Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор. Тритерпеновые вещества настоящих видов солодок. Синтетические трансформации глицирретовой кислоты и родственных тритерпеноидов как путь к получению новых биологически активных веществ 7
1.1. Тритерпеновые вещества настоящих видов солодок 7
1.1.1. Строение и выделение глицирретовой кислоты 8
1.1.2. Минорные тритерпеноиды настоящих видов солодок 8
1.2. Синтетические трансформации глицирретовой кислоты и родственных тритерпеноидов как путь к получению новых биологически активных веществ 23
1.2.1. Трансформации тритерпеноидов с сохранением пентациклического скелета 23
1.2.2. Трансформации тритерпеноидов с изменением углеродного скелета 30
1.2.2.1. Трансформации в кольце А 30
1.2.2.2. Трансформации в кольце С. Восстановление и окисление 37
1.4. Биологическая активность глицирретовой кислоты и ее производных. Лекарственные препараты 40
ГЛАВА 2. Обсуждение результатов 46
2.1. Выделение тритерпеноидов из корней солодки уральской сибирских популяций 46
2.2. Синтетические трансформации тритерпеноидов 49
2.2.1. Исходные тритерпеноиды 50
2.2.2. Окислительные превращения тритерпеноидов солодки 52
2.2.2.1. Озонолиз 11-дезоксо-глицирретовой кислоты и ее производных 52
2.2.2.2 Окисление производных 11-дезоксо-ГЛК мета-хлорпербензойной кислотой 56
2.2.3 Скелетные превращения тритерпеноидов 60
2.2.3.1. Бекмановская перегруппировка кетоксимов 60
2.2.3.2. Синтез и превращения А-циклопентановых производных 11-дезоксо- ГЛК 65
2.2.3.3. Спектры ЯМР Ни 13С А-циклопентановых производных 11-дезоксо-ГЛК 70
2.2.3.4. Окисление А-циклопентановых производных тритерпеноидов диметилдиоксираном 75
2.2.5. Гликозилирование тритерпеноидов перацетилированными сахарами при катализе SnCL 76
ГЛАВА 3. Биологическая и фармакологическая активность производных тритерпеноидов 85
3.1. Гепатопротекторная и антиоксидантная активность 85
3.1.1. Гепатопротекторная и антиоксидантная активность модельных тритерпеновых гликозидов in vitro 86
3.2. Гепатопротекторная активность 3-гидроксимина 11-дезоксо-глицирретовой кислоты in vivo 88
3.3. Противоязвенная активность 92
3.4. Анти-ВИЧ-1 активность 94
ГЛАВА 4. Экспериментальная часть 97
Выводы 129
Список литературы 130
Приложение 152
- Трансформации тритерпеноидов с сохранением пентациклического скелета
- Биологическая активность глицирретовой кислоты и ее производных. Лекарственные препараты
- Гликозилирование тритерпеноидов перацетилированными сахарами при катализе SnCL
- Гепатопротекторная активность 3-гидроксимина 11-дезоксо-глицирретовой кислоты in vivo
Введение к работе
Одним из экономически и социально важных направлений в области современной органической, биоорганической и медицинской химии является синтез новых биологически активных веществ медицинского назначения на основе низкомолекулярных вторичных растительных метаболитов. В мировой практике постоянно растет удельный вес и объем продаж лекарственных препаратов, полученных на основе растительных метаболитов и их производных, идет постоянный поиск новых источников их получения. Лидирующие природные соединения и их модификанты особенно интенсивно внедряются в области онкологии, инфекционных и метаболических заболеваний, играют важную роль в разработке антибактериальных, антигрибковых и противовирусных препаратов.
Весьма перспективным подходом для получения новых лидирующих соединений для медицины с потенцированными фармакологическими свойствами являются их синтетические трансформации и синтез аналогов (миметиков) с заданной биоактивностью.
Растительные тритерпеноиды (ТТ) и их гликозиды относятся к числу природных соединений, представляющих большую ценность для медицины вследствие высокой и разнообразной биологической активности и широкой распространенности в растительном мире. Развитие химии тритерпеноидов в последнее двадцатилетие привело к получению целого ряда уникальных биологически активных веществ, представляющих интерес для медицины в качестве лекарственных препаратов. Так, проходят клинические исследования новые антимеланомные и анти-ВИЧ средства, полученные на основе пентациклического тритерпеноида бетулиновой кислоты.
Уникальным свойством тритерпеновых веществ является их способность ингибировать вирусы на начальных стадиях репликативного цикла, в частности, стадии адсорбции вируса клетками и слияния. Подобные
соединения не оказывают влияния непосредственно на процессы кодирования и реализации генетической информации вирусов, не вызывают развития лекарственной резистентности, что выгодно отличает их от известных противовирусных препаратов нуклеозидной природы.
В последние годы все большее внимание уделяется развитию методологии синтеза производных тритерпеноидов с более глубоким изменением нативного скелета молекул, которые представляют интерес в плане получения аналогов новых структурных типов. Так, 2-циано-3,12-диоксо-олеан-1,9-диен-28-овая кислота представляет интерес для медицины в качестве препарата для лечения различных воспалительных заболеваний и противоопухолевого агента.
Неослабевающий интерес химиков-синтетиков и биологов к основным
тритерпеновым веществам корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) и (Gl.
uralensis Fisher) — глицирризиновой кислоте (ГК) и ее основному метаболиту
- глицирретовой кислоте (ГЛК) связан, прежде всего, с высокой и
разнообразной биологической и фармакологической активностью этих
природных соединений (противовоспалительной, противоязвенной,
гепатопротекторной, антиоксидантной, противовирусной,
противоопухолевой и др.) и легкостью выделения из растительного сырья. ГК и ГЛК являются, безусловно, ярким примером перспективности направленных химических трансформаций тритерпеноидов в интересах медицинской химии. Синтетические трансформации ГК и ГЛК послужили основой для получения ряда высокоактивных противовоспалительных, противоязвенных, иммуностимулирующих и противовирусных агентов. Динатриевая соль кислого сукцината ГЛК (карбеноксолон) длительно использовалась в Европе в качестве противоязвенного средства. На основе 18,19-дегидро-ГЛК разработана и внедрена в медицинскую практику мазевая композиция (глидеринин) для лечения аллергических заболеваний кожи, экзем и нейродермитов. Полусинтетическое производное ГК ниглизин
оказалось высокоактивным ингибитором ВИЧ-1 и мутантных форм ВИЧ, резистентных к применяемым в настоящее время в медицине нуклеозидным ингибиторам ВИЧ. Таким образом, проведение исследований в области поиска новых растительных источников для получения тритерпеноидов солодки и проведение их направленных синтетических трансформаций с целью получения новых биологически активных веществ для медицины является актуальной задачей.
В настоящей работе в качестве базовых структур для синтетических трансформаций были использованы ряд тритерпеновых кислот солодки и их производные, в качестве растительного сырья - корни солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisher) сибирских популяций.
Цель работы: Исследование тритерпеноидного состава экстракта корней солодки уральской сибирских популяций; синтез новых производных и аналогов тритерпеноидов солодки с измененным пентациклическим скелетом молекул.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
выделение и идентификация тритерпеноидов из экстракта корней дикорастущей солодки уральской (Новосибирская область);
скелетные трансформации (по кольцам А и С) и окислительные превращения минорных тритерпеноидов солодки;
разработка нового метода синтеза гликозилированных производных тритерпеноидов.
Трансформации тритерпеноидов с сохранением пентациклического скелета
Род солодка (Glycyrrhiza L) по анатомоморфологическим и химическим (по составу тритерпеновых веществ) особенностям поделен на две секции: настоящих и ложных солодок - Euglycyrrhiza Boiss и Pseudoglycyrrhiza (Regel), Kntg [1,2]. К первой отнесены солодка (с.) голая (Glycyrrhiza glabra L.), с. уральская (Gl. uralensis Fischer), с. Коржинского (Gl. Korshinskyi Grig), с. вздутая (Gl. inflata Batalin) и с. шиповатая (Gl. aspera Pall). К секции ложных солодок отнесены 10 видов: с. македонская (Gl. macedonica Boiss et Orph.), с. щетинистая (Gl. echinata L.), с. бледноцветковая (Gl. pallidiflora Maxim), дурнопахнущая (Gl. foetida Desf.), с. чешуйчатая (Gl. lepidota Nutt. Pursh.), с. чешуйковатая (Gl. squamullosa Franch.), с. иглоплодная (Gl. acanthocarpa Lindl.), с. астрагаловидная (Gl. astragalina Gill), с широкоплодная (Gl. eucarpa P.C.Li), с. тройчатолистная (Gl. triphylla Fisch. Et Mey Syn. Meristotropis xanthoides Vass) [2-5]. Корни этих видов солодок не содержат ГК [2]. Попытка обобщения и классификации обширного материала по химической структуре выделенных из солодок тритерпеновых соединений была сделана в ряде монографий и обзоров [5-14]. В настоящем обзоре мы обобщили данные по структурам тритерпеноидов настоящих видов солодок и рассмотрели синтетические трансформации тритерпеноидов с. в связи с их биологической активностью. 1.1. Тритерпеновые вещества настоящих видов солодок
Все виды настоящих солодок характеризуются наличием пентациклических тритерпеноидов /?-амиринового ряда, которые можно разделить на тритерпеновые кислоты, лактоны и спирты (табл. 1.1) [5]. Корни настоящих солодок содержат глицирризиновую кислоту (ГК) (1) тритерпеновый сапонин, который присутствует в корнях в виде кальциево-магниевой соли (глицирризина). Впервые ГК была выделена из корней солодки (с.) голой еще в начале XIX века [15]. Молекула ГК построена из агликона - 180Н- глицирретовой кислоты (ГЛК) (2) и двух молекул D-глюкуроновой кислоты (GluA), связанных с С -ОН агликона. 18Р-ГЛК (ГЛК) (2) была впервые получена Чирхом и Гедебергом [16] гидролизом ГК (1). Усилиями нескольких групп химиков во главе с Ружичкой [17-22] ГЛК была приписана структура 3(3-гидрокси-11-оксо-олеан-12-ен-30-овой кислоты (2). В настоящее время разработаны различные методы получения ГЛК из корней с. [23], экстракта с. [24], ГК и ее солей [25,26]. Для получения ГЛК широко применяется кислотный гидролиз ГК и ее солей минеральными кислотами [24-26]. Чаще всего ГЛК получают гидролизом ГК, ее калиевых или аммониевых солей 3-5% серной кислотой [27,28]. Предложен количественный вариант гидролиза ГК и ее солей 7% соляной кислотой [24].
Наряду с ГЛК из корней с. голой (Glycyrrhiza glabra L.), Битоном и Спрингом [29], была выделена также 18а-ГЛК (ураленовая кислота) (3) (табл 1.1) - один из минорных тритерпеноидов с. [30]. 18ос-ГЛК (3) была получена изомеризацией 183-ГЛК (цис D/E-изомер) путем нагревания 18(3-ГЛК с водными растворами кислот, щелочей или в органических растворителях [20,29]. Предложен метод получения 18а-ГЛК в виде метилового эфира путем обработки метанольным раствором НС1 с получением смеси 18р- и 18а-изомеров (1:1) [31].
К минорным компонентам корней с. голой и уральской {Gl. uralensis Fischer), относится также 24-окси-ГЛК (4), содержание которой в сумме тритерпеноидов составляет 1-2% [32,33]. 24-окси-ГЛК (4) была выделена также из с. Коржинского, где ее содержание может достигать 6% [34].
Из продуктов кислотного гидролиза суммы сапонинов с. голой были выделены в виде метиловых эфиров 18(3- и 18а-окси-ГЛК (глабриковая кислота) (5а, 6а) [29,35,36], 28-окси-ГЛК (7) [37], 18,19-дегидро-ГЛК (9) [38], 3-дегидро-ГЛК (11) [26] и ликвориковая кислота (12) [39] (табл. 1.1). Из корней с. уральской выделены также 3-оксо-ГЛК (8) [40,41] и З-О-ацетил-ГЛК (26) [29, 41]. В корнях Gl. uralensis китайских видов впервые была обнаружена 22р-ацетокси-ГЛК (10) (табл. 1.1) [33]. 11-дезоксо-ГЛК (16) обнаружена в корнях с. голой и уральской [26,38,42]. 24-окси-11-дезоксо-ГЛК (17) найдена в корнях с. голой [43,44]. Все эти тритерпеновые кислоты относятся к типу олеан-12-ена и имеют р-конфигурацию С ООН группы. Из корней Gl. glabra и Gl. uralensis выделена 3(3-гидрокси-олеан-11,13(18)-диен-30-овая кислота (24) [35] и ее метиловый эфир (24а) (табл. 1.1) [45-47].
Значительное количество выделенных из настоящих солодок и охарактеризованных тритерпеновых кислот являются С29ООН кислотами. Так, при метанолизе сапонинов корней с. голой и уральской был получен метиловый эфир глабровой кислоты (14а) (табл. 1.1), содержание которой в корнях с. уральской не превышает 1% [48]. В корнях с. голой была найдена также 11-дезоксо-глабровая кислота (18) [20,48]. Из корней Gl. glabra, Gl. uralensis и Gl. inflata выделена изомерная по карбоксильной группе 18р-ГЛК (С29-СООН) ликвиритиновая кислота (13) (табл. 1.1) [32,49,50]. 24-окси-ликвиритиновая кислота (15) является минорным тритерпеноидом корней с. уральской, а ликвиридиоловая кислота (19), являющаяся ее 11-дезоксо-аналогом, входит в состав суммы тритерпеноидов с. голой [51]. С. юннаньская из Китая, которую относят к разновидности с. уральской, продуцирует тритерпеновые кислоты типа олеан-12-ена - глиюннан сапогенины А (20), В (21), С (22) (табл. 1.1) [52,53]. Глиюннан сапогенину Е была приписана структура Зр,21а,24-тригидрокси-олеан-11,13(18)-диен-29-овой кислоты (23) (табл. 1.1) [53].
Биологическая активность глицирретовой кислоты и ее производных. Лекарственные препараты
ГЛК и ее производные представляют интерес в качестве лекарственных средств, обладающих ПВ, ранозаживляющим, ПЯ действием. ПВ активность ГЛК была открыта в 1958 г., на основе 18 р-ГЛК был разработан препарат эноксолон (местное ПВ средство) [95-98]. Производные ГЛК часто обладают более высокой ПВ активностью, чем нативный тритерпеноид. Примером тому может являться полусинтетическое производное ГЛК - динатриевая соль кислого сукцината ГЛК и созданный на его основе препарат натрий карбеноксолон (132), ПВ активность которого в 3 раза выше чем у ГЛК [99-101]. ПВ активность ряда липофильных эфиров ГЛК также в 2-3 раза выше, чем у ГЛК [102].
ГЛК и ряд ее производных обладают выраженным антиэкссудативным и противоартритным действием и по некоторым видам ПВ активности превосходят эффекты бруфена и гидрокортизона [103], причем ПВ активность ГЛК выше, чем у ГК [104]. Высокую ПВ активность на различных моделях воспаления показали также динатриевые соли дигемифталата ГЛК, деоксоглицирретола, 9(11),12-дион-33,30-диола и 11,13(18)-диен-Зр,30-диола [105,106].
18р-дегидро-ГЛК — действующее вещество препарата глидеринин, обладает высокой ПВ активностью и по способности подавлять воспаления, вызванные различными агентами, а также по влиянию на экссудативную и пролиферативную фазы воспаления, превосходят гидрокортизон и амидопирин [107]. На основе натриевой соли 18-дегидро-ГЛК, которая превосходит глидеринин по ПВ активности в 1,5-2 раза, разработана новая фармацевтическая полимерная композиция «Полиглидин», обладающая пролонгированным противовоспалительным действием. Разработан состав и предложена технология ректальных суппозиториев с глидеринином -препарат Лакразол.
ПВ активность производных ГЛК, содержащих фрагменты аминокислот зависит от вида аминокислотного остатка и длины углеродной цепи. Высокая ПВ активность в формалиновом тесте найдена у производного ГЛК, содержащего фрагмент D,L - метионина, которое превосходит эффект ортофена в лечебной дозе [80]. Высокая ПВ активность ГЛК сочетается с выраженным ПЯ действием, обусловленным усилением синтеза нуклеиновых кислот в слизистой оболочке желудка [108]. Так, аммонийная соль ГЛК ускоряет процесс регенерации при язве желудка и обширных ожогах тела, а глидеринин уменьшает степень изъязвления дуоденальной области желудка в 4-5 раз и превосходит по защитному эффекту метилурацил - известный стимулятор репаративных процессов. Одним из лучших средств для лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки на протяжении многих лет до появления антагонистов Н2-рецепторов гистамина считался препарат карбеноксолон (Duogastrone) [109-111]. Карбеноксолон был первым лекарством, способным быстро заживлять пептические язвы, и интенсивно использовался при лечении пептических язв желудка [112,113]. ПЯ активностью, аналогичной действию карбеноксолона, обладают метиловые эфиры гемисукцината 18а-ГЛК и гемифталата ГЛК в дозе 50 мг/кг [68]. В качестве ПЯ средств предложены также амиды и пептиды глицирретовых кислот [80].
ГЛК и ее соединения эффективны при лечении аллергических состояний и перспективны в терапии воспалительных заболеваний кожи, экзем различной этиологии, псориаза, аллергических дерматитов [114]. Так, ГЛК (40 мг/кг) в течение 28 дней снимает аллергическое воспаление кожи морских свинок аналогично преднизолону (10мг/кг) [115,116]. Кроме того, ГЛК и ее производные подавляют образование 5-липоксигеназы-фермента, участвующего в биосинтезе лейкотриенов, определяющих развитие воспаления и медленно текущей анафилаксии. Наиболее высокий эффект ингибирования отмечен у натриевой соли олеан-12-ен-3/?,30-ди-О-гемифталата [63].
Мази, содержащие в качестве активного вещества ГЛК, уменьшают воспаление и стимулируют заживление кожных ран при пересадке кожи [117]. На основе натриевой соли 18-дегидро-ГЛК разработана новая лекарственная форма - мазь «Глинатин 2%», на которую получено разрешение Фармкомитета МЗ Республики Казахстан на применение ее в медицинской практике в качестве дерматологического средства [103].
Официальным препаратом, разработанным в Пятигорском фармацевтическом институте, является глицирренат натрия (Глициренат), предложенный для лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, трихомонадных, урогенитальных и гинекологических заболеваний [118]. Препарат обладает выраженной антимикробной активностью в частности относительно золотистого стафилококка и туберкулезных микобактерий in vitro [119]. ГЛК также активна в отношении тест-микробов стафилококковой, кишечной и спорообразующей групп [120]. Сульфонамидные производные ГЛК обладают антибактериальной активностью в отношении грамм-положительных бактерий {Staphylococcus aureus, Bacillus antherasis, Crynibacteria bovis) и грамм-отрицательных бактерий {Klebsiella phemonie, Proteus vulgaris, Esheria со її) [121]. ГЛК и натриевая соль ГЛК проявляют гиполипидемическую и антиатеросклеротическую активности, уменьшают содержание холестерола в тканях печени, увеличивают свертываемость крови [122-124]. Выявлены мощные гиполипидемические свойства у ацетата ГЛК, и 3-амино-ГЛК у животных с экспериментальным атеросклерозом [125]. Гиполипидемическая и антиатерокслеротическая активность производных ГЛК выше, чем у официальных препаратов-полиспонина и мисклерона, а 18- дегдро-ГЛК представляет интерес в качестве потенциального противоатеросклеротического препарата [126].
Гликозилирование тритерпеноидов перацетилированными сахарами при катализе SnCL
Хорошо известным стерео- и региоселективным окислителем является диметилдиоксиран (DMD), позволяющий окислять вторичные спиртовые группы и эпоксидировать двойные связи [184]. В последние годы DMD стал успешно применяться для окислительных превращений высших терпеноидов и стероидов [184,185].
Мы провели окисление 3-изопропилиден-А-нео-5аН-олеан-12-ен-30-овой кислоты (31) и А-нео-3,12-диен-3-(2-изопропильного)-производного (32) DMD в смеси ацетона-хлористого метилена (1:1) при 20-22 С. Продукты окисления были выделены в гомогенном по ТСХ состоянии КХ на СГ, их строение установлено спектральными методами. Так, основным продуктом окисления 3-изопропилиденового производного (31) является А-нео-Зр,4р эпоксид (40) (выход 70,8%) (схема 2.8), в спектре ЯМР ,3С которого исчезают сигналы олефиновых атомов СЗ и С4, но появляются сигналы атомов углерода эпоксидного цикла при 77,2 (СЗ-О) и 57,9 (С4-0) м.д.
Экспериментальные спектры ЯМР Ни С эпоксида (40) совпали с расчетными спектрами для данной структуры, таким образом, мы предполагаем р-конфигурацию эпоксидного цикла. Двойная связь С12=С13 в кольце С остается неизменной вследствие стерической затрудненности, о чем говорит сохранение ХС атомов С12 (122,3 м.д.) и С13 (144,5 м.д.) в спектре ЯМР 13С.
Окисление соединения (32) DMD в аналогичных условиях также привело к А-нео-Зр,5р эпоксиду (41) с выходом 77%, отличающемуся от образца За,5а-эпоксида (36), полученного парциальным озонолизом, по ТСХ и спектрам ЯМР !Н и 13С. В спектре ЯМР 13С сигналы СЗ и С5 (5) данного эпоксида присутствуют в более слабом поле ( 77,7 и 78,8 м.д.). Тритерпеновые гликозиды (сапонины) входят в состав биоактивных компонентов многих лекарственных и пищевых растений, обуславливают фармакологические свойства большинства фитопрепаратов и средств народной медицины. Природные тритерпеновые гликозиды обладают высокой и разнообразной биологической активностью (противовоспалительной, противоопухолевой, противогрибковой, гемолитической, моллюскоцидной, цитотоксической, противовирусной, антиоксидантной, гепатопротекторной и др.) [9, 186]. Как известно, природные сапонины являются сложными полифункциональными молекулами, состоящими из агликонов или сапогенинов (генинов) различной структуры и углеводной цепи, содержащей иногда до 10-12 моносахаридных звеньев [9]. Синтез тритерпеновых О-гликозидов, моделирующих различные природные сапонины, в частности, гликозиды лекарственных растений (Glycyrrhiza, Panax, Buplenrum spp. etc.), представляет интерес как с точки зрения получения новых аналогов биоактивных природных соединений, так и с точки зрения изучения особенностей гликозилирования сложных полифункциональных природных сапогенинов [187-189]. Известно, что гликозилирование усиливает биодоступность природных соединений и синтетические тритерпеновые гликозиды можно рассматривать как пролекарства. Поэтому разработка новых эффективных методов гликозилирования сложных полифункциональных природных соединений, пригодных для получения аналогов природных гликозидов, является одной из актуальных проблем современного гликозидного синтеза. С целью изучения зависимости структура-активность осуществлен синтез различных гликозидов ГЛК и ее модифицированных аналогов, а также гликозидов, по структуре близких к гликозидам солодки [190-192].
В литературе описаны примеры реакций гликозилирования простых спиртов и фенолов перацетатами моносахаридов с образованием 1,2-цис- или -транс-гликозидов в присутствии таких кислот Льюиса, как FeCl3, CF3S03Ag, ZnCl2, SnCl4, SnCl4-AgC104 [193-195].
Продолжая наши исследования по синтезу З-О-гликозидов -модифицированных аналогов ГК, представляющих интерес в качестве моделей для изучения молекулярных механизмов биологической активности гликозидов и зависимости структура-активность [196], мы провели гликозилирование 180- и 18,19-дегидро-ГЛК в виде их метиловых эфиров (2а, 9а) легко доступными гликозильными донорами (ГД) - пента-О-ацетатами P-D-галакто- и -глюкопираноз с использованием в качестве активатора (АК) легко доступной кислоты Льюиса - SnCU, широко используемой в синтезе N-гликозидов (нуклеозидов).
Условия реакции гликозилирования были оптимизированы на примере реакций метилового эфира 180-ГЛК (МеГЛК) (2а) и 18,19-дегидро-ГЛК (9а) с пента-О-ацетатом P-D-галактопиранозы (схема 2.9). Для подбора оптимальных условий проведения реакции гликозилирования варьировались соотношения тритерпеноидов (ТТ), ГД и АК, температурный режим и время реакции. Результаты проведенных опытов представлены в табл. 2.4. Схема 2. СООМе
Гликозилирование МеГЛК (2а) проводили в смеси ацетонитрила -дихлорэтана (ДХЭ) в интервале температур от -20 С до 20 С. Как видно из данных табл. 2.4, при проведении реакции гликозилирования при -20-»-10 С (2 ч) с использованием 6 ммоль SnCU образовывалась смесь а- и /?-галактопиранозидов (42) и (43) с общим выходом 24,5% с соотношением а//?-аномеров 6:1. Смесь гликозидов была разделена КХ на СГ. В качестве побочного продукта реакции получены незначительные количества З-О-ацетата МеГЛК (За) (схема 2.9). Увеличение количества АК и времени реакции в данном интервале температур до 8 ч не привели к существенному увеличению выхода гликозидов и соотношение аномеров сохранилось (табл.2.4).
Гликозилирование МеГЛК (2 а) при соотношении реагентов ГД/МеГЛК/АК = 2,5:2:12 ммоль в присутствии молекулярных сит 4А при -15— 20 С привело к увеличению выхода гликозидной фракции (74,2%), причем выход /?-аномера (43) тоже увеличился (соотношение а//?=1:2) (табл.2.4). Однако, реакция сопровождалась изомеризацией образующегося 3-0-/МЗ-галактопиранозида МеГЛК (43) в 18«-стереоизомер (44) под действием кислоты Льюиса и выделяющийся в ходе реакции НС1, что было подтверждено спектром ЯМР С, в котором наблюдается сигнал 8 124,2 м.д., принадлежащий 18а-ГЛК [78] (соотношение 18/?- к 18а-изомеру составило 3:1 по данным ЯМР). Разделить 18/?- и 18а- стереоизомерные гликозиды (43) и (44) флеш-хроматографией не удалось.
Гепатопротекторная активность 3-гидроксимина 11-дезоксо-глицирретовой кислоты in vivo
Высокий уровень заболеваемости населения вирусными гепатитами, многообразие токсических, лекарственных и аллергических поражений органов гепатобилиарной системы не имеют эффективных методов лечения. Поэтому поиск и изучение новых препаратов для лечения и профилактики заболеваний печени и желчевыводящих путей является актуальной проблемой.
В патологически измененной печени можно интенсивно стимулировать пролиферацию гепатоцитов и их ультраструктуру с помощью биологически активных веществ. Гепатозащитные средства предназначены для нормализации функции и метаболизма печени при ее поражениях, ускорения регенерации и восстановления функциональной активности гепатоцитов. Они находят применение для патогенетической терапии острых, хронических гепатитов, цирроза печени и жирового гепатоза токсической, лекарственной и алкогольной этиологии. Фармакологическое действие гепатопротекторов обусловлено собственным антиоксидантным эффектом и потенцированием эндогенных антиоксидантных систем гепатоцитов, ингибированием фосфолиполиза с уменьшением продукции лизофосфатидов и восстановлением нормального спектра фосфолипидов мембран, улучшением депонирования ионов Са2+, а также улучшением тамриксной „и барьерной функций цитолеммы, мембран митохондрий, эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и лизосом.
Хорошо известно, что экстракт солодкового корня обладает гепатозащитным действием, а потребление корней с. или ее продуктов приводит к восстановлению биохимических показателей больной печени [133]. Гепатопротективные свойства экстрактов с. голой и уральской обусловлены ее основными компонентами — ГК и ГЛК, которые обладают выраженной гепатопротекторной активностью. ГК и ГЛК защищают гепатоциты печени от токсического воздействия таких известных гепатотоксикантов как тетрахлорметан и D-галактозамин, причем гепатопротекторный эффект ГЛК намного выше, чем у ГК [13, 177, 198]. ГЛК обладает гепатопротективным действием как при оральном, так и внутрибрюшинном введении [133]. Предварительное введение ГЛК (10-100 мг/кг) мышам при ССЦ - гепатите приводит к ингибированию выделения сывороточных аланинаминотрансфераз (АЛТ) и аспартатаминотрансфераз (ACT) и образованию липидных пероксидов в дозозависимой форме [134]. Показано, что гепатопротекторное действие ГЛК при тетрахлорметановом гепатите обусловлено способностью ГЛК блокировать биоактивацию CCU путем ингибирования экспрессии и активности цитохрома Р450 2Е1 и его антирадикальной активностью, что было продемонстрировано в опытах in vitro и in vivo (на мышах) [134].
Изучены гепатопротекторные и антиоксидантные свойства модельных тритерпеновых Р-гликозидов (48-50) в культуре гепатоцитов человека HepG2 на модели острого гепатита, который вызывали 10% этанолом3. Клетки HepG2 (105 клеток/мл) обрабатывали исследуемыми соединениями в концентрации 10 мкмоль/л в течение 24 ч при 37 С, затем 10% этанолом в течение 6 ч. Контрольная группа оставалась интактной. Проводили оценку гибели клеток (выживаемость клеток), проницаемости мембран (измерение концентрации лактатдегидрогеназы), окислительных поражений (содержание малонилдиальдегида, глутатиона, глутатион пероксидазы) и воспалительных поражений гепатоцитов путем измерения концентрации белка - фактора некроза опухолей (tumor necrosis factor-a, TNF-a).
Выживаемость клеток оценивали с помощью теста, основанного на использовании 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ-метод). Для этого клетки HepG2 инкубировали с 0,25 мг МТТ/мл в течение 3 ч при 37 С и определяли интенсивность поглощения при 570 нм с помощью прибора Hercules (Bio-Rad Lab, СА, USA). Количество живых клеток оценивали в процентах по отношению к группе гепатоцитов без добавления испытуемых соединений и этанола.
Гепатозащитные свойства соединений изучали путем измерения количества лактат дегидрогеназы (LDH-метод) в среде колориметрическим методом [прибор Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA]. Концентрации глутатиона (нг/мг белка) и активности глутатион пероксидазы (GP) (ед/мг белка) в культуре клеток определяли следующим образом: после обработки этанолом клетки промывали дважды раствором фосфатного буфера в физиологическом растворе натрия хлорида (рН 7,2) (физиологический раствор), извлекали из пластинок и гомогенизировали в 20 мМ растворе фосфатного буфера в физиологическом растворе, содержащем 0,5 мМ бутилокситолуола. Гомогенат центрифугировали и супернатант использовали для анализов. Уменьшение концентрации глутатиона (нг/мг белка) определяли колориметрическим методом (прибор OxisResearch, Portland, OR, USA). Активность глутатион пероксидазы (ед/мг белка) в клетках HepG2 определяли на приборе EMD Biosciences, San Diego, СА, USA.