКА-рецептора могут использоваться для анестезии. ГАМКд-рецепторы, которые содержат 8 субъединицу, являются внесинаптическими и проявляют высокую аффинность по отношению к ГАМК, и не десенсибилизируются в случае длительного действия агониста. Такие рецепторы представляются идеальными кандидатами на роль рецепторов, опосредующих тоническое торможение [8]. Лиганды рецептора ГАМКс могут найти применение при лечении заболеваний психики, а также при лечении глазных болезней, поскольку экспрессия р1_3 субъединиц обнаружена в тканях глаза [1]. Показано влияние ГАМКс-рецепторов на рост клеток сетчатки глаза и формирование близорукости [9]. Фармакологические свойства лигандов подтипов ГАМКА рецептора зависят от его состава.
Фармакологические и структурные свойства рецептора изучают различными методами: поведенческий анализ при введении высокоселективных лигандов, получение мышей или крыс нокаутных по субъединицам ГАМКА-рецетора, точечные мутации аминокислот. К примеру, для мыши, нокаутной по as субъединице было отмечено улучшение процессов обучения и запоминания [10]. Определенные субъединицы ГАМКд-рецептора задействованы в ряде специфических физиологических процессов в головном мозге Т [11] (см. таблицу 1-1). На эти процессы могут х влиять лиганды, селективные к ГАМКд- t -рецептору с заданным составом. Большинство препаратов на основе высокоселективных лигандов, находящихся на стадии клинических испытаний, связываются с БСЦ. Селективность действия лиганда может выражаться в агонистическом действии на один подтип рецептора и антагонистическом на другой. Таким примером может быть лиганд L-838417 1-2, являющийся частичным агонистом для рецепторов, содержащих аг/з и а5 субъединицы, и антагонистом для рецепторов, содержащих сії субъединицу. Он проявляет антиноцицептивное действие, известное для диазепама, высокоселективного к рецепторам, содержащим щ субъединицу, но не обладает миорелаксантным и амнестическим действием, свойственным для него, и являющимся побочным для антиноцицепции [12]. Таблица 1-1. Фармакологические свойства лигандов, селективных к рецепторам, содержащим определенные субъединицы ГАМКА-рецептора и свойства отдельных субъединиц. Субъединица Фармакологические свойства лигандов и субъединиц i Снотворное, успокаивающее, противоэпилептическое, антероградная амнезия, ноцицепция, привыкание а2 Тревожные состояния, расслабление мышечной ткани, алкоголизм а3 Тревожные состояния, расстройства настроения, ноцицепция, расслабление мышечной ткани, алкоголизм ОЦ Тревожные состояния, амнезия «5 Процессы обучения и памяти 6 Алкоголизм, расстройства настроения, расслабление мышечной ткани Pi Алкоголизм, биполярные расстройства Р2 Успокаивающее, алкоголизм, шизофрения Рз Гиперактивность и гиперреактивность, процессы обучения и памяти (АН), алкоголизм, синдром Ангельмана, эпилепсия Yi Нарушения в эндокринной системе 72 Тревожные состояния, шизофрения Уз Алкоголизм, аутизм 5 Тревожные состояния, амнезия ГАМК применяется в медицинской практике как ноотропное средство, однако было показано, что он плохо проникает через гематоэнцефалический барьер. Предполагают, что транспорт ГАМК внутрь мозга протекает опосредованно - через специфические мембранные транспортеры (GAT2/BGT-1) [13]. Агонисты ГСЦ обладают тремя фармакофорными фрагментами: отрицательно и положительно заряженными участками и разделяющим их фрагментом. Каждый из этих фрагментов вносит вклад в активность и селективность лиганда. ГАМК обладает высокой конформационной подвижностью, поэтому одним из подходов к разработке агонистов ГАМКА-рецептора является создание конформационно ограниченных аналогов ГАМК. Линейные аналоги ГАМК Линейные аналоги ГАМК были получены вариацией фрагмента, соединяющего заряженные группы.
Такими примерами могут быть: транс-4-аминокротоновая кислота 1-3 (ТАСА), являющаяся самым сильным агонистом ГАМКс-рецептора и цис-4-аминокротоновая кислота 1-4 (САСА), являющаяся самым селективным агонистом рецептора ГАМКА. Линейные аналоги ГАМК, замещенные по атомам углерода, проявляют меньшую активность или вообще ее не проявляют. Только 2-фтор-ТАСА 1-5 проявляет незначительно меньшую активность к ГАМКс-рецептору, чем к ГАМКА-рецептору [6]. 2-Метил-ТАСА является очень слабым агонистом ГАМКА-рецептора [14], обладает селективностью к pi и р2 ГАМКс-рецепторам и не действует на р3 ГАМКс-рецептор [15]. Замещение аминогруппы в ГАМКА на гидроксильную группу приводит к полной потере активности полученного соединения [16]. г-3-(Аминоиминометил)-тиопроп-2-еновая кислота 1-6 (ZAP А) является производным изотиомочевины. Аналоги ZAPA с заместителями при атомах азота гуанидиновой 1-7 и амидиновой 1-8 групп являются потенциальными агонистами ГАМКА-рецептора; самыми активными производными оказались w-гексильный и н-пентильный аналоги [17]. Для природной аминокислоты таурина 1-9 найдено слабое агонистическое действие на ГАМКА-рецептор, таурин обладает нейропротекторными свойствами [18]. Циклические аналоги ГАМК Циклические лиганды ГАМКА-рецептора являются конформационно ограниченными аналогами ГАМК с замещением фармакофорных групп на функционально схожие (биоизостерные) фрагменты. Мусцимол 1-10 был выделен из Мухомора красного (Amanita muscaria), он оказывает сильное агонистическое действие на ГАМКА-рецепторы. Показано, что мусцимол проявляет выраженный антиноцицептивный эффект [19]. Так как купирование боли достигается без участия опиоидных рецепторов, то мусцимол и его производные не обладают наркотическим действием и не вызывают привыкания. Мусцимол послужил основной для синтеза различных аналогов, обладающих различной селективностью по отношению к подтипам ГАМКА-рецепторов. Заменой изоксазольного фрагмента в мусцимоле на изотиазолол или гидроксиизоксазолин получены агонисты ГАМКА-рецептора - тиомусцимол 1-11 и дигидротиомусцимол. (8)-Дигидромусцимол (ДІМ) 1-12 является самым сильным агонистом ГАМКА-рецептора, известным на сегодняшний день, он в 8 раз активнее ГАМК [20], а (ІІ)-дигидромусцимол в 8 раз менее активен, чем ГАМК.
Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий для центров связывания ГАМКА-рецепторов
Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий позволяет оценить вклад отдельных фрагментов лиганда в активность или селективность его действия. Хорошая модель, построенная по гомологии, позволяет оценить эти вклады, которые учитываются для дальнейшего дизайна и модификаций лигандов. Для центров связывания ГАМК и бензодиазепинов ГАМКА-рецептора мы провели анализ лиганд-рецепторных взаимодействий методом молекулярного докинга. Для этого был проведен анализ литературных данных об участии аминокислотных остатков субъединиц рецептора в связывании агонистов и антагонистов. Докинг проводили с помощью программ DOCK v6 [134] и AutoDock v4 [135]. При расчетах использовались заряды MMFF94 для лигандов и FF99SB для рецептора. Протонированные/депротонированные структуры лигандов были заданы согласно предполагаемому состоянию при физиологическом рН. Конформационный поиск программы докинга был ограничен пространством, образованным двумя соседними субъединицами: ар в случае ГСЦ, ау - в случае БСЦ. При докинге с помощью программы Autodock учитывалась гибкость аминокислотных остатков центра связывания, для обеих программ докинга учитывалась гибкость лигандов. Визуализация лиганд-рецепторных взаимодействий выполнена с помощью программы Pymolv0.98-l.lr [136]. Для анализа лиганд-рецепторных взаимодействий мы провели исчерпывающий анализ литературных данных о влиянии аминокислот центра связывания на активность и селективность, провели докинг и анализ вкладов лигандов на качественные и количественные связи структура-активность и структура-селективность. Аминокислоты, важные для связывания агонистов и антагонистов ГСЦ Информация о влиянии индивидуальных аминокислот на активность лигандов и работу рецептора была собрана из литературных источников (таблица 2-4). Таблица 2-4. Аминокислоты, напрямую или опосредованно участвующие в связывании агонистов и антагонистов ГСЦ.
Использованные сокращения: АК -аминокислота, СУ - субъединица. Нумерация аминокислот приведена согласно последовательности из Swiss-Prot. Приведенные в таблице методы: замена на неприродные аминокислоты (НАК), мутации на цистеин с последующим введением специфичного реагента (SCAM - substituted cysteine accessibility method). Взаимодействие агонистов с ГАМК-связывающим центром уже было описано различными группами ученых (см. Главу 1), однако результаты моделирования сильно разнятся, и общепринятая картина взаимодействий для лигандов, а также описания зависимостей структура-активность отсутствуют в литературе. Основным взаимодействием карбоксильной группы считается образование солевого мостика с Arg [99], в некоторых статьях это взаимодействие вообще отрицается [106]. Для аминогруппы основное обсуждение идет вокруг образования катион-я взаимодействия с ароматическими аминокислотами - p2Tyr97, {32Туг157, J32Tyr205 [105] или ajPhe92 [106]. Практически все авторы упоминают образование ароматического куба, характерного для всей группы ЛЗИК. Таким образом, на сегодняшний день отсутствует ясная картина лиганд-рецепторного взаимодействия агонистов ГАМК. Поэтому нами была предпринята попытка описать взаимодействия агонист-ГСЦ на молекулярном уровне, а также описать зависимости структура-активность (SAR). Для этого нами был проведен докинг агонистов в центр связывания ГАМК (ГАМК, мусцимол, ТШР, ТАСА, ZAPA и других лигандов) в модели рецептора, соответствующие открытой и закрытой форме канала рецептора. Отметим, что нами впервые были построены модели ГАМКА-рецепторов, отвечающих закрытой форме канала рецептора состава ахР2У2,з (модели построены на основе 2QC1, 2BYN). В центре связывания эпибатидина в шаблонном белке 2BYQ преобладают ароматические аминокислоты, поэтому такое окружение условно называют ароматическим кубом. Данное окружение повторяется и в модели ГСЦ. Согласно значениям оценочной функции программы докинга AutoDock наиболее выгодной является конформация лиганд-рецепторного комплекса, приведенная на рисунке 2-10: карбоксильная группа ГАМК образует солевой мостик с alArg67 и водородные связи с гидроксильными группами р2Туг157 и 32Thrl30; аминогруппа также образует солевой мостик с (32Glul55 и окружена p2Tyrl57, p2Phe200 и р2Туг205. Доферти и соавторы указывают на аминокислоту р2Туг97, участвующую в связывании ГАМК, однако в нашей модели она находится далеко от центра связывания и не участвует в связывании лигандов. Конформация ГАМК, полученная нами, является «вытянутой», что согласуется с отсутствием или понижением активности у конформационных аналогов ГАМК, не соответствующих вытянутой конформации лигандов. Мусцимол и ТШР повторяют описанную выше схему связывания ГАМК, а повышенная активность мусцимола и ТШР объясняется дополнительным тс-к стэкингом ароматических колец центра связывания и лигандов, меньшей конформационной подвижностью и более высоким значением липофильности лигандов. Следует отметить, что связывание агонистов с центром связывания в различных состояниях (открытое и закрытое) не затрагивает конформационные изменения аминокислот a,iArg67 и p2Glul55, а основные изменения центра связывания наблюдаются в плотности упаковки ароматического куба, что было показано методами моделирования молекулярной динамики (см. далее). Введение заместителей в свободные положения линейных или циклических аналогов ГАМК вносит стерические затруднения, что приводит к потере дополнительных водородных связей с гидроксильными группами ргТуг157 и сцТпгІЗО.
Любые замещения в аминогруппе агонистов понижают активность, так как теряются описанные водородные связи. Биоизостерическая замена кислотной группы ГАМКЛ на изоксазольную или тиоизоксазольную (мусцимол, тиомусцимол) либо повышает активность, либо не вносит значительных изменений в лиганд- рецепторные комплексы и не меняет активность лигандов. Уменьшение относительной величины отрицательного заряда в о аналогах ГАМК уменьшает или устраняет У—он активность по отношению к ГАМКл-рецепторам. . { Увеличение или уменьшение расстояния / \ между заряженными центрами агонистов также HzN 4 уменьшает активность лигандов ГСЦ. Так, для стереоизомеров З-аминоциклопентан-1-овой кислоты (Глава 1, 1-23) уменьшение активности для R,S-rooMepoB связано с уменьшением расстояния между атомом азота аминогруппы и атомом углерода карбоксильной группы до 3,45 А, тогда как для R,R и S,S изомеров это расстояние равно 4,96 А, что соответствует расстоянию между заряженными центрами в конформации ГАМК (5,05 А), полученной методом докинга. Заместители при атомах углерода ГАМК (метил, фтор) уменьшают активность, это связано с дополнительными стерическими затруднениями, возникающими при взаимодействии лигандов с ароматическим кубом. Замещение подвижного стерического «скелета» ГАМК на плоские фрагменты в таких лигандах как ТАСА, мусцимол, ТШР и других увеличивало или не оказывало значительного влияния на активность. Это связано с тем, что конформационно ограниченные аналоги ГАМК взаимодействуют с ароматическим кубом лучше за счет л-тг стэкинга. Катион-п взаимодействия лигандов ГСЦ с ароматическим кубом В литературных источниках активно обсуждается взаимодействие аминогруппы лигандов с ароматическим кубом. Предполагается, что катион-к взаимодействие является основным для связывания лигандов рецепторов ГАМКА[105]. Первое предположение о силе катион-7Е взаимодействия в лиганд-рецепторных системах развивалось в работах Доферти и сотрудников. Оно базировалось на том основании, что замещение ароматических аминокислот центра связывания на искусственные аминокислоты влияет на силу катион-я взаимодействия и оказывает влияние на аффинность лигандов. Однако в этом методе не учитывается влияние таких аминокислот на общие конформационные изменения центра связывания лигандов.
Оптимизация лиганд-рецепторных комплексов рецепторов ГАМКс методами моделирования молекулярной динамики
Для уточнения аминокислот, участвующих в связывании лигандов, нами была проведена оптимизация лиганд-рецепторных комплексов димеров pi ГАМКс-рецептора с ГАМК и с ТРМРА с помощью методов моделирования молекулярной динамики (МД № 1). Для уменьшения расчетного времени был использован алгоритм SHAKE. Центр связывания был помещен в сферу 20 А с явно заданной водой типа TIP3P, максимально охватывающей его. Также было задано силовое ограничение на движение атомов вне сферы - 75 ккал/моль. Для расчетов использовали программное обеспечение AMBER v9. Для лигандов использовались заряды АМ1-ВСС и силовое поле GAFF. Полученная система была нагрета от 0 до 300 К в течении 1000 пс, далее проведено моделирование молекулярной динамики в течении 10 не. Статистический анализ результатов моделирования молекулярной динамики проводили с помощью программы ptraj v9.9i [127]. Поведение ГАМК при моделировании молекулярной динамики оказалось нестабильным, лиганд уходил из начальной позиции. Конформация ГАМК после окончания ММД характеризуется следующими взаимодействиями: обнаружены водородные связи аминогруппы ГАМК и атомом кислорода основной цепи Тугі 98, (СН2)з фрагмент ГАМК взаимодействует с Argl58 и Leu 166. Результаты моделирования молекулярной динамики (МД) комплекса ГСЦ-ТРМРА показали, что позиция лиганда стабильна во времени. На рисунке 3-3 показано СКО отклонение атомов ГАМК и ТРМРА во время моделирования молекулярной динамики. Нами впервые показано закрытие центра связывания С-петлей спустя 200 пс после начала симуляции МД, во время нагрева системы до 300 К. Между фосфоновой группой ТРМРА и Argl04 образовался солевой мостик. Также показано образование солевого мостика Glul94 с Argl70 и опосредованное участие Glul94 в связывании ТРМРА (Рис. 3-4). Отметим, что докинг в конформацию центра связывания, отвечающую закрытому состоянию канала рецептора, не позволяет выявить всех лиганд-рецепторные взаимодействия наблюдаемые после ММД. Самой выгодной по оценочной функции программы докинга оказалась конформация, в которой ГАМК образует ранее не описанный нами солевой мостик аминогруппы лиганда с Glul96, а взаимодействие с Туг247 и Argl04 соответствует наблюдавшемуся взаимодействию при первичном докинге ГАМК. Кроме того, показано образование водородной связи с атомом водорода гидроксильной группой Тугі 98 и карбоксильным фрагментом ГАМК.
Полученный комплекс ГАМК-ГСЦ был оптимизирован методами моделирования молекулярной динамики по ранее описанной схеме (МД № 2). Позиция ГАМК в центре связывания оказалась стабильной, солевые мостики между аминогруппой и Glul96 и карбоксильной группой и Argl04 присутствуют в течение всего времени моделирования молекулярной динамики. Ароматический куб образован Тугі 98, Туг241 и Туг247, гидроксильная группа Туг 198 образует водородную связь с карбоксильной группой ГАМК (Рис. 3-5). Солевой мостик между Glul94 и Argl70 сохранился, также наблюдалось участие Glul94 в связывании с аминогруппой ГАМК. Участие молекул воды в связывании лигандов не обнаружено. На рисунке 3-6 показан график среднеквадратичного отклонения (СКО) для атомов ГАМК во время моделирования молекулярной динамики. Для ТРМРА не наблюдается образование ароматического куба во время моделирования молекулярной динамики, как это наблюдается для ГАМК. Это может объяснить антагонистическое действие ТРМРА. В настоящее время идет активная дискуссия об участии катион-л; взаимодействий в связывании аминогруппы лигандов ГАМКс рецептора [166]. Однако авторы не указывают на участие ни Glul94, ни Glul96 в связывании лигандов. Равновероятно участие аминогруппы как в образовании солевых мостиков, так и катион-л взаимодействиях (см. также обсуждение в Главе 2). Нами впервые показано участие Glul94 и Glul96 в связывании лигандов ГАМК-связывающего центра ГАМКс-рецептора. Схема активации рецептора ГАМКс повторяет таковую для рецептора ГАМКд, что лишний раз подчеркивает структурное и функциональное родство этих рецепторов. Для дизайна селективных лигандов отметим особенности центров связывания ГАМК для рецепторов ГАМКд и ГАМКС на основе полученных лиганд-рецепторных комплексов и структур рецепторов (таблица 3-1). Основные различия между центрами связывания наблюдаются в С-петле: участок Рг субъединицы ГАМКА-рецептора на одну аминокислоту меньше (VF-ST), чем аналогичный участок pi субъединицы ГАМКС-рецептора (FYSST), рис. 3-7. Таким образом, центр связывания ГАМК рецептора ГАМКС обладает меньшим размером и большей липофильностью. Антагонизм связан с взаимодействием липофильного заместителя в центре связывания с аминокислотами С-петли: F240,Y241,S242. Показано, что для ГАМКс рецептора, как и для рецептора ГАМКА характерно образование ароматического куба при связывании агониста и его разрушение при связывании антагонистов. Для обоих рецепторов повторяется схема активации и ингибирования. Таким образом, нами впервые были построены модели внеклеточного домена ГАМКс-рецептора, отвечающего закрытой форме канала рецептора, проведены исследования лиганд рецепторных комплексов методами моделирования молекулярной динамики, полученных докингом, а также проведен анализ факторов, отвечающих за селективность связывания лигандов с рецепторами ГАМКА и ГАМКС.
Впервые отмечено значительное участие аминокислот Glul94 и Glul96 в связывании лигандов, что является альтернативной схемой связывания лигандов ГАМКс-рецептора. Полученная модель рецептора pi ГАМКс в дальнейшем была использована для компьютерного дизайна новых лигандов. Основной субъединицей, ответственной за селективность лигандов по отношению к подтипам ГАМК и бензодиазепин-связывающих центров, является а субъединица. Самым распространенным в головном мозге подтипом а-субъединиц является щ -субъединица, другие подтипы экспрессируются в значительно меньшем количестве. Лиганды, селективные к ГАМКд-рецепторам, в состав которых входит оц субъединица, обладают седативным и снотворным действием; селективные к рецепторам, содержащим а2/з проявляют анксиолитические свойства; к рецепторам, содержащим а5 субъединицу, оказывают положительное действие на когнитивные процессы. Создание QSAR-моделей позволяет прогнозировать не только активность, но и селективность потенциального лиганда. Одним из методов, используемых компьютерной химией, является исследование количественных соотношений структура-активность (QSAR, Quantitative Structure-activity relationships). Мы впервые построили модели MFTA, CoMFA/CoMSIA для производных 4PIOL, имидазобензодиазепина и пиридазина и интерпретировали полученные результаты с помощью трех пространственных моделей центров связывания бензодиазепинов состава аі,з,5У2 и центра связывания ГАМК рецептора состава aiP2. Построенные QSAR-модели были использованы для количественного анализа зависимостей структура-активность, структура-селективность, а также подтверждения и критического анализа пространственных моделей рецептора и виртуального скрининга на их основе. Метод сравнительного анализа молекулярных полей (Comparative Molecular Field Analysis, CoMFA) [167] и метод сравнительного анализа индексов сходства (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis, CoMSIA) [168] используют различия в формах и энергиях полей нековалентных взаимодействий, окружающих молекулы, и соответствующие изменения в активности исследуемых молекул. В методе CoMFA применяются стерические и электростатические поля, для CoMSIA-моделей дополнительно используются поля липофильности, поля доноров и акцепторов водородных связей.
Виртуальный скрининг с помощью MFTA-моделей
Значением фрагментного дескриптора является число вхождений соответствующего подграфа в молекулярный граф (то есть фрагментный дескриптор показывает количество соответствующих подструктур в химической структуре). FRAGMENT дает избыточное описание структуры, а ввиду того, что нейросетевые модели подвержены переучиванию, возникает необходимость отбора наиболее значимых дескрипторов. Для их отбора использовался метод быстрой пошаговой множественной линейной регрессии (FSMLR, fast stepwise multiple linear regression) [195], на основе которого были выбраны первые 100 значимых дескрипторов, общее количество рассчитанных дескрипторов - 14 530. Построение QSAR-моделей проводили с помощью модифицированной программы Backprop [196], являющейся реализацией алгоритма обратного распространения ошибки для обучения нейронной сети. Оптимизацию количества скрытых нейронов, а также процедуру двойного скользящего контроля, вследствие больших вычислительных объемов проводили на компьютерном кластере (16 процессоров). Для построения моделей была использована трехслойная полносвязная нейронная сеть прямого распространения с архитектурой п-x-l, где п - число нейронов входного слоя, соответствующее количеству отобранных дескрипторов, JC - число скрытых нейронов, 1 - нейрон выходного слоя, соответствующий прогнозируемому свойству. Обучение искусственной нейронной сети проводили по алгоритму обратного распространения ошибки. Количество скрытых нейронов варьировали от 1 до 10. Для каждой архитектуры была проведена процедура двойного скользящего контроля с шагом разбиения 10 (90-кратный контроль). Наилучшие статистические характеристики моделей для всех трех моделируемых свойств были получены с использованием архитектуры 100-4-1, где скрытый слой содержал 4 нейрона. Статистические параметры полученных QSAR-моделей для подтипов ГАМКд-рецептора приведены в таблице 4-8, используемые сокращения: N — количество использованных молекул, разбивка - количество соединений в обучающей, тестовой и выборке внешнего контроля, ( параметр перекрестного контроля, RMSE — среднеквадратичная ошибка для перекрестного контроля, R (ов) - квадрат коэффициента корреляции для обучающей выборки, R2(BKI) - для выборки внутреннего контроля, І?2(вк2) -для выборки внешнего контроля. Графики сравнения реальных и предсказанных значений активностей лигандов обучающей выборки и выборок внешнего и внутреннего контроля для полученных моделей приведены на рис. 4-18. Сравнение дескрипторов, использованных для построения моделей, показало: среди дескрипторов, использованных для построения моделей для рецепторов, содержащих аі и аз субъединицы, пересекаются 14 %, содержащих (Xi и а5 - 8%, а для аз и а5 - 17% дескрипторов.
Таким образом, можно сказать, что модели несут в себе общие черты, при этом для моделей, относящихся к рецепторам, содержащим аз и а5 субъединицы, наблюдается большее сходство дескрипторов. В настоящее время приблизительная оценка количества реальных органических соединений, доступных в открытых и коммерческих базах данных, исчисляется десятками миллионов. Помимо реальных баз данных органических веществ существуют виртуальные базы веществ, созданные как с учетом определенных параметров, таких как, синтетическая доступность, фармакокинетические данные, так и без их учета [197, 198]. Одним из компьютерных методов поиска новых потенциальных лигандов, действующих на заданную биологическую мишень, является виртуальный скрининг. Виртуальный скрининг может быть проведен как на основе известного центра связывания биологической мишени (белок, РНК, полипептид), так и на основании различных фармакофорных и QSAR-моделей, построенных с использованием лигандов с известной активностью. Полученные после виртуального скрининга сфокусированные библиотеки органических соединений можно использовать для дальнейшего биологического скрининга или как отправную точку для дальнейшей оптимизации лиганда. 5.1. Виртуальный скрининг на основе бензодиазепин-связывающего центра ГАМКА-рецептора В этой работе разработана система виртуального скрининга потенциальных лигандов ГАМКА-рецептора на основе центра связывания бензодиазепинов.
Виртуальный скрининг на основе пространственной структуры биологической мишени является ресурсоемкой процедурой, занимающей много времени. В связи с этим необходимо ограничить размер базы данных для виртуального скрининга с помощью специальных фильтров. В работе впервые был проведен виртуальный скрининг на основе центра связывания бензодиазепинов, состоящего из ai и уг субъединиц. Для виртуального скрининга нами был выбран центр связывания, закрытый С-петлей, после оптимизации моделированием молекулярной динамики, что отвечает активированному состоянию рецептора, связанному с положительным модулятором. Разработанная система виртуального скрининга для БСЦ состоит из следующих элементов: 1. Анализ распознавания моделью БСЦ известных лигандов (бензодиазепинов и бензодиазепин-подобных веществ); 2. Предобработка базы данных для виртуального скрининга: отсеивание соединений с низкой вероятностью связывания для сокращения времени расчета; 3. Виртуальный скрининг; 4. Постобработка полученных сфокусированных библиотек. Анализ степени селективности центра связывания Для того, чтобы оценить способность выбранной конформации БСЦ селективно связываться с известными лигандами и не связываться с неактивными лигандами, нами был проведен докинг и расчет оценочной функции для следующих выборок соединений: 1. Бензодиазепины и бензодиазепин-подобные вещества (БПВ), для которых известна активность по отношению к БСЦ рецептора ГАМКд. Количество соединений - 549, активность в диапазоне 10"6-10" М. Эта выборка характеризует качество распознавания лигандов, активных по отношению к рецептору ГАМКд; 2. Выборка органических соединений с разнообразной химической и физико-химической природой (diversity set, DS) - 2044 соединения [199]. В этой выборке представлены соединения, отобранные с учетом разнообразия фармакофорных фрагментов (фармакофор состоит их трех фармакофорных фрагменов); дополнительными ограничивающими параметрами являлись: пять или менее вращающихся связей, один хиральный центр или его отсутствие, благоприятные фармакологические свойства (удалены металлоорганические соединения, полициклические ароматические структуры и др.); 3. Выборка 2095 соединений с известной активностью по отношению к 40 белковым мишеням (directory of useful decoys, DUD) [200]. В этой выборке активность соединений является фармакологически подтвержденной. Выборки DS и DUD позволяют оценить качество распознавания лигандов, неактивных к БСЦ рецептора ГАМКА.
![Молекулярный дизайн, синтез и комплексообразующие свойства макроциклических рецепторов на основе функционализированных каликс[4]аренов](/i/i/4364/201437.png "Молекулярный дизайн, синтез и комплексообразующие свойства макроциклических рецепторов на основе функционализированных каликс[4]аренов Гафиуллина Лилия Ильдаровна")
