Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Вводная часть 7
1.2. Жизненные циклы скребней 8
1.3. Морфология покровов скребней 8
1.4. Взаимоотношения скребней с окончательными хозяевами .14
1.5. Взаимоотношения скребней с промежуточными хозяевами .21
1.6. Взаимоотношения скребней с паратеническими хозяевами 30
Глава 2. Материалы и методика 37
2.1. Материал из естественных паратенических хозяев 37
2.2. Методика свето-микроскопических исследований .39
2.3. Методика электронно-микроскопических исследований .40
2.4. Методика экспериментов по заражению скребнем Corynosoma strumosum естественного (толстощек Миддендорфа Hadropareia middendorffii) и неестественных (хромис-красавец Hemichromis bimaculatus и прыткая ящерица Lacerta agilis) паратенических хозяев 42
2.4.1. Эксперимент по заражению толстощека Миддендорфа 42
2.4.2. Эксперимент по заражению хромиса-красавца .45
2.4.3. Эксперимент по заражению прыткой ящерицы 46
Глава 3. Сведения о жизненном цикле скребня Corynosoma strumosum .47
Глава 4. Результаты исследований 48
4.1. Морфология покровов скребня Corynosoma strumosum .48
4.1.1. Световая микроскопия .48
4.1.2. Электронная микроскопия .50
4.2. Морфология капсулы, окружающей скребня Corynosoma strumosum в паратенических хозяевах разных видов 53
4.2.1. Тихоокеанская зубастая корюшка 53
4.2.2. Обыкновенная малоротая корюшка 60
4.2.3. Тихоокеанская навага 62
4.2.4. Пятнистый терпуг .66
4.2.5. Керчак Стеллера .69
4.2.6. Желтоперая камбала 75
4.2.7. Толстощек Миддендорфа .83
4.3. Экспериментальное исследование процесса капсулообразования вокруг скребня Corynosoma strumosum в естественном паратеническом хозяине – толстощеке Миддендорфа 90
4.4. Экспериментальное исследование процесса капсулообразования вокруг скребня Corynosoma strumosum в неестественных паратенических хозяевах .99
4.4.1. Хромис-красавец 99
4.4.2. Прыткая ящерица .104
Глава 5. Обсуждение полученных данных .114
5.1. Анализ морфологии покровных тканей скребня Corynosoma strumosum в естественных паратенических хозяевах 114
5.2. Сравнительный анализ морфологии капсулы вокруг скребней Corynosoma strumosum в естественных паратенических хозяевах 118
5.2.1. Общая характеристика капсул .118
5.2.2. Характеристика клеточного состава капсул .122
5.2.3. Строение «фибробластической» капсулы 123
5.2.4. Строение «лейкоцитарной» капсулы 124
5.2.5. Строение «промежуточной» капсулы 132
5.3. Особенности инкапсуляции скребня Corynosoma strumosum в естественном паратеническом хозяине – толстощеке Миддендорфа 132
5.4. Сравнительный анализ морфологии капсулы вокруг Corynosoma strumosum из неестественных паратенических хозяев 141
5.4.1. Особенности инкапсуляции скребня Corynosoma strumosum в хромисе-красавце .141
5.4.2. Особенности инкапсуляции скребня Corynosoma strumosum в прыткой ящерице 145 Выводы .149
Список литературы
- Взаимоотношения скребней с окончательными хозяевами
- Методика электронно-микроскопических исследований
- Морфология капсулы, окружающей скребня Corynosoma strumosum в паратенических хозяевах разных видов
- Сравнительный анализ морфологии капсулы вокруг скребней Corynosoma strumosum в естественных паратенических хозяевах
Введение к работе
Актуальность темы. Паратенический (резервуарный) паразитизм относится к числу распространенных явлений и свойственен многим группам паразитических животных (Шарпило, 2005). Сущность данного явления заключается в том, что инвазионные стадии многих паразитов, оказавшись в несвойственных им хозяевах, могут сохранять жизнеспособность и инвазионность достаточно долгий период времени, до попадания в окончательного хозяина (Шарпило, 2005). Открытие этого явления, его понимание связано с работами выдающихся ученых-гельминтологов ХХ столетия – Л. Сера, Ш. Жуайе, Ж. Бэра, Г. Витенберга, К.И. Скрябина, Р.С. Шульца, К.М. Рыжикова, В.А. Савинова и многих других. Многие исследователи отмечают, что паратенические хозяева, хотя и не являются обязательными для завершения онтогенетического развития того или иного паразита, тем не менее, играют серьезную роль в его сохранении, накоплении и распространении.
Представители типа Acanthocephales (Rudolphi, 1808) Skrjabin et Schulz, 1931 относятся к числу таких животных, для которых паратенический паразитизм характерен едва ли не в наибольшей степени (Петроченко, 1958; Schmidt, 1985). В разных группах скребней он представлен с разной степенью встречаемости, в целом же, по некоторым данным, он отмечен в большинстве отрядов, более чем в половине семейств и почти у трети родов (Шарпило, 1996).
Несмотря на столь широкое распространение, изучению паратенического паразитизма исследователи уделяли неоправданно мало внимания. Возможно, это объясняется тем, что, по утвердившемуся ранее мнению, паразиты в паратенических хозяевах не претерпевают никакого развития, и паратенические хозяева, таким образом, служат лишь экологическим звеном, оптимизирующим заражение окончательного хозяина. Однако ряд паразитологов, например, К.М. Рыжиков, Б. Чаплинский, А.А. Мозговой с соавторами, К. Оденинг и другие не исключали возможности определенного развития паразитов в организме паратенического хозяина (по Шарпило, 2005). В то же время, изученность как в целом явления паратенического паразитизма, так и частных его аспектов, например, взаимоотношений паразитов и паратенических хозяев на организменном уровне,
остается крайне низкой (Никишин, 2004; Taraschewski, 2000). Один из ведущих мировых специалистов в области морфологии скребней H. Taraschewski (Taraschewski, 2000) подчеркивает этот аспект, приводя в пример именно представителей рода Corynosoma.
Таким образом, актуальность наших исследований обусловлена, с одной стороны, особой ролью паратенического паразитизма в жизненных циклах некоторых скребней, с другой стороны, слабой изученностью взаимоотношений скребней с паратеническими хозяевами на организменном уровне.
Цели и задачи работы. Цель работы заключалась в изучении морфологических особенностей взаимоотношений скребня Corynosoma strumosum (Rudolphi, 1802) Lhe, 1904 с паратеническими хозяевами разных видов на организменном уровне в естественных и экспериментальных условиях.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Изучить микро- и ультраструктуру покровных тканей скребня С. strumosum, паразитирующего в организме естественных паратенических хозяев -морских рыб семи видов.
Изучить микро- и ультраструктуру капсулы, окружающей скребня С. strumosum в естественных паратенических хозяевах - морских рыбах семи видов.
Экспериментально изучить особенности процесса инкапсуляции скребня С. strumosum в естественном паратеническом хозяине - толстощеке Миддендорфа.
Экспериментально изучить особенности процесса инкапсуляции скребня С. strumosum в неестественных паратенических хозяевах - хромисе-красавце и прыткой ящерице.
Научная новизна. Впервые показано, что взаимоотношения скребней и естественных паратенических хозяев морфологически выражаются не только в инкапсуляции паразита клетками хозяина, но и в образовании на его поверхности толстого слоя гликокаликса, сходного с имеющимся у цистакантов многих видов скребней в промежуточном хозяине.
Впервые изучена микро- и ультраструктура капсулы, окружающей скребня С. strumosum в организме естественных паратенических хозяев - морских рыб семи видов: тихоокеанской зубастой корюшки Osmerus mordax dentex, обыкновенной
малоротой корюшки Hypomesus olidus, тихоокеанской наваги Eleginus gracilis, желтоперой камбалы Limanda aspera, пятнистого терпуга Hexagrammos stelleri, мраморного керчака Myoxocephalus stelleri, толстощека Миддендорфа Hadropareia middendorffii.
Впервые выделены три модификации капсул, окружающих скребня С. strumosum в паратенических хозяевах разных видов: «фибробластическая» (в тихоокеанской зубастой и обыкновенной малоротой корюшках, тихоокеанской наваге), «лейкоцитарная» (в желтоперой камбале, толстощеке Миддендорфа, керчаке Стелл ера) и «промежуточная» (в пятнистом терпуге). Выделенные модификации капсул различаются соотношением клеток фибробластического ряда и лейкоцитов, входящих в их состав.
Впервые экспериментально изучены особенности процесса инкапсуляции скребня С. strumosum в естественном (толстощек Миддендорфа, однократный пассаж) и неестественных (прыткая ящерица Lacerta agilis, аквариумная рыба хромис-красавец Hemichromis bimaculatus) паратенических хозяевах. Показано, что в первом случае процесс инкапсуляции происходит в два этапа: вначале к паразиту мигрируют лейкоциты, а затем - фибробласты. В неестественных хозяевах характер инкапсуляции скребней различается, но в любом случае по истечении некоторого срока эксперимента паразиты погибают.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования вносят вклад в понимание сущности паратенического паразитизма и в целом паразитизма как биологического явления. Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций по паразитологии, гельминтологии, цитологии и гистологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
В естественных паратенических хозяевах инкапсулированный скребень С. strumosum формирует на своей поверхности толстый слой гликокаликса. В неестественных паратенических хозяевах такой слой не образуется.
Клеточный состав капсулы, окружающей скребня С. strumosum в естественных паратенических хозяевах разных видов, варьирует.
Возможен, как минимум, однократный пассаж скребня С. strumosum от одного паратенического хозяина в другого. В этом случае процесс инкапсуляции в естественном паратеническом хозяине - толстощеке Миддендорфа - состоит из двух этапов, на первом из которых в состав капсулы включаются лейкоциты, на втором - фибробласты.
Апробация работы. Материалы по теме диссертации были доложены на Международных научных конференциях «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов» (Москва, 2006) и «Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов» (Москва, 2008), Дальневосточных региональных конференциях, посвященных памяти А.П. Васьковского «Геология, география и биологическое разнообразие Северо-Востока России» (Магадан, 2006) и «Геология, география, биологическое разнообразие и ресурсы Северо-Востока России» (Магадан, 2011), Чтениях памяти академика К.В. Симакова (Магадан, 2007, 2009), Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2007), IV и V Всероссийских съездах Паразитологического общества при РАН «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения» (Санкт-Петербург, 2008) и «Паразитология в изменяющемся мире» (Новосибирск, 2013), XIV Конференции Украинского научного общества паразитологов (Ужгород, 2009), Международном симпозиуме «Паразиты Голарктики» (Петрозаводск, 2010), Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 6 - в журналах, входящих в список ВАК России.
Личный вклад. Автор в период с 2006 по 2012 гг. самостоятельно провел все
этапы исследования: вскрытие рыб и взятие материала, подготовку свето- и
электронно-микроскопических препаратов, микроскопирование и
фотографирование, последующую обработку и анализ полученных результатов. Эксперименты по заражению животных скребнями и исследование образцов, полученных в результате экспериментов, также проведены автором лично.
Структура и объем диссертации. Рукопись изложена на 305 страницах и состоит из введения, пяти глав и выводов, содержит 10 таблиц, список литературы
из 188 работ, в том числе 131 – на иностранных языках, и приложение на 135 страницах, включающее 228 свето- и электронно-микроскопических фотографий.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. В.П. Никишину за помощь в постановке проблемы и внимательное отношение на всех этапах подготовки и написания работы; к.б.н. Г.И. Атрашкевичу (ИБПС ДВО РАН) за консультации по систематике и экологии скребней; к.б.н. Н.А. Поспеховой (ИБПС ДВО РАН) за помощь при получении электронно-микроскопических фотографий; к.б.н. О.И. Лисицыной (Институт Зоологии им. И.И. Шмальгаузена НАН Украины) за ценные идеи и помощь в проведении экспериментов; д.б.н. М.П. Грушко и Н.С. Алтуфьевой (Астраханский государственный технический университет) за предоставленную возможность освоения гистологических методов исследования; чл.-корр. РАН В.В. Юшину и Д.В. Фомину (Дальневосточный центр электронной микроскопии, Институт биологии моря ДВО РАН) и С.И. Метелеву (Центр электронной микроскопии, Институт биологии внутренних вод РАН) за предоставленную возможность использования электронной микроскопии, а также всем сотрудникам лаборатории экологии гельминтов ИБПС ДВО РАН за ценные советы и замечания при обсуждении результатов работы.
Работа поддержана грантами РФФИ (проект 12-04-00043), РФФИ-ДВО РАН (проект 09-04-98523-р_восток_а), ДВО РАН (проекты 09-III-В-06-276, 10-III-В-06-139, 11-III-В-06-024, 13-III-В-06-096, 12-III-А-06-102, 12-III-Д-06-020) и Губернатора Магаданской области (2008).
Взаимоотношения скребней с окончательными хозяевами
Попадая в организм окончательного хозяина из промежуточного или паратенического, скребни поселяются в его пищеварительном тракте. Если хозяин является истинным, т.е. облигатным или факультативным (Шульц, 1972), то скребни успешно приживаются в нем, прикрепляясь к стенке кишки, достигают половой зрелости и размножаются. В других случаях скребни могут либо претерпевать некоторое развитие, но не достигают стадии размножения, либо вовсе не способны к какому-либо развитию и удаляются естественным путем. В настоящем разделе рассмотрены взаимоотношения скребней с истинными дефинитивными хозяевами, а также случаи, когда скребни по тем или иным причинам изменяют обычную локализацию в кишечнике и перемещаются в полость тела или иные внутренние органы.
Сведения о взаимоотношениях скребней с окончательными хозяевами, в разных аспектах, наиболее полно обобщены в монографической работе H. Taraschewski (Taraschewski, 2000). В зависимости от длины шейки и, соответственно, от глубины проникновения хоботка в стенку кишечника автор разделил всех скребней на две группы. Гельминты из первой группы, не перфорирующие по терминологии автора, имеют короткую шейку и внедряются только в толщу слизистой оболочки кишечника, поэтому они могут менять свою локализацию, но никогда не встречаются в полости тела окончательного хозяина. Перфорирующие скребни, имеющие длинную шейку, внедряются глубоко в мышечные слои стенки кишечника и иногда даже пронзают ее насквозь. Они характеризуются постоянной локализацией и иногда могут проникать сквозь стенку кишки окончательного хозяина и обнаруживаться в полости тела. Автор отмечает, что характер ответной реакции хозяина зависит как от принадлежности инвазирующих скребней к той или иной группе и продолжительности инвазии, так и от его систематического положения.
Вследствие наличия хоботка, вооруженного крючьями, скребни при паразитировании в окончательном хозяине неизбежно повреждают стенку его кишечника. Степень этих повреждений, приводящих к воспалению поврежденных тканей, может быть разной и, в первую очередь, зависит от периода паразитирования, размера пресомы паразита и количества и размера хоботковых крючьев. Нужно подчеркнуть, что, хотя, как известно, кишечные паразиты активизируют иммунную и эндокринную систему позвоночных (Castro, 1991; Fairweather, 1997), в целом клеточный ответ является наиболее примитивным из всего комплекса защитных механизмов (Reichlin, 1999) и, вследствие этого, по-видимому, наиболее распространенным. Очевидно, что от степени механических повреждений, в свою очередь, зависит интенсивность ответной реакции хозяина, а ее особенности обусловлены его таксономической принадлежностью (Taraschewski, 2000).
В наиболее общем виде особенности взаимоотношений скребней и дефинитивных хозяев связаны с принадлежностью скребней к группе перфорирующих или не перфорирующих (иначе говоря, имеющих длинную или короткую пресому), а также с классом, к которому относится хозяин (Taraschewski, 2000). По мнению этого автора, в воспалительной ткани рыб преобладают гранулоциты и макрофаги (эпителиоидные клетки); встречаются также специфичные для рыб мелано-макрофаги и немногочисленные или даже редкие плазмоциты. У птиц доминируют гетерофильные гранулоциты и гигантские многоядерные клетки; имеются также плазмоциты, а у млекопитающих наиболее многочисленны плазматические клетки (Taraschewski, 2000).
У птиц, инвазированных одним из наиболее патогенных среди паразитов птиц Filicollis anatis, прилежащий к паразиту слой воспалительной ткани, более узкий вблизи средней и задней частей шейки и более широкий вокруг хоботка, был подвержен некрозу (Taraschewski, 1991c). В этой ткани обнаружены гетерофильные гранулоциты (при малом количестве эозинофилов), макрофаги, в том числе и гигантские многоядерные клетки, а также редкие лимфоциты и плазматические клетки. Внешняя часть некротической зоны ограничена капсулой из фибробластов и коллагеновых волокон с включением в нее клеток воспалительного ряда, а также кровеносных капилляров. Авторы подчеркивают, что если для воспалительного ответа млекопитающих характерны плазматические клетки, то в воспалительной ткани птиц преобладают гетерофильные гранулоциты и многоядерные клетки (Taraschewski, 1989c).
Методика электронно-микроскопических исследований
Подопытных рыб отлавливали во время отливов под камнями или в литоральных ваннах. Эксперимент проведен в лабораторных условиях в июне и в сентябре-ноябре 2012 года и был поделен на два этапа.
Опытную группу рыб поместили в необогреваемый аквариум с морской водой, объем которого составил 80 л (размеры 553543 см). На дне аквариума распределили крупногалечный грунт, взятый из естественного биотопа подопытных животных. В качестве укрытий были сооружены нагромождения из крупных камней и установлены полые керамические изделия. На протяжении всего эксперимента вода в аквариуме обогащалась кислородом посредством аэрирующего фильтра. С целью максимального приближения условий эксперимента к естественным, помещение, где был установлен аквариум, также не отапливалось. Перед каждым экспериментом только что пойманных рыб выдерживали в покое в течение недели. Примерно через два-три дня рыбы начинали принимать корм. Кормили рыб один раз в день по 5 грамм мороженого мотыля.
Первый этап эксперимента был проведен в июне 2012 года с целью исследования начальных этапов процесса инкапсуляции скребней, поэтому все подопытные рыбы были вскрыты через трое суток после начала эксперимента. Опытную группу рыб составили 12 толстощеков длиной от 8,2 до 11,8 см. Температура воздуха в помещении с аквариумом колебалась в пределах от 12 до 18 С. Заражение подопытных рыб проводили инкапсулированными скребнями, извлеченными из других естественных паратенических хозяев (бельдюги, толстощека Миддендорфа), выловленных в районе мыса Нюкля, в котором была отмечена высокая зараженность рыб этим скребнем (Карта 2). Рыбу заражали пероральным способом. Для привлечения внимания рыб в аквариуме и облегчения процесса заражения инкапсулированных скребней бросали в воду с кусочками прилежащих органов. Всего было скормлено 32 скребня. Поскольку одна из рыб в качестве постоянного убежища использовала участок на поверхности фильтра, мы точно знаем, что во время заражения она проглотила 10 скребней. Остальные 22 скребня были скормлены оставшимся рыбам. Вскрытие экспериментальных рыб провели спустя 3 суток после заражения.
Второй этап эксперимента был проведен в сентябре-ноябре того же года с целью изучения более поздних этапов процесса инкапсуляции скребней. Опытная группа рыб насчитывала 11 особей длиной от 6,3 до 18,2 см. Условия содержания подопытных рыб и способ их заражения были аналогичны отработанным в течение первого этапа эксперимента. В помещении, где располагался аквариум, температура воздуха в начале эксперимента достигала 12 С, затем постепенно снижалась и к концу эксперимента составила – 3 С. Поскольку рыбы предпочитали держаться в определенных участках аквариума, это позволило нам провести индивидуальное заражение каждой из них. Каждому толстощеку было скормлено от 5 до 11 скребней. Вскрытие проводили через 14 (две особи), 30 (две особи) и 50 (семь особей) суток после заражения.
Эксперимент по заражению хромиса-красавца В эксперименте использовано 11 аквариумных рыб – хромисов-красавцев Hemichromis bimaculatus, приобретенных в специализированном зоомагазине. Рыбок содержали в аэрируемом аквариуме объемом 80 л (размеры 553543 см) с отстоянной водопроводной водой. Подогрев воды в аквариуме держался на уровне 25-26 С. Кормили один раз в сутки по 4-5 грамм сухого корма (гаммарусы) или мороженного мотыля. Непосредственно перед началом эксперимента рыб держали в состоянии покоя в течение 7 суток.
Для заражения использовали кориносом, извлеченных из естественных паратенических хозяев – толстощека Миддендорфа Hadropareia middendorffii и тихоокеанской зубастой корюшки Osmerus mordax dentex, отловленных в окрестностях г. Магадана. Каждой рыбе скармливали от 5 до 15 скребней. Всего было скормлено 147 скребней. Вскрытия осуществляли через 3, 10, 12, 19 и 30 суток после заражения. Перед вскрытием рыб измеряли от вершины рыла до конца лучей хвостового плавника (TL). 2.4.3. Эксперимент по заражению прыткой ящерицы В эксперименте использовано 24 особи прыткой ящерицы Lacerta agilis. Животных отлавливали в пригороде г. Киева (Украина) в апреле-мае 2009 и 2011 гг. и содержали в отдельных террариумах при температуре 20-25 С. В качестве грунта использовали песок, покрывающий дно террариума слоем 5-7 см. Обогреватель располагался в верхней части террариума. В одном из углов террариума было сделано укрытие из камней и коряг, а в другом углу была установлена неглубокая поилка. Большая коряга располагалась непосредственно под обогревателем. Обогреватель включали ежедневно на 5-6 часов. Кормление производили ежедневно личинками мучного хрущака Tenebrio molitor. Заражали ящериц в июне 2009 и 2011 гг. Длину животных измеряли от кончика морды до переднего края отверстия клоаки. В качестве инвазионного материала использовали скребней C. strumosum, извлеченных из полости тела тихоокеанской зубастой Osmerus mordax dentex и обыкновенной малоротой Hypomesus olidus корюшек, толстощека Миддендорфа Hadropareia Middendorffii, керчака Стеллера Myoxocephalus stelleri и терпуга пятнистого Hexagrammos stelleri, пойманных в Охотском море в окрестностях г. Магадана. Скребни, извлеченные из керчака, зубастой корюшки, терпуга и толстощека были окружены хорошо выраженной капсулой, легко распознаваемой невооруженным глазом. Некоторые из скребней, извлеченные из малоротой корюшки, также были заключены в тонкую капсулу, но большинство находились в свободном состоянии. При этом хоботки большинства не инкапсулированных скребней были инвагинированы и только у трех кориносом были частично эвагинированы. Скребней вместе с кусочками прилежащей ткани или с кусочками печени скармливали подопытным животным. Всего было заражено 24 ящерицы: десяти ящерицам скормлено по 15 скребней, трем ящерицам скормлено по 20 гельминтов, шесть ящериц попарно получили по 8, 10, и 21 скребню, оставшимся пяти ящерицам было дано по 6, 12, 13, 14 и 16 скребней. Экспериментальных животных вскрывали спустя 1.5, 2, 4, 5, 6, 10, 25, 30, 34, 90, 105 и 572 суток.
Морфология капсулы, окружающей скребня Corynosoma strumosum в паратенических хозяевах разных видов
Нейтрофилы неправильной округлой или удлиненной формы с отростками, относительно некрупные (7,2-13,03,0-5,6 мкм) (Рисунок 80А, Б, 81А, Б). Цитоплазма нечетко подразделяется на эндоплазму и эктоплазму. Ядро неправильной формы, часто с неглубокими инвагинатами, эксцентричное или занимает центральное положение и включает ядрышко и крупные скопления хроматина, частью рассеянные в кариоплазме. Цитоплазма содержит многочисленные гранулы, как правило, удлиненной формы; их содержимое образовано электронно-плотным материалом, оккупирующим периферию гранул, и менее плотной субстанцией в их центральной части (Рисунок 80А, Б). Размеры гранул – 0,3-0,90,1-0,2 мкм. Кроме того в цитоплазме наблюдаются канальцы гранулярной эндоплазматической сети различной протяженности и округлые или удлиненные митохондрии.
Лимфоциты (4,3-7,61,9-3,7 мкм) характеризуются высоким ядерно-плазменным отношением и относительно высокой общей электронной плотностью (Рисунок 82А, Б). Ядра разнообразные по форме, с глубокими инвагинатами, часто сегментированные, отличаются обилием гетерохроматина, представленным в виде сплошного своеобразного «пояска» по периферии ядра, а также грубыми скоплениями в кариоплазме, не связанными с ядерной оболочкой. Цитоплазма включает минимальный по разнообразию и количеству набор органоидов и включений: немногие митохондрии, короткие каналы гранулярной эндоплазматической сети и мелкие вакуоли со светлым содержимым.
Фибробласты имеют вытянутую форму с длинными отростками, ориентированными в разных направлениях параллельно поверхности скребня (Рисунок 76А, Б). В среднем слое капсулы тела и отростки фибробластов располагаются вплотную друг к другу и связаны между собой многочисленными десмосомами (Рисунок 76Б). Пучки коллагеновых фибрилл, наблюдаемые в этом слое, немногочисленны. В наружном слое капсулы отростки фибробластов и сами клетки уплощены в значительно большей степени, чем в среднем слое, а протяженные межклеточные пространства между ними включают многочисленные пучки коллагеновых фибрилл (Рисунок 76А). На срезах ориентация коллагеновых фибрилл не всегда соответствует ориентации фибробластов, однако во всех случаях они ориентированы параллельно поверхности паразита.
Ядра фибробластов вытянутые, содержат электронно-светлую кариоплазму, нечетко очерченное ядрышко и немногочисленные и небольшие скопления гетерохроматина (Рисунок 76А, Б). Для цитоплазмы фибробластов наиболее характерны длинные, часто извитые каналы гранулярной эндоплазматической сети, иногда располагающиеся в виде более или менее упорядоченных скоплений. Имеются также немногочисленные мелкие митохондрии и редкие зоны Гольджи.
У двух скребней межклеточное пространство капсул содержит не только коллагеновые волокна, но и небольшие скопления плотного волокнистого материала неясного происхождения (Рисунок 83А, Б). Как правило, этот материал наблюдается вблизи гликокаликса на поверхности скребня, реже в толще капсулы. Кроме того, он был тесно связан с гранулоцитами, имеющими признаки деструкции. В двух исследованных случаях, как уже отмечалось, капсула содержала более одного скребня (Рисунок 84А, Б). Эта капсула тонкая (ее толщина не превышает 40 мкм), представляет собой непрерывное образование и также организована из трех слоев (Рисунок 84А, 85А, Б). Однако если наружный слой капсулы (Рисунок 84А, Б) является «общим» для всех скребней, заключенных в нее, и проникает между ними, изолируя их друг от друга, то внутренний и средний слои у каждого паразита – собственные и только в редких случаях наблюдается слияние этих слоев с таковыми соседнего скребня. Внутренний слой представляет собой зону некроза, которая предположительно состоит из разрушенных клеток. В состав наружного и среднего слоев капсулы входят фибробласты и лейкоциты. На полутонких срезах фибробласты характеризуются длинными отростками и округлым или вытянутым светлым ядром с одним-двумя ядрышками (Рисунок 84Б, 85А, Б). Лейкоциты отличаются от фибробластов неправильной формой и темно окрашенным ядром. К сожалению, электронно-микроскопических исследований такой капсулы выполнить не удалось.
Печень. Из двух найденных на печени скребней исследован один. Паразит располагался на печени, слегка вдавливаясь в ткань органа. Так же как и в предыдущих случаях, капсула имеет трехслойное строение (Рисунок 86А, Б). Ее толщина неоднородна и в некоторых участках достигает значительных размеров (153 мкм). Внутренний слой имеет вид темной зоны, которая плотно охватывает всего скребня. Этот слой представлен погибшими клетками и на всем его протяжении имеет примерно одинаковую толщину (12-15 мкм). Над ним находится средний слой, толщина которого также относительно постоянна и составляет 15-19 мкм. Этот слой отличается настолько плотным расположением клеток, что их границы едва заметны. Ядра клеток округлые, светлоокрашенные, цитоплазма более темная, иногда содержит мелкие плотные гранулы. Клеточные элементы наружного слоя капсулы располагаются очень рыхло, разделены широкими межклеточными пространствами, размеры которых уменьшаются по направлению к паразиту.
Сравнительный анализ морфологии капсулы вокруг скребней Corynosoma strumosum в естественных паратенических хозяевах
Результаты эксперимента показали, что ящерицы также способны относительно успешно заражаться исследованными скребнями, поскольку из двадцати пяти особей зараженными оказались шестнадцать. У тринадцати ящериц гельминты пенетрировали стенку кишечника и локализовались на органах, при этом сохраняя жизнедеятельность не менее тридцати дней. Интересно, что большинство скребней даже на двадцать пятый день после заражения были обнаружены прикрепленными к слизистой оболочке кишечника. В то же время уже через 1,5-2 суток после заражения некоторые скребни смогли проникнуть в полость тела хозяина и инкапсулироваться. Примерно столько же времени потребовалось скребням Sphaerirostris picae для миграции сквозь стенку кишечника этого же вида паратенического хозяина, однако визуально инкапсуляция этих паразитов не была отмечена (Лисицина, 1991). В другом подобном эксперименте скребни этого же вида на третьи сутки после инвазии находились в процессе проникновения сквозь стенку кишечника, а на пятые сутки обнаруживались в полости тела ящерицы (Шарпило, 1971). Поскольку во всех этих экспериментах, были использованы хозяева одного вида, можно предполагать, что скорость миграции скребней в организме паратенического хозяина, по всей вероятности, зависит не только от видовой принадлежности хозяина и паразита, но и от их физиологического состояния, а также, вероятно, от некоторых других биотических и (или) абиотических факторов.
То, что вплоть до двадцать пятого дня после заражения многие скребни находились еще прикрепленными к слизистой кишечника, нельзя рассматривать как свидетельство неодновременного начала их миграции сквозь стенку кишечника, поскольку в полость тела хозяина в большинстве случаев мигрировал только один паразит. По нашему мнению, данный факт свидетельствует о том, что лишь небольшая часть из попавших в кишечник гельминтов может успешно мигрировать сквозь его стенку и инкапсулироваться. Остальные скребни, вероятно, со временем покидают кишечник естественным образом. Подобный факт безуспешной миграции большей части скребней C. strumosum сквозь стенку кишки трески ранее был описан E.T. Valtonen (Taraschewski, 2000).
Все скребни, которые проникли сквозь стенку кишечника в полость тела ящериц, были покрыты тонким слоем гликокаликса, толщиной менее 0,1 мкм. На электронно-микроскопических фотографиях гликокаликс имеет вид «бахромы» и выявляется не на всех снимках. Вскрытия, произведенные в первые тридцать суток, показали, что все скребни в капсулах были живыми. Тегумент их выглядел неповрежденным и по строению в целом не отличался от тегумента скребней из естественных паратенических хозяев. Однако в его структуре отмечались две особенности, заключающиеся в наличии чрезвычайно крупных везикул в составе везикулярного слоя и в явном расширении устьев каналов поперечно-полосатого слоя.
Основу капсул, окружающих кориносом, полученных в эксперименте, составляют макрофаги и многоядерные клетки. В первые десять дней эксперимента капсулы, окружающие кориносом, состоят преимущественно из макрофагов, между которыми находятся разные типы лейкоцитов, фибробласты, а также отдельные и крупные многоядерные клетки, располагающиеся в основном вблизи покровов гельминтов. На тридцатый день инвазии клеточный состав капсул был приблизительно таким же, с той лишь разницей, что вблизи поверхности скребней наблюдались целые группы или цепочки многоядерных клеток, организованные в один-два ряда. На поздних сроках инвазии, а именно на девяностые и сто пятые сутки, были найдены только дегенерированные скребни, окруженные толстыми капсулами. На световых препаратах элементы тела скребней не определялись, и были видны лишь фрагменты, похожие на их мускулатуру. В капсулах, окружающих погибших скребней, отчетливо выделялись на два слоя: внутренний, состоящий исключительно из многоядерных клеток, и наружный, образованный плотно расположенными клетками разных типов.
Согласно А. Хэм и Д. Кормак (Хэм, 1983): «образование гигантских клеток инородных тел служит для того, чтобы сформировались достаточно крупные клетки, способные окутывать или как-либо иначе изолировать большие количества инородного материала или клеточного детрита, которые не могут быть поглощены одной клеткой». Учитывая, что на раннем этапе эксперимента в составе капсулы, окружающей паразитов, доминируют макрофаги, а многоядерные клетки встречаются вначале поодиночке, а впоследствии их количество возрастает вплоть до образования ими самостоятельного слоя, мы предположили, что этот слой капсулы формируется постепенно в результате последовательного слияния макрофагов.
Согласно литературным данным многоядерные образования окружают как живые, так и неживые объекты. Так, при имплантации в подкожную ткань спинного участка мышей и крыс полипропиленовой волокнистой сеточки обнаружено, что к началу второй недели каждое отдельное волокно сеточки покрыто макрофагами и многоядерными клетками (Papadimitriou, 2004). При введении в дерму крысы кусочков ваты отмечены гигантские клетки, облегающие каждый из этих кусочков (Жункейра, 2009). Вокруг живых объектов, в частности гельминтов, также наблюдали аналогичную реакцию макрофагов (Glazebrook, 1981; Huizinga, 1997). Есть примеры, когда такая реакция приводит к уничтожению хозяином паразитов. Например, крупные многоядерные клетки обнаружены вокруг дегенерирующих яиц спирорхид в тканях и органах зеленой и головастой морской черепах (Glazebrook, 1981; Wolke, 1982). В организме серебряного карася метацеркарии Ribeiroia marini окружаются слоем эпителиоидных клеток, которые объединяясь, образуют симпласты; в дальнейшем большинство инкапсулированных трематод удаляется через отверстия боковой линии рыб (Huizinga, 1997).
Следует отметить, что во внутреннем слое капсулы многоядерные клетки явно проявляют выраженную фагоцитарную активность (Рисунок 134, 135). Однако, поскольку исследованные скребни обладают довольно крупными размерами, то даже крупные многоядерные клетки не могут поглотить их полностью, но поглощают фрагменты уже погибших паразитов. В цитоплазме одной из многоядерных клеток мы нашли образование похожее на фагосому, содержимое которой напоминало фрагменты гельминта.
Таким образом, мы полагаем, что в теле ящериц скребни могут выживать довольно длительное время (не менее месяца), после чего они дегенерируют в результате ответной реакции организма хозяина, в которой клеточный ответ, возможно, играет первостепенную роль. По всей вероятности, успех ответной клеточной реакции в значительной степени обусловлен отсутствием на поверхности паразита выраженного слоя гликокаликса, подобного гликокаликсу скребней из естественных паратенических хозяев.
