Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
I. Масс-спектрометрическое de novo секвенирование пептидов 8
1. Методы определения первичной структуры пептидов 10
1.1. Методы классической биохимии
Деградация по Эдману
Методы генной инженерии
1.2. Методы масс-спектрометрии
1.3. Комбинированный метод - леддерное секвенирование 14
2. De novo секвенирование пептидов методами тандемной масс-спектрометрии положительных ионов 16
2.1. Диссоциация, активированная соударением (ДАС) 17
2.2. Диссоциация при электронном захвате (ДЭЗ) 22
2.3. Использование МАЛДИ для секвенирования пептидов 26
2.4. Фотоактивация диссоциации 29
3. Основные ограничения масс-спектрометрии положительных ионов при секвенировании пептидов и пути их устранения 31
3.1. Изобарные аминокислоты
Лизин и глутамин
Фенилаланин и окисленный метионин 36
3.2. Изомерные аминокислоты: лейцин и изолейцин 38
3.3. Пептиды, содержащие дисульфидную связь 41
Химические методы 41
Методы масс-спектрометрии 46
4. Использование масс-спектрометрии отрицательных ионов для секвенирования пептидов 50
II. Пептиды из кожи амфибий рода Rana 56
1. Общие сведения 56
2. Нейропептиды 57
3. Антибактериальные пептиды 58
4. Пептидное профилирование: значение в систематике и эволюции 66
Глава 2. Обсуждение результатов 68
I. Получение исходного биоматериала 68
II. Общая схема масс-спектрометрического секвенирования 68
III. Установление общего пептидного профиля 72
1. Оптимизация ВЭЖХ-разделения
2. Оптимизация эксперимента МАЛДИ
IV. Результаты МС - секвенирования пептидов при электрораспылении в режиме отрицательных ионов 84
V. Результаты масс-спектрометрического секвенирования при электрораспылении в режиме положительных ионов 86
1. Результаты МС-секвенирования пептидов, полученные прямым распылением образцов в источник ионов 86
1.1. Недериватизованные (исходные) пептиды 86
1.2. Дериватизованные дисульфидсодержащие пептиды 89
2. Результаты масс-спектрометрического секвенирования пептидов, полученные с применением ВЭЖХ-МС/МС (LTQ-FT) 96
2.1. Диссоциация при электронном захвате (ДЭЗ) 99
VI. Результаты масс-спектрометрического секвенирования пептидов с использованием МАЛДИ 101
VII. Детализация пептидного профиля R.ridibunda 111
VIII. Детализация пептидного профиля R.arvalis 114
IX. Сравнительное масс-спектрометрическое изучение пептидных профилей R.ridibunda, обитающих в различных климатических условиях 116
Проверка биологической активности ряда новых пептидов, выделенных из кожи R.ridibunda и R.arvalis 119
Глава 3. Экспериментальная часть 121
Выводы 127
Список литературы 129
- Методы определения первичной структуры пептидов
- Основные ограничения масс-спектрометрии положительных ионов при секвенировании пептидов и пути их устранения
- Установление общего пептидного профиля
- Результаты МС-секвенирования пептидов, полученные прямым распылением образцов в источник ионов
Введение к работе
Амфибии обладают широким набором соединений, секретируемых кожными железами. Благодаря им обеспечиваются регуляторные функции кожи животного. Пептидная составляющая секрета является также интегральной частью иммунной системы амфибий. Секретируемые пептиды проявляют различные виды биологической активности: среди них встречаются антибактериальные, противовирусные, антигрибковые, противоопухолевые и нейропептиды. Такой химический арсенал обеспечивает защиту животного как от патогенных организмов, так и от хищников.
Механизм действия биоактивных пептидов заключается в разрушении клеточной стенки патогенного организма. При этом структура пептида коррелирует с особенностями строения мембран разрушаемых клеток, что обусловливает высокую специфичность действия пептида. Например, антимикробные пептиды избирательно разрушают мембраны бактерий, но не активны в отношении соматических клеток. Такая специфичность является очень перспективной для использования пептидов в качестве направленных лекарственных препаратов нового типа, например, антибиотиков. Кроме того, благодаря иному, чем у традиционных антибиотиков механизму действия на патогенные организмы, невозможно появление штаммов, устойчивых к их действию. Это делает их привлекательными для фармакологической индустрии, постоянно ведущей поиск лекарств нового поколения. На сегодняшний день уже запатентованы и используются лекарства, созданные на базе синтетических пептидов, структурно совпадающих с пептидами, секретируемыми амфибиями. В частности, это буфорин (антибиотик) и каерулеин-1.1 - препарат с сильнейшим анальгетическим эффектом.
Создание таких препаратов начинается с установления первичной структуры пептида. Существующие классические химические методы определения аминокислотной последовательности (секвенирования) пептида -например, деградация по Эдману - часто малоэффективны, поскольку требуют
большого количества биоматериала и непригодны для анализа пептидных смесей.
Масс-спектрометрия зарекомендовала себя как экспрессный и чувствительный метод de novo секвенирования, который, в отличие от традиционной деградации по Эдману, не требует больших количеств образца, что позволяет работать с минорными компонентами кожного секрета. Кроме того, отпадает необходимость выделения анализируемого пептида в чистом виде - это открывает путь к работе с исходными смесями без предварительного их разделения на отдельные компоненты. И, наконец, она обеспечивает установление сиквенса длинных пептидов с массой более 4 тыс. Да: при деградации по Эдману этого достичь довольно трудно, поскольку с каждым шагом надежность определения уменьшается. Однако и масс-спектрометрическое секвенирование сопряжено с определенными сложностями. Поэтому актуальным является изучение возможностей масс-спектрометрии для de novo секвенирования пептидов амфибий, а также оптимизация самого масс-спектрометрического эксперимента.
Целью данной диссертационной работы является оптимизация стратегии масс-спектрометрического метода de novo секвенирования пептидов и установление первичной структуры пептидов, секретируемых кожными железами лягушек рода Rana (виды Rana ridibunda и Rana arvalis), а также проверка биологической активности ряда не описанных ранее de novo секвенированных пептидов.
Методы определения первичной структуры пептидов
Первым методом определения последовательности аминокислот стало секвенирование пептидов по Сэнгеру [5]. Суть его заключалась в последовательном отщеплении N-концевых аминокислот в результате реакции пептида с 2,4-динитрофторбензолом. Их дальнейшая хроматографическая идентификация осуществлялась путем сравнения со стандартными образцами. В настоящее время более удобным и часто используемым методом определения первичной структуры является деградация пептидов по Эдману [6, 7]. Деградация по Эдману. При взаимодействии N-концевой аминокислоты пептида с реагентом Эдмана - фенилизотиоцианатом - образуется фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное этой аминокислоты [8] (схема 1). Последовательно отщепляемые ФТГ-производные аминокислот идентифицируют по их временам удерживания путем сравнения с набором стандартов (ФТГ-производных всех аминокислот) с помощью ВЭЖХ или тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Появление автоматических секвенаторов [9] превратило метод деградации по Эдману в рутинный способ установления последовательности аминокислотных звеньев в пептидах. К несомненным достоинствам метода следует отнести высокую надежность идентификации ФТГ-производных всех аминокислот и практически полную автоматизацию самого процесса их определения.
Тем не менее, метод деградации пептидов по Эдману обладает значительными недостатками. Прежде всего, это требование высокой степени чистоты анализируемого вещества (отсутствие примесных пептидов), сравнительно большие количества образца ( 10-100 пмоль) и высокая стоимость анализа. При работе с природными материалами зачастую возникают непреодолимые препятствия, связанные с необходимостью выделения индивидуальных пептидов заданной степени чистоты и в нужных для анализа количествах.
Еще одним ограничением определения последовательности аминокислот по Эдману является длина анализируемого пептида. Поскольку, как и любая другая химическая реакция, взаимодействие с фенилизотиоцианатом не протекает количественно, с каждым новым шагом появляется все больше аминокислот, не отщепившихся на более ранних стадиях. В результате получаемые хроматограммы осложняются пиками ФТГ-производных аминокислот, отщепившихся на предыдущих шагах, что сильно затрудняет интерпретацию получаемых данных. Надежно идентифицировать можно лишь пептиды с максимальной длиной в 30-35 аминокислотных звеньев.
Помимо этого, химическая суть метода - взаимодействие фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой - также накладывает ряд ограничений на его применение. Пептиды, имеющие посттрансляционно модифицированную концевую аминогруппу, фосфорилированные пептиды и гликопротеины не могут быть секвенированы по Эдману. В некоторых случаях не проходит сама реакция, и, кроме того, отсутствуют ФТГ-стандарты, необходимые для идентификации всех возможных посттрансляционно модифицированных аминокислот.
Методы генной инженерии. Для определения первичной структуры белков все чаще используют анализ нуклеотидной последовательности комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) с применением соответствующих методов генной инженерии [10]. Такой анализ занимает значительно меньше времени и ниже по стоимости, чем деградация по Эдману. Из нуклеотидной последовательности кДНК или соответствующей последовательности матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК), которые содержатся в тех же тканях, что и анализируемые пептиды и белки, можно, учитывая особенности генетического кода, определить последовательность аминокислот кодируемого ими белка (не имея препарата белка!). Еще одним очевидным преимуществом метода является отсутствие ограничений по длине определяемого пептида или белка.
Однако этот подход, во-первых, не позволяет выявить посттрансляционные модификации белка, а во-вторых, дает информацию обо всех возможных аминокислотных последовательностях, которые могли бы экспрессироваться с данных мРНК. Реальное же количество экспрессируемых белков и пептидов, как правило, значительно меньше. Таким образом, анализ кДНК не дает картины истинного состава протеома, а лишь предоставляет информацию о том, каким он мог бы быть [11]. Последовательность праймеров для синтеза кДНК интересующего полипептида также не всегда ясна. Несмотря на указанные недостатки метод исключительно полезен, особенно при сопоставлении его результатов с данными масс-спектрометрического анализа пептидных смесей [12]. При наличии информации об аминокислотной последовательности пептида, установленной масс-спектрометрически, анализ кДНК позволяет устранить «белые пятна» в полученном сиквенсе: идентифицировать изобарные и изомерные аминокислоты (лейцин (Ьеи)/изолейцин (Не), лизин (ЬуБ)/глутамин (Gin), фенилаланин (Phe)/ окисленный метионин (Metox)), а также установить последовательность пептидов в исходном белке (полипептиде) после его энзиматического расщепления.
Основные ограничения масс-спектрометрии положительных ионов при секвенировании пептидов и пути их устранения
При интерпретации тандемных масс-спектров полипептидов, полученных любым из описанных методов активации фрагментации, пользуются дедуктивным подходом восстановления аминокислотной последовательности по разностям в массах соседних пиков серий образующихся ионов (схема 1.3). Это возможно благодаря тому, что массы аминокислотных остатков различны для природных аминокислот. Исключением являются изомерные лейцин и изолейцин, имеющие одинаковую массу аминокислотного остатка - 113 Да. Очевидно, что просто по разности в 113 Да нельзя провести отнесение Leu/Ile. Кроме того, изобарные лизин и глутамин имеют одинаковые целочисленные массы: 128.0949 и 128.0586 Да соответственно. Одинаковыми целочисленными массами - 147.0684 и 147.0354 Да- обладают также фенилаланин и окисленный метионин. Все три случая усложняют масс-спектрометрическое секвенирование пептидов. Однако существуют подходы, позволяющие провести отнесение масс 113,128 и 147 Да конкретным аминокислотам Leu/Ile, Lys/Gln и Phe/MetoX.
Образование дисульфидной связи между атомами серы двух остатков цистеина, входящих в полипептидную цепь, - одна из самых распространенных посттрансляционных модификаций цистеинсодержащих белков и пептидов, зачастую необходимая для приобретения ими своей биологической активности.
Использование обычных методов активации фрагментации для масс-спектрометрического секвенирования дисульфидсодержащих пептидов приводит к тому, что разрывы полипептидной цепи между связанными остатками цистеина либо отсутствуют, либо очень слабо выражены. Причина этого -конкуренция в разрывах пептидной и дисульфидной связей [54]. Для обеспечения разрывов пептидных связей между дисульфид-связанными остатками цистеина применяют различные методы, включающие как химическую модификацию дисульфидной связи, так и ее разрыв при использовании ДЭЗ, УФФД, высокоэнергетической ДАС и фрагментации в МАЛДИ.
Лизин и глутамин. Наиболее очевидным методом различения лизина и глутамина является использование масс-спектрометрии высокого разрешения. Например, приборы ИЦР с разрешением более 100000 позволяют однозначно проводить отнесение Lys/Gln измерением точных масс соответствующих фрагментных ионов.
К сожалению, масс-спектрометры ИЦР исключительно дороги и поэтому не являются широко распространенными. Рутинные приборы более низкого разрешения (ионная ловушка, квадрупольный или времяпролетный анализаторы) регистрируют разницу в массах с меньшей точностью и не позволяют надежно различать эти изобарные аминокислоты. Поэтому приходится применять другие подходы. Так, например, Дж. Бови и сотр. [55, 56] была установлена первичная структура десятков новых пептидов, выделенных из кожи различных видов земноводных. Авторы использовали тандемную масс-спектрометрию в условиях ионизации электрораспылением, ДАС, с анализаторами ионов QTOF и ионной ловушкой. Характерные масс-спектры представлены нарис. 1.6.
Лизин и глутамин различали путем ферментативного расщепления исходного пептида пептидазой Lys-C. Данный фермент гидролизует пептидную связь лизина с С-конца. Таким образом, если обработка ферментом приводит к образованию фрагмента, соответствующего разрыву после сомнительного остатка Lys/Gln, — это лизин, в противном случае — глутамин. Образование фрагмента легко детектировать масс-спектрометрически по вычисленной массе, если последовательность установлена из спектров, подобных представленным на рис. 1.6. Различить аминокислотные остатки лейцина и изолейцина авторам удалось только при использовании деградации по Эдману. Установленные таким образом аминокислотные последовательности приведены в обзоре [55].
Установление общего пептидного профиля
Для записи ВЭЖХ хроматограммы мы использовали колонку с носителем Cis и режим градиентного элюирования. В большинстве литературных источников для этих целей применяли крупнопористую (300 А) колонку 250x4,6мм и сконцентрированный до 1 мл секрет, полученный от 1 особи, разделяли за один хроматографический эксперимент [109, ПО, 162, 163]. Стандартная скорость потока при этом составляла 1 мл/мин при градиенте ацетонитрила от 10% до 70% в течение 30-40 минут.
Наши эксперименты показали, что такие условия хроматографирования сложной смеси пептидов не являются оптимальными: пики элюируемых компонентов имеют негауссову форму и сильно перекрываются. Для снижения перекрывания пиков мы изменили условия хроматографирования следующим образом. Во-первых, мы использовали меньшую загрузку колонки в каждом эксперименте: лишь 1/10-1/20 часть секрета (в зависимости от вида амфибии), выделенного одной особью, в противном случае колонка оказывалась перегруженной. При такой величине закола удовлетворительные результаты разделения хроматографических пиков были достигнуты при использовании более коротких и узких колонок: 150x4 мм. Во-вторых, поскольку максимальная молекулярная масса разделяемых пептидов в наших экспериментах не превышала 5000 Да, рекомендуемая величина пор в 300 А в носителе Ci8 является явно избыточной. Мы использовали колонку с меньшим диаметром пор: НО А - это улучшило форму хроматографических пиков. В-третьих, более полного разделения удалось достичь, применяя медленнорастущий градиент (1% ацетонитрила в минуту). И, наконец, в-четвертых, меньшие скорости потока элюента также способствовали более полному разделению компонентов смеси. Нами были протестированы скорости потоков в 1, 0.8, 0.7 и 0.5 мл/мин. Оптимальный результат элюирования достигался при 0.8 мл/мин.
Таким образом, оптимизированные нами параметры хроматографического разделения значительно отличаются от литературных. Их применение позволило более полно разделить кожные секреты, хотя и потребовало дополнительного времени (последовательные заколы небольших порций пептидной смеси).
Среди достоинств масс-спектра МАЛДИ в режиме регистрации отрицательных ионов следует отметить, что он содержит больше сигналов пептидов в виде ионов [М-Н] и не осложнен сателлитными пиками [M+Na]+ и [М+К]+ , которые всегда присутствуют наряду с [М+Н]+ в спектре МАЛДИ положительных ионов. Помимо этого, спектр МАЛДИ отрицательных ионов характеризуется значительно большими величинами отношения сигнал/шум, чем в случае регистрации положительных ионов.
Вид спектра МАЛДИ кожного секрета амфибий положительных ионов существенно зависит от загрязненности образца и используемой матрицы. Для выявления оптимальных условий МАЛДИ-профилирования мы исследовали зависимость относительной величины пиков мажорных компонентов секрета R.ridibunda от внесения в матрицу органических добавок. Такие добавки рассматриваются как модификаторы используемых матриц, так и имитаторы загрязнений анализируемого образца.
Во всех проведенных экспериментах (рис. 2.3-2.8) добавление к образцу небольшого количества органических соединений самой разной природы вызывало увеличение интенсивности пиков молекулярных ионов пептидов. Теоретически возможно несколько механизмов, позволяющих объяснить действие добавок. Во-первых, введенная добавка может выступать в роли инициатора ионизации, поглощая лазерное излучение и передавая его молекулам исследуемого вещества. В рамках этой части исследования было изучено влияние добавок N-фенилмалеинимида и йодацетамида на интенсивность пиков спектра, а также измерено УФ-поглощение их растворов при рабочей длине волны лазера (337 нм).
Во-вторых, сама мишень для МАЛДИ может быть источником фотоэлектронов [166, 167], которые играют важную роль в процессах образования как положительных, так и отрицательных ионов [168]. Высокая концентрация фотоэлектронов приводит к возникновению отрицательно заряженных ионов матрицы, нейтрализующих положительно заряженные ионы в «облаке» МАЛДИ, в том числе и ионы исследуемого вещества. Добавка может выступать как ловушка фотоэлектронов или отрицательных ионов матрицы, тем самым уменьшая процессы рекомбинации ионов и увеличивая сигнал образца. Так, при добавлении к матрице СиСЬ, ионы Си2+ легко восстанавливаются под действием электронов до Си+, усиливая интенсивность выходящих сигналов [169]. Для проверки этой гипотезы в нашем эксперименте в качестве добавок были взяты нафталин — вещество, способное к захвату электронов или нейтрализации отрицательных зарядов, и, напротив, октадекан — инертное вещество. В-третьих, добавка может усиливать гидрофобность молекулы исследуемого вещества, что приводит к увеличению сигнала [170]. В данной работе тестировалась добавка октадекана: соединения совершенно инертного, гидрофобного, с высоким потенциалом ионизации, не способного образовывать водородные связи и вступать в какие-либо реакции в условиях эксперимента. В-четвертых, протонирующая добавка может вызвать увеличение выхода протонированных молекул пептида. Для проверки этого эффекта мы протестировали серию соединений разной кислотности (от щавелевой кислоты до октадекана). Наконец, в-пятых, внесение добавки может способствовать большей гомогенности образующихся кристаллов или улучшать растворимость анализируемого вещества в кристаллах матрицы.
Известно, что для НССА характерно образование мелких однородных кристаллов. Для любой матрицы использование легколетучего растворителя (например, метанола) позволяет добиться уменьшения размеров кристаллов. Исходя из вышесказанного, было решено исследовать действие добавок к обеим матрицам — DHB и НССА, а также изучить влияние двух растворителей: медленносохнущего — смеси ацетонитрил/вода и быстросохнущего — метанола.
И йодацетамид, и N-фенилмалеинимид, добавленные к DHB (ацетонитрил/вода/TFA), привели к существенному увеличению сигнала в спектре МАЛДИ. На приведенных спектрах (рис. 2.3) отчетливо видно увеличение сигнала в 2-5 раз в зависимости от конкретного пептида и количества примеси (пептиды с М.м. 1060 Да, 1073 Да).
Результаты МС-секвенирования пептидов, полученные прямым распылением образцов в источник ионов
Часть пептидов была секвенирована при использовании прямого ввода образцов в источник ионов. Предварительно разделенные ВЭЖХ фракции были введены с помощью шприца в капилляр, соединенный с иглой источника электрораспыления. Как правило, фракции содержали 1-3 интенсивных пика, соответствующих ионам мажорных пептидов данной фракции. При получении спектров положительных ионов пептидов были использованы два типа приборов: квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр гибридной геометрии QTOF и ионная ловушка в стыковке с ячейкой ИЦР (LTQ-FT).
Ион с m/z 3348 Да открывает .у-серию при потере 170 Да (Gly+Leu/Ile) из МН , ион с m/z 171 Да - А-серию и представляет собой Ь ион со структурой [Gly+Leu/Ile]+. Обе серии достаточно интенсивны, причем 6-серия длиннее, чем .у (25 и 17 ионов соответственно). Отсутствие Пионов тяжелее Ьіі ид -ионов легче у7 находится в полном соответствии с данными масс-спектра отрицательных ионов (табл. 2.3) и объясняется наличием в структуре пептида дисульфидного цикла. S-S связь, образующая этот цикл, препятствует фрагментации внутри него.
В данной записи разделители характеризуют разрыв, причем й-ионы обозначаются знаком I, символизируя сохранение заряда HaN-конце, ау-ионы -символом I , указывая на сохранение заряда на С-конце. Скобки (G I/L) обозначают неидентифицированное взаиморасположение аминокислот. Учитывая, что именно разрыв - вне зависимости от того, соответствует ли он «6-, -серии или им обеим - позволяет идентифицировать аминокислоту в последовательности, вышеприведенную запись разрывов можно изобразить в кратком виде: (G-I/L)I/L-I/L-D-K/Q-I/L-K/Q-NFA-K/QAG-K/Q-GV-I/L-K/Q-S-I/L-I/L-NTAS-C—С-ОН. Поскольку молекулярные массы изомерных Leu/Ile идентичны (113.08 Да), в приведенном сиквенсе данные аминокислоты не отнесены (указаны оба варианта через косую черту). Аналогично молекулярные массы изобарных Lys/Gln (Lys (К), 128.09 Да, Gin (Q), 128.06 Да) очень близки и не разрешаются на масс-спектрометре с времяпролетным анализатором. Поэтому вновь приведены оба варианта через косую черту: K/Q.
В спектре отсутствуют пики с m/z ниже 750 Да (эффект «срезания» низких масс, п. 2.1 гл. 1). Но благодаря высокому разрешению LTQ-FT удалось отнести Lys/Gln (Lys6,8,12,16 и Gln20), что продемонстрировало необходимость использования комплексного подхода при de novo секвенирования пептидов. Сумма данных, полученных при записи спектров на обоих приборах, позволила с точностью до I/L установить последовательность вплоть до дисульфидного цикла, за исключением положения первых 2 аминокислот.
Выбор методики карбоксамидометилирования основан на доступности реагентов и универсальности процедуры. Выбор буфера и алкилирующего агента также связан с их водорастворимостью, поскольку такая модификация пептида перед введением в электроспрей требует предварительной очистки образца от избытка дериватизующих реагентов на обращенной фазе С\% с применением ZipTip. Данный метод очистки основан на сорбции пептидного материала на носителе, помещенном в наконечник автоматической пипетки. Пептидный материал, имеющий большее сродство к сорбенту, остается на сорбенте после его промывки полярным раствором (обычно 0.1%-ный водный раствор ТФУ). Адсорбированные пептиды затем смывают неполярной фазой (например, 50%-ным ацетонитрилом). Очевидно, что полярность реагентов (и их растворимость в воде) снижает их сорбцию на носителе Cig и облегчает отделение целевого пептида от примесей.
К сожалению, как любая очистка, использование ZipTip приводит к частичной потере материала и, зачастую, невозможности идентификации минорных компонентов. В качестве примера на рис. 2.12 изображена хроматограмма одной и той же фракции в исходном виде и после дериватизации. Бедность хроматограммы очищенной карбоксамидометилированной фракции по сравнению с исходной не вызывает сомнений:
Альтернативой для раскрытия дисульфидного цикла в пептидах является их окисление надмуравьиной кислотой (схема 1.11). Для проведения реакции мы использовали описанную в литературе обработку пептидных фракций избытком свежеприготовленной надмуравьиной кислоты при 0С, после чего образцы лиофилизовывали. С точки зрения пробоподготовки окисление обладает рядом преимуществ по сравнению с восстановлением-алкилированием, а именно: 1) одностадийный процесс; 2) одинаковые условия проведения реакции для любых полипептидов и 3) не требуется очистка пробы, так как реагент удаляется при лиофилизации образца. Этот известный прием разрыва дисульфидных связей был нами впервые применен к пептидам из семейства Rana, содержащим С-терминальный цикл.
Особенностью окисления является превращение тиольной группы цистеина в сильнокислую сульфогруппу. Кислый протон группы -SO3H может внутримолекулярно протонировать основные аминокислоты пептида (аргинин, лизин, гистидин), образуя цвиттер-ион. В результате дополнительного протонирования молекулы в источнике электрораспыления образуются мультизарядные ионы, менее стабильные, чем ионы меньшей зарядности. По мнению многих авторов, это приводит к их неуправляемой фрагментации и скрамблингу еще в источнике до достижения детектора [174]. В результате спектры окисленных пептидов, полученных при электрораспылении, были описаны лишь для малого числа коротких синтетических пептидов [175]. Есть также сведения о неудачных попытках получить такие спектры для природных полипептидов [174,176].
Уменьшая напряжение на капилляре в источнике электрораспыления, нам удалось зафиксировать молекулярные ионы пяти предварительно окисленных пептидов (М.м. 1810, 1874, 2675, 2636 и 3516 Да). Энергия активации фрагментации этих пептидов была ниже по сравнению с карбоксамидометилированными аналогами в 2-4 раза и составляла 1—15 эВ, что свидетельствует о снижении стабильности ионов окисленных пептидов в электроспрее. Спектр МС1 уже содержал множество пиков фрагментных ионов. Спектр МС пептида с М.м. 2636 Да записать не удалось. В то же время для четырех других пептидов были получены информативные спектры МС/МС.
