Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ I. Обзор литературы 21
1.1. Проницаемость эритроцитов для неэлектролитов и парамагнитных ионов 21
1.2. Теоретический анализ проницаемости клеточных мембран для неэлектролитов 26
1.2.1. Уравнения, основанные на законе диффузии Фика 26
1.2.2. Уравнения, основанные на законах неравновесной ф термодинамики 30
1.2.3. Распределение веществ между клеткой и окружающей ее средой 34
1.3. Влияние различных физико-химических факторов на состояние цитоплазмы эритроцитов 35
1.4. Гипотезы, теории криоповреждения и криозащиты 39
1.5. Способы криоконсервирования эритроцитов 50
РАЗДЕЛ II. Материалы и методы исследования 65
2.1. Метод электронного парамагнитного резонанса 65
2.1.1. Исследование проницаемости мембран эритроцитов для криопротекторов методом ЭПР спинового зонда 69.
2.2. Исследование распределения криопротекторов между эритроцитами и внеклеточной средой методом ЯМР 86
2.3. Исследование гидратации эритроцитов методом ЭПР спинового зонда 90
2.4. Исследование времени корреляции вращательной диффузии спинового зонда во вне- и внутриклеточных средах методом ЭПР
2.5. Краткое описание строения эритроцита 98
2.6. Исследование эритроцитов методом спектрофотометрии 101
2.7. Подготовка эритроцитов для исследования 105
2.8. Получение красных теней эритроцитов 106
2.9. Подготовка реактивов 106
2.10. Замораживание эритроцитов 107
РАЗДЕЛ III. Влияние температуры и концентрации внутриклеточного белка на проницаемость эритроцитов для криопротекторов 112
3.1. Влияние температуры на проницаемость мембран эритроцитов для криопротекторов 112
3.2. Влияние концентрации внутриклеточного белка на проницаемость мембран эритроцитов для глицерина 127
3.3. Влияние концентрации внутриклеточного белка гемоглобина на распределение различных веществ между вне- и внутриклеточными средами 134
РАЗДЕЛ IV. Влияние различных физико-химических факторов на время корреляции вращательной диффузии спинового зонда вне, внутри эритроцитов и структурно-функциональное состояние гемоглобина их цитоплазмы 159
4.1. Влияние концентрации различных веществ на время корреляции вращательной диффузии зонда ТЕМПОН в цитоплазме эритроцитов 161
4.2. Влияние температуры на время корреляции вращательной диффузии зонда ТЕМПОН в цитоплазме и во внеклеточном растворе 180
4.3. Влияние различных физико-химических факторов на структурно-функциональное состояние внутриклеточного белка гемоглобина 187
РАЗДЕЛ V. Криоконсервирование эритроцитов 218
5.1. Оценка цитотоксичности криопротекторов 219
5.2. О роли переохлаждения в повреждении биообъектов на этапе замораживания 227
5.3. О роли осмотических факторов в повреждении биообъектов на этапе замораживания 237
5.4. Влияние сочетания 1,2-пропандиола с различными высокомолекулярными веществами на сохранность эритроцитов при криоконсервировании 247
Заключение 272
Выводы 281
Список использованных источников 284
- Теоретический анализ проницаемости клеточных мембран для неэлектролитов
- Исследование распределения криопротекторов между эритроцитами и внеклеточной средой методом ЯМР
- Влияние концентрации внутриклеточного белка на проницаемость мембран эритроцитов для глицерина
- Влияние температуры на время корреляции вращательной диффузии зонда ТЕМПОН в цитоплазме и во внеклеточном растворе
Введение к работе
За последние десятилетия интенсивно развивается сравнительно молодое научное направление общей биологии криобиология, от которой зависит решение ряда важных народнохозяйственных и социальных задач [4,8,13,17,20, 52,85,98,143,155,156,165,169,187,199,268]: - создание запасов крови и ее компонентов для обеспечения возрастающих потребностей хирургии и гематологии; - создание вакцино-сывороточных запасов, потребность в которых возрастает, в связи с увеличением частоты вирусных заболеваний; сохранение некоторых линий клеточных культур, семян растений, вымирающих животных, рыб для сохранения существующих и создания новых их видов методами генной инженерии; сохранение репродуктивных клеток человека и животных; создание банка органов и тканей, что позволит уменьшить риск отторжения трансплантата из-за иммунной несовместимости; использование холода для лечения различных заболеваний.
В настоящее время широко используют клетки крови в хирургии, терапии для лечения различных заболеваний. Чаще всего применяют переливание эритроцитов человека [3,4,51,85]. Однако имеющиеся методы криоконсервирования эритроцитов человека имеют недостатки (трудоемкость, дороговизна, малые сроки хранения в ресуспендирующей среде после криоконсервирования и отмывки), которые препятствуют широкому их распространению в клинической практике [4,45,127]. Причиной такого состояния дел является то, что недостаточно изучены те физико-химические процессы, которые протекают в эритроцитах и в других биообъектах на этапах их криоконсервирования. К этим физико-химическим процессам, в частности, относятся: - транспорт неэлектролитов и электролитов в клетку и из нее в условиях изменения температуры; - изменения во всех компонентах клеток, которые происходят в результате изменения температуры, фазового перехода вода-лед, вымораживания воды в лед и концентрирования электролитов и неэлектролитов вне и внутри клеток, стеклования, расстеклования, плавления льда и т.д.
Актуальность темы. Изучению проницаемости клеток для неэлектролитов и электролитов посвящено достаточно большое число экспериментальных [83,84,213,214,250,282,297,320] и теоретических работ [48,83,84,181,239,320], так как выяснение механизмов, лежащих в основе регуляции проницаемости мембран и причин неравномерного распределения веществ между клеткой и окружающей ее средой имеет большое значение не только для теории, но и для практики. Для криобиологов важно знать проник или не проник криопротектор в клетку и завершился ли процесс его проникновения, так как от этого зависит не только результат криоконсервирования, но и правильная оценка полученного результата в плане выяснения механизмов криоповреждения и криозащиты. Однако до настоящего времени остаются неясными многие стороны клеточной проницаемости, и по сей день существуют мембранная теория [48,83,181,239,320] и сорбционная (фазовая) гипотеза [134,181,214,250]. Мембранная теория получила широкое распространение в силу серьезного и всестороннего анализа на ее основе экспериментальных результатов [48,83,239,320], в то время как сорбционная гипотеза [134,181,214,250] все еще требует дальнейших экспериментальных и теоретических исследований для своего обоснования.
Исследование проницаемости мембран эритроцитов человека и животных для неэлектролитов ведутся давно [236,259,290,293,294], однако, до сих пор нет данных по систематическому исследованию проницаемости их мембран для различных криопротекторов при различных температурах. Так Джекобе [237] провел исследование проницаемости мембран эритроцитов человека и млекопитающих для глицерина, этиленгликоля гемолитическим методом. При этом было определено время гемолиза эритроцитов при различных температурах без рассчета коэффициента проницаемости. Парпат и Шулл [294], используя аналитический и гематокритный методы, определили, что время завершения процесса проникновения глицерина в эритроциты крупнорогатого скота составляет 40-гбО мин. Орсков [290] исследовал проницаемость мембран эритроцитов для глицерина оптическим методом в диапазоне температур 0-5-37 С и установил, что при изменении температуры на 10 С константа скорости его проникновения изменяется в 1,8+2 раза. Коэффициент проницаемости для глицерина при 0 С -0,23-10"5 см/мин и -0,87-10"5 см/мин при 20 С (из графических данных). Стейн [318,319] оптическим методом определил время, в течение которого проникает 50% от количества внеклеточного вещества (t1/2) в эритроциты человека при 10+30 С. Значения t1/2 для 1,2-пропандиола (1,2-ПД) 20% -
101 с, глицерина - 30% - 90 с (20 С), этиленгликоля 20% - 65 с (определенны из графических данных путем экстраполяции). Обращает на себя внимание более высокое значение t1/2 1,2-ПД, чем у глицерина. Высокая скорость проникновения глицерина при больших его концентрациях объяснена образованием димеров глицерина с переносчиком глицерина. Мазур и Миллер [266] исследовали проницаемость мембран эритроцитов человека для глицерина и определили, что коэффициент проницаемости (Р) при 20 С составляет 2,5*10"4 см/мин, а при 0 С - 1,0*10"4см/мин. Позднее Карлсен и Вит [213] установили, что Р мембран эритроцитов человека для глицерина (1 ммоль/л) при 0 С и рН=7,4 составляет 7,8*10"5 см/мин (1,3*10'6 см/с). Майранд и Левит [261], используя радиоизотопный метод, определили коэффициент проницаемости мембран эритроцитов человека для этиленгликоля при 23 С, который оказался равен 4,8*10"4 см/с (2,9*10"2 см/мин). При использовании оптического метода Левит и Млекодей [248] получили значение коэффициента проницаемости мембран эритроцитов человека для этиленгликоля 3,9*10"4 см/с (2,3*10"2 см /мин) (23 С). Используя эти данные, а также данные по влиянию блокаторов проницаемости на трансмембранные потоки, они пришли к выводу о существовании независимых транспортных систем для растворителя и растворенных веществ. Однако Тун и Соломон [328] на основании собственных исследований пришли к выводу, что проницаемость мембран эритроцитов для воды все же коррелирует с проницаемостью этиленгликоля и мочевины, на основании чего сделали вывод о прохождении этих веществ через одни и те же поры в мембране.
Свенсон и соавт. [324] исследовали проницаемость мембран лизосом из клеток печени крыс для 43 органических веществ (неэлектролитов) с молекулярной массой 62-1000. Было показано, что имеет место отрицательная корреляция между скоростью проникновения этих вещества в лизосомы и с их способностью к образованию водородных связей с водой (для ОН-группы способность образовывать водородные связи считали равной 2). Эти значения отличаются от данных, которые были получены экспериментально методом 1Н-ЯМР [71,72] (гидроксильной группой этиленгликоля прочную водородную связь образует 1 молекула воды). Зинченко [72] считает, что ряд связывающей способности, построенный Свенсоном и соавт. [324], соответствует достаточно слабым водородным связям исследованных веществ с водой. Брукдорфер и соавт. [211] показали, что при удалении холестерина из эритроцитов возрастает их осмотическая хрупкость и проницаемость для глицерина.
Приведенные выше данные показывают, что основное внимание в большинстве работ уделялось изучению механизмов транспорта веществ через мембраны, измерению трансмембранных потоков и определению коэффициента проницаемости. Следует отметить, что данные по определению Р мембран эритроцитов человека при 0-10 С единичны [318,319]. Этот диапазон важен для криобиологов, так как добавление криоконсерванта, содержащего криопротекторы 1,2-ПД и этиленгликоль, при этих температурах к эритроцитам человека дает более высокую их сохранность [45,78]. Кроме того, данные по коэффициенту проницаемости мембран эритроцитов человека даже для одного глицерина, полученные различными исследователями, отличаются почти на порядок [213,290]. На такие различия в значениях коэффициента проницаемости глицерина для мембран эритроцитов, полученных различными исследователями, указывали и ранее [266,320] (3-ь40)Ю~Б см/мин). Причинами таких расхождений могут быть как особенности методики подготовки образца (состав и низкая осмолярность среды), так и недостатки методов исследования проницаемости мембран эритроцитов. Из вышеизложенного видно, что необходимы дальнейшие исследования проницаемости мембран эритроцитов человека с применением нового неинвазивного метода.
К настоящему времени накоплены экспериментальные данные, которые не удается объяснить с точки зрения мембранной теории. Порою эти данные носят противоречивый характер. Так исследование распределение этиленгликоля показало, что коэффициент его распределения для эритроцитов человека, быка, кролика и овцы близки к единице [259], в то время как по данным Орскова [291] коэффициент распределения для этиленгликоля, как и для глицерина, больше . Карлсен и Вит [213] установили, что коэффициент распределения глицерина не зависит от его концентрации (0,001-^-4 моль/л), рН раствора (5,5-і-9,8) и составляет 0,93 ± 0,04. Маклеод и Пондер [259] также определили, что коэффициент распределения этиленгликоля (0,3 моль/л) для эритроцитов человека, быка и кролика близок к 1. Однако исследования Зинченко [72] показали, что коэффициент распределения для всех криопротекторов при 23 С меньше 1, но даже для веществ, которые имеют молекулярную массу до 2000, он не равен нулю.
Исследование проницаемости клеток для Сахаров показало, что они проникают не во все клетки животных [227,233,334], но проникают в мышечные клетки [223,281,282,289,292].
Данные, приведенные выше, не удается объяснить с точки зрения мембранной теории, так как криопротекторы, транспорт которых не зависит от затрат энергии, имеют различные концентрации вне и внутри клетки. Однако этих данных недостаточно для широких обобщений. Так недостаточно изучено влияние температуры на распределение криопротекторов. Практически нет работ по изучению влияния концентрации основной компоненты внутриклеточной фазы - белка на проницаемость клеток для электролитов и неэлектролитов, хотя этот вопрос особенно важен не только для криобиологов, но и для биологов для понимания роли внутриклеточной фазы в регуляции клеточной проницаемости. Кроме того, на этапах криоконсервирования биообъектов происходит существенное изменение концентрации внутриклеточного белка, что сказывается как на распределении веществ между клеткой и окружающей ее средой, так и на процессах их транспорта через мембрану клеток и диффузии в цитоплазме.
Для исследования диффузии веществ в цитоплазме эритроцитов человека был использован метод ЭПР спинового зонда [133,191,235]. При этом было установлено, что имеются изломы на кривых зависимости параметра подвижности зондов от обратной температуры. В присутствии криопротекторов эти изломы сглаживались. На основании исследования подвижности спиновых зондов в мембране и в цитоплазме эритроцитов был сделан вывод о кооперативности изменений в них при изменении температуры [191]. Эти исследования не охватывают диапазон температур -0-J--10 С, где происходят основные повреждения клеток при криоконсервировании без криопротекторов, в силу переохлаждения системы. Данные, полученные на этапе отогрева, не в полной мере отражают процессы, которые протекают в этом диапазоне температур, в силу явлений гистерезиса. Имеющиеся данные в литературе [53,109,110], по изучению зависимости вращательной диффузии спинового зонда в цитоплазме эритроцитов от концентрации различных веществ охватывают их концентрации до -1,2 моль/л, в то время как концентрация натрия хлорида может достигать 4 моль/л и более [25,26]. Не ^ изучено влияние различных концентраций криопротекторов и электролитов при их сочетании на процессы диффузии в цитоплазме эритроцитов, хотя именно такая ситуация реализуется при криоконсервировании. Поэтому необходимы дальнейшие исследования по изучению влияния более высоких концентрации различных веществ (больше 1,2 моль/л) на диффузию зондов в цитоплазме эритроцитов, что в свою очередь позволит выявить общие закономерности процессов, которые протекают в цитоплазме. клеток при замораживании-оттаивании.
Как указывалось выше, основным компонентом цитоплазмы эритроцитов является белок гемоглобин (95%) [139] и он может оказывать влияние на проницаемость эритроцитов для веществ и их диффузию в цитоплазме.
Однако изучению структурно-функционального состояния основной компоненты цитоплазмы клеток - белка посвящены единичные работы [50,174,191]. Так было установлено, что в гипертонических растворах максимум флуоресценции эритроцитов смещается в длинно- или коротковолновую область в зависимости от концентрации натрия хлорида [50]. Изучение форм гемоглобина внутри эритроцитов в зависимости от времени хранения в физиологических условиях показало [174], что содержание окси- и метгемоглобина меняется волнообразно и происходит стабилизация их уровня через 20 дней хранения эритроцитов. На основании исследований методом ЭПР спиновых меток и зондов липидов мембран и белков эритроцитов был сделан вывод о кооперативности структурных переходов белков эритроцитов в зависимости от температуры [191]. Гулевский [57] изучил влияние температуры, криопротекторов, осмолярности среды на проницаемость мембран эритроцитов их теней для ионов и метаболитов, а также на их сохранность в гипертонических растворах при замораживании. Было показано, что красные тени эритроцитов более устойчивы к повреждению, чем эритроциты и их плазматическая мембрана хорошо сохраняет барьерные свойства. На основании таких экспери ментов был сделан вывод о различии структурного состояния гемоглобина в цитоплазме эритроцитов и их теней [57]. Однако этих данных явно недостаточно для понимания процессов, которые протекают внутри клеток на этапах криоконсервирования. Так не изучено влияние концентраций различных веществ на соотношение форм гемоглобина внутри эритроцитов. В работе [50] представлены данные только по изучению положения максимума флуоресценции.
Необходимость выполнения данной работы, в силу ее важности, нашло отражение в научных программах Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины:
1. Тема №9, 2.2.6.9, шифр 2.28.3.1:2.28.3.2, номер госрегистрации 01944005297. "Исследование влияния температуры на структурное состояние изолированных и мембраносвязанных белков, в том числе в составе цитозоля и цитоскелета, на физико-химические процессы в среде инкубирования и на метаболизм в клетках с целью изучения криорезистентности клеточных структур».
2. Тема №69, 2.2.6.69, шифр 2.28.3.1:2.28.3.2. «Исследование влияния температуры на структурное состояние мембраны и цитозоля, а также на проницаемость для электролитов и неэлектролитов эритроцитов человека на различных стадиях развития и некоторых патологиях».
Государственного Фонда фундаментальных исследований:
1. Тема № 5/282, шифр "Иней" "Исследование проницаемости эритроцитов для электролитов и неэлектролитов с целью определения вклада в нее мембраны и физико-химических свойств внутри- и внеклеточных сред".
В связи с вышеизложенным пелыо настоящей работы явилось изучение влияния различных физико-химических факторов на структурно-функциональное состояние компонентов цитоплазмы эритроцитов и проницаемость их мембран для криопротекторов.
Для достижения поставленной цели было необходимо ртттмтт* следующие задачи: - изучить проницаемость эритроцитов человека для криопротекторов и влияние на нее температуры, концентрации внутриклеточного гемоглобина; - изучить влияние температуры, различных концентраций натрия хлорида, калия хлорида, сахарозы, глюкозы, 1,2- пропандиола, поливинилпирролидона-12600 на диффузию зонда ТЕМПОН в цитоплазме эритроцитов; изучить влияние концентрации натрия хлорида, калия хлорида и сахарозы на структурно-функциональное состояние внутриэритроцитарного гемоглобина; изучить влияние сочетания 1,2-пропандиола с хлоридом натрия, а также переохлаждения на сохранность эритроцитов; изучить влияние комбинаций высокомолекулярных (поливинилпирролидон-12600, полиэтиленоксид-1500, желатина, оксиэтилированный крахмал-180000) и низкомолекулярных веществ(сахароза, глюкоза, натрия хлорид, натрия гидроцитрат) на сохранность эритроцитов при криоконсервировании; теоретически обосновать подход для разработки экономичных криоконсервантов для криоконсервирования клеточных суспензий; - создать способ криоконсервирования эритроцитов человека при температуре -196 С.
Научная новизна полученных результатов. Впервые проведены систематические исследования проницаемости мембран эритроцитов для различных криопротекторов при температурах 0-10 С. Определены коэффициенты проницаемости и энергия активации процесса их проникновения. Показано, что ряд, который образуют криопротекторы по величине коэффициента проницаемости для эритроцитов человека, не полностью коррелирует с рядом, в котором последовательность определяется их размерами, лиотропными и диэлектрическими свойствами, а также количеством связанной с ними воды.
Впервые показано, что концентрация внутриклеточного белка оказывает влияние на коэффициент распределения различных веществ между эритроцитами и окружающей их средой, а также на скорость проникновения глицерина.
Исследовано состояние хромофорной группы внутриэритроцитарного гемоглобина в гипертонических растворах натрия, калия хлорида и сахарозы. Установлено, что в гипертонических растворах натрия и калия хлорида происходит изменение соотношение форм внутриклеточного гемоглобина (окси-, дезокси- и метгемоглобин), что указывает на изменение его конформации.
Впервые показано, что при повреждении эритроцитов в гипертонических растворах натрия и калия хлорида в первую очередь уменьшается количество клеток, содержащих большее количество оксигемоглобина, в то время как количество клеток, содержащих большее количество метгемоглобина, увеличивается.
Исследовано влияние различных концентраций натрия хлорида на первые производные спектров поглощения (ІШСП) глобулярной части внутриклеточного гемоглобина и впервые показано, что в гипертонических растворах происходит появление дополнительного отрицательного максимума на ППСП гемоглобина, что указывает на изменение его конформации.
Установлено, что отклонение от линейного характера зависимости времени корреляции вращательной диффузии спинового зонда ТЕМПОН в цитоплазме эритроцитов от концентрации внеклеточного вещества, связано с выходом из эритроцитов основной массы свободной воды.
Показано, что количество поврежденных эритроцитов не коррелирует с величиной переохлаждения суспензии клеток.
Причинами различий в их сохранности в этих условиях являются как сжатие, так и деформации сдвига, развивающиеся в узких каналах между кристаллами льда, в которые ^ вытесняются эритроциты при вымораживании воды в лед.
Впервые теоретически показано, что увеличение концентрации криопротектора в криоконсерванте позволяет уменьшить его количество, которое необходимо для криоконсервирования клеточных суспензий.
Обнаружено, что в присутствии эритроцитов, начиная с определенной их концентрации, происходит увеличение ) - экстинкции хромофорной группы внеклеточного метгемоглобина. ф Доказано, что увеличение концентрации клеток и натрия хлорида приводит к дальнейшему увеличению экстинкции внеклеточного метгемоглобина, в то время как криопротекторы ее уменьшают, начиная с определенной их концентрации. Кроме того, установлено, что в присутствии эритроцитов исчезает полоса поглощения внеклеточного метгемоглобина в диапазоне длин волн полосы Соре, хотя концентрация эритроцитов' уменьшена так, что экстинкция метгемоглобина соответствует ее - значению в надосадке без эритроцитов.
Изучено влияние сочетания различных высоко- и ' низкомолекулярных криопротекторов на сохранность эритроцитов. Установлено, что сочетание высоко- и низкомолекулярных криопротекторов позволяет уменьшить концентрацию низкомолекулярного криопротектора, увеличить диапазон скоростей замораживания, при которых сохранность клеток остается высокой. Кроме того, это улучшает результаты криоконсервирования эритроцитов при умеренно низких температурах.
Установлено, что 1,2-пропандиол и этиленгликоль при концентрациях выше 20% оказывают на эритроциты токсическое действие, которое способствует усилению повреждения эритроцитов в растворе натрия хлорида с концентрацией 3,2 моль/л (LD50).
Практическое значение полученных результатов. Показано, что увеличение концентрации криопротектора в составе криоконсерванта позволяет создавать экономичные, менее трудоемкие способы криоконсервирования клеточных суспензий. Созданы экономичные, эффективные и менее трудоемкие способы криоконсервирования эритроцитов человека при -196 и -85-Г-90 С.
Показано, что эритроциты при ресуспендировании (после центрифугирования) в том же гипертоническом растворе, в котором они находились перед центрифугированием, разру- шаются начиная с концентрации натрия хлорида 0,6 моль/л и более.
Предложен простой способ инициации кристаллов льда в контейнере, для предупреждения переохлаждения суспензии клеток при криоконсервировании, что позволяет уменьшить количество поврежденных клеток и получать их высокую морфо-функциональную сохранность.
Обнаруженное явление увеличения экстинкции хромофорной группы метгемоглобина в присутствии эритроцитов использовано для изучения влияния различных веществ на мембрану эритроцита.
Предложенные методы исследования проницаемости и дегидратации, а также другие методические подходы могут быть использованы для исследования и криоконсервирования других биологических объектов.
Личный вклад соискателя. В работах, которые опубликованы в соавторстве, диссертантом предложены идеи работ, методические подходы, готовились образцы. Соискатель принимал непосредственное участие в проведении экспериментов, лично проводил статистическую обработку результатов, принимал участие в научном обсуждении всех результатов, формулировал основное содержание выводов при помощи научного консультанта доктора биол. наук, проф. Моисеева В.А.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции «Магнитный резонанс в биол. и медиц.» (Черноголовка, 1989), на I съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994), на III съезде Украинского общества гематологов и трансфузиологов (Сумы, 1995), на I съезде Украинского общества криобиологии и криомедицины (Харьков, 1995), на международной конференции «Актуальные проблемы разработки и производства кровезаменителей и консервантов крови» (Минск 1994), на II съезде Украинского биофизического общества (Харьков, 1998 г.).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликована 21 статья в научных журналах, 9 тезисов и получено б авторских свидетельств и патентов.
Теоретический анализ проницаемости клеточных мембран для неэлектролитов
Если рассматривать систему, состоящую из вне- и внутриклеточных сред, разделенных избирательнопроницаемой мембраной, в изотермических условиях, то уравнение потока растворенного вещества через клеточную мембрану получают из уравнения Фика. Оно имеет вид [239] где 7/j - число молей растворенного внутри клетки вещества; / - время; Кг - коэффициент проницаемости мембраны для растворенного вещества который зависит от толщины мембраны; А - площадь мембраны; С ,С\ -концентрация растворенного вещества вне и внутри клетки, моль/л. Скорость изменения объема клетки при тех же условиях связана с разностью осмотических давлений следующим образом где Vі - объем клетки; К - коэффициент проницаемости мембраны для молекул воды; ІҐ,П - осмотическое давление внутри и вне клетки. Для разбавленных растворов где R - универсальная газовая постоянная; Т - температура в К. Включая ВТ в коэффициент проницаемости, получаем В случае, когда в растворе имеется несколько растворенных компонентов, обозначая концентрацию непроникающего растворенного вещества во внеклеточной среде - С, проникающего - С/, а концентрацию непроникающего вещества во внутриклеточной среде -С м, проникающего -C t и учитывая, что получим уравнение, которое использовал Джекобе для расчета коэффициента проницаемости [236] где N N ,- количество молей непроникающего и проникающего вещества внутри клетки соответственно. При наличии трансмембранной разности гидростатических давлений (Ар) в дополнение к перепаду осмотического, уравнение (1.6) обобщается и принимает вид Цейтен и Прескотт [337] в ходе экспериментов на икре рыб и лягушек установили, что в гипо- и гипертонических растворах уравнение (1.4) точно описывает изменения объема икринок рыб. Однако в экспериментах с изотоническими растворами, содержащими 10 - 15% тяжелой воды, было установлено, что ее поток через мембрану описывается уравнением и объем клеток при этом не меняется, т.е. # "/ # = 0. Согласно работе Цейтена и Прескотта [337] в экспериментах с изотоническими растворами, содержащими тяжелую воду, поток воды задается уравнением Так как концентрация тяжелой воды значительно больше, чем концентрация других растворенных веществ, то следовало бы ожидать, что dV /dt примет большое отрицательное значение в начале эксперимента из-за отрицательного знака при с/. Поскольку объем не меняется, авторы, на основании вышеизложенного, сделали вывод, что уравнение (1.4) не является справедливым. Их вывод основывался на том, что вода должна вести себя как обычное растворенное вещество, и поскольку его концентрация намного больше, чем концентрация других растворенных веществ, то объем клетки должен уменьшиться. Однако эксперименты показали, что объем не меняется, т.е. dV /dt = 0. Кроме того, Цейтен и Прескотт [337] показали, что проникновение тяжелой воды не описывается полностью уравнением (1.4). Было показано, что ее проникновение является более быстрым в гипотонических и более медленным в гипертонических растворах, а также не описывается уравнениями (1.1, 1.2, 1.6).
По данным Кадема и Качальского [239] уравнения (1.1, 1.2, 1.4, 1.6) не позволяют описывать и явления плазмолиза растительных клеток. Растительные клетки при погружении в воду набухают до некоторого максимального значения (Vm). При этом устанавливается разность гидростатического давления между вне- и внутриклеточными растворами, которая поддерживается за счет жесткости стенок клетки и разности концентраций растворенных веществ вне и внутри клетки v n не зависит от времени. При перенесении максимально набухшей клетки в раствор с концентрацией вещества меньшей, чем физиологическая, Ар постепенно уменьшается по мере выхода растворителя из клетки. До тех пор пока концентрация С, достаточно мала, изменение объема небольшое. При концентрации вещества выше определенного значения С? (плазмолитическая концентрация), начальная утечка растворителя из клетки становиться большой и объем клетки, на определенном этапе принимает первоначальное значение, которое в данном случае является минимальным объемом ушіл. В этой точке Ар = 0 и dV /dt=0. Если уравнение (1.2.1.6) справедливо, с учетом Z = 0, получим О = К„Л(№ т + Nlt )/Vl - С?) или С, = (N M - N[ )/V . Поскольку выход воды из клетки происходит значительно быстрее, чем проникновение растворенного вещества в нее, то количество проникшего в клетку вещества в точке у мало и N Jv намного меньше, чем Ctt так что величиной N jv можно пренебречь. Так как изменения объема малы, С -Сщ. Из этого уравнения, по мнению авторов, следует, что плазмолитическая концентрация может не зависеть от природы растворенного вещества. Однако эксперименты показывают, что отношение Cf/C , меняется в пределах от единицы до в сотни раз больших значений. Таким образом, по мнению Кадема и Канальского [239], уравнения (1.1, 1.2, 1.4, 1.6) адекватно не описывают проницаемость биологических мембран.
Исследование распределения криопротекторов между эритроцитами и внеклеточной средой методом ЯМР
Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) открытый в 1945 г. Перселлом, Тори, Паундом, Хансеном и Паккардом нашел самое широкое применение в различных областях физики, химии, биологии и медицины. Он основан на том, что ядра некоторых атомов имеют спин /й, измеряемый в единицах h= Ь/2к (А постоянная Планка). Спин имеет полуцелые значения, кратные 1/2. Наличие спина у заряженного ядра приводит к возникновению магнитного момента //„, пропорционального спину /[61,76] где yN - гиромагнитное отношение ядра; gN - g-фактор (определяется природой ядра); fiN = eh/2Mc - ядерный магнетон; е, М - заряд и масса протона соответственно; с -скорость света в вакууме. В соответствии с квантовой теорией состояния ядерного спина (/л,) квантованы, т.е. тг принимает только одно из значений дискретного набора +1, +(1-1), ..., -I. Для протона I может принимать значения +1/2 и -1/2. В дальнейшем речь идет о протонном ядерном магнитном резонансе (ХН-ЯМР), так как он применен нами для определения концентрации криопротекторов вне и внутри эритроцитов. В постоянном магнитном поле Н энергетические уровни протона имеют такой же вид, что и для электрона, но состоянию с меньшей энергией соответствует значение /22,=+1/2, так как fiN положителен и ядерный спиновый момент параллелен внешнему магнитному полю Н. Поскольку дальнейший ход рассуждений аналогичен с подходом, примененным для электронного спинового резонанса, то гамильтониан для спина ядра имеет вид который переходит в когда внешнее магнитное поле Л" направлено вдоль оси z. Распределение спинов между этими двумя состояниями подчиняется закону Больцмана и отношение числа спинов Щ в состоянии \р , к числу спинов Na в состоянии \а , равно где АЕ - разность энергии между состояниями \а и /? , равная guPtfH; к - постоянная Больцмана; Т - температура в К. Частота осциллирующего поля должна удовлетворять условию резонанса где о - частота осциллирующего поля; Поскольку ядерный g-фактор и спин определяются природой ядра, то для разных ядер требуются разные Н и и. Однако больший интерес представляет возможность отличить некоторое ядро, находящееся в определенном окружении, от того же ядра, но находящегося в другом окружении. В методе ЯМР это возможно, так как на резонансную частоту отдельных ядер оказывает влияние распределение электронов в химических связях молекулы, т.е. резонансная частота ядра зависит от структуры молекулы. Таким образом, различное химическое окружение приводит к смещению резонансной частоты (и), что получило название "химический сдвиг резонансной частоты" или просто "химический сдвиг". Это приводит к тому, что при записи спектров ядер, имеющих различное химическое окружение, они оказываются в различных местах спектра. Химический сдвиг измеряют, относительно сигнала эталонного образца, которым чаще всего служит тетраметилсилан (ТМС). В качестве единиц измерения служат миллионные доли (м.д.), определяемые по формуле где и0 - рабочая частота спектрометра; оь - резонансная частота исследуемого образца; иэ - резонансная частота эталонного образца. В ст-шкале положение сигнала ТМС принимают за 0, а в г-шкале - за 10 м.д. г = 10.0 - ст. В случае перекрывания сигналов используют другой эталон. Так как при -ЯМР вклад в спектр дают только ядра протонов, то площадь под спектром протонов прямо пропорциональна их количеству. Это свойство спектра Н-ЯМР позволяет определять количество и концентрацию криопротекторов, так как все они содержат протоны. Вышеизложенное позволяет определить проницаемость биообъектов для криопротекторов и константу их распределения между окружающей средой и биообъектом, что и использовано нами в нашей работе. Для определения концентрации криопротектора в надосадке или в осадке сначала записывали спектры -ЯМР криопротектора с известной его концентрацией С0 (1%) воды и стандарта. После этого вычисляли отношение интегральной интенсивности спектра одной из групп криопротектора (10), содержащей протоны (-СН, -СН2, -ОН), к интегральной интенсивности спектра воды (1 ) Аналогично определяли отношение и для исследуемого образца, где концентрация криопротектора (Ck ) неизвестна: Затем концентрацию криопротектора вычисляли по формуле, полученной из соответствующей пропорции:
Влияние концентрации внутриклеточного белка на проницаемость мембран эритроцитов для глицерина
Согласно сорбционной гипотезе [134,181] на транспорт веществ в клетку оказывает влияние внутриклеточное содержимое. Однако до сих пор не изучено влияние основного компонента внутриклеточного содержимого - белка на проницаемость клеток. В связи с этим нами исследована проницаемость мембран эритроцитов человека для глицерина в зависимости от концентрации в них гемоглобина.
Красные тени эритроцитов получали, как описано ранее [333]. В связи с отсутствием данных по содержанию гемоглобина в красных тенях эритроцитов по отношению к интактным эритроцитам мы провели эксперименты с целью его определения.
Для этого красные тени, полученные описанным выше способом, разводили так, чтобы оптическая плотность гемолизата была 0,1 1,0 (Dt ). Затем, в камере Горяева считали число красных теней по общепринятой методике [170] и находили среднее число клеток в 1 большом квадрате (Nt). Аналогичнымф образом разводили эритроциты и определяли среднее число клеток приходящихся на 1 большой квадрат (Ne) и соответствующее им значение оптической плотности (De ). Так как число красных теней и эритроцитов в 1 большом квадрате оказывалось различным (всегда было больше число теней), то оптическую плотность, которая соответствовала числу красных теней (Dt) пересчитывали с учетом того, что число красных теней в одном большом квадрате должно быть равно числу эритроцитов в таком же квадрате, т.е.Принимая оптическую плотность, соответствующую эритроцитам за 100%, находили содержание гемоглобина в красных тенях эритроцитов по отношению к интактным эритроцитам по формуле
Содержание гемоглобина в красных тенях полученных из крови различных доноров составило 29,7±3,5%. Учитывая, что объем теней 113 мкм3 (тени имели форму сферы), а эритроцитов 63 мкм3, то содержание гемоглобина в тенях составляет 16,6%, что существенно меньше, чем данные литературы (25-30%) [57]. Исследование проницаемости мембран красных теней для глицерина 20% проводили, методом ЭПР спинового зонда.
Данные по кинетике проникновения 20% глицерина при 0 С в интактные эритроциты представлены на рис.З.б. Из рис. 3.6 видно, что процесс проникновения глицерина завершается через 30 мин. Коэффициент проницаемости мембран эритроцитов для глицерина, рассчитанный с использованием уравнения (3.4), был равен (0,67+0,03)-10-5 см/мин.
Кинетика проникновения 20% глицерина при О С в красные тени эритроцитов представлена на рис. 3.7 (кривая 1). Из рис.3.7 видно, что процесс проникновения глицерина завершается в течение 4ч-5 мин, в то время как для интактных эритроцитов процесс завершался за -30 мин. Коэффициент проницаемости мембран красных теней эритроцитов для глицерина, рассчитанный по уравнению (3.4), был равен (9,7±0,4)-10 5см/мин.
Для изучения влияния повышения концентрациивнутриклеточного белка гемоглобина (дегидратация) напроницаемость мембран интактные эритроциты помещены в гипертонический раствор хлорида натрия (0,4 моль/л) 1:10 и удален надосадок после осаждения эритроцитов путем центрифугирования. Затем к эритромассе добавлен раствор 1:1 содержащий 0,4 моль/л хлорид натрия (с учетом концентрации ферроцианида калия 0,1 моль/л), 20% глицерина, зонд ТЕМПОН 10"3 моль/л и изучена кинетика проникновения глицерина (рис. 3.7, прямая 3). Из рис. 3.7 видно, что кинетика проникновения глицерина не регистрируется. Дополнительное исследование методом ХН-ЯМР спектроскопии показало, что концентрация глицерина в эритромассе через 20 мин достоверно не отличалась от концентрации, которая была определена через 2 мин после добавления криоконсерванта.
Для выяснения характера влияния концентрации моль/л. электролита на проницаемость мембран эритроцитов проведеныаналогичные эксперименты на красных тенях эритроцитов, сдобавлением к ним 0,4 моль/л натрия хлорида (рис. 3.7). Из рисунка видно, что кинетика проникновения глицерина наблюдается достаточно хорошо. Этот результат показывает, что одной из причин блока проницаемости мембран эритроцитов для глицерина при увеличении концентрации натрия хлорида во внеклеточной среде до 0,4 моль/л является не изменения в мембране под влиянием электролита, а . повышение концентрации гемоглобина в эритроцитах в результате их дегидратации. Это, в свою очередь, может привести к повьипению адсорбции гемоглобина компонентами мембраны и к уменьшению скорости проникновения криопротекторов в эритроциты. Так как методом -ЯМР не удалось однозначно определить проникновение глицерина в эритроциты в присутствии 0,4 моль/л натрия хлорида, то после 20 мин эквилибрации эритроциты были переведены в физиологический раствор. При этом произошел гемолиз эритроцитов, что указывает на проникновение в них глицерина, хотя и в небольших количествах. Таким образом, уменьшение концентрации гемоглобина в эритроцитах от 100 до 16,6% приводит к увеличению коэффициента проницаемости их мембран для глицерина более чем в 10 раз. Увеличение концентрации гемоглобина помещением, эритроцитов в раствор натрия хлорида 0,4 моль/л приводит к резкому уменьшению скорости проникновения глицерина, что не удается наблюдать кинетику его проникновения.
Причиной резкого уменьшения скорости проникновенияглицерина в эритроциты, по-видимому, является увеличение количества гемоглобина, связанного с цитоскелетом и мембранными белками, в результате выраженного повышения концентрации гемоглобина в цитоплазме эритроцитов (эритроциты при такой концентрации натрия хлорида дегидратируются почти на 50%, т.е. концентрация гемоглобина увеличивается почти на 70%), что приводит к резкому снижению скорости проникновения глицерина через каналы его транспорта. Так известно [225], что внутриклеточный гемоглобин взаимодействует с белками мембраны, цитоскелета и влияет на вязко-эластические свойства мембраны [287,308]. Вполне понятно, что количество гемоглобина, связанного с мембранными и цитоскелетными белками, увеличивается при увеличении его концентрации, что может и привести к резкому снижению скорости проникновения глицерина в результате блока проницаемости каналов транспорта глицерина и увеличения вязкости в примембранном неперемешиваемом слое. Кроме того, было показано, что дегидратация эритроцитов увеличивает ВКВД зонда, находящегося в липидной матрице эритроцитов [190,191].
Уменьшение концентрации внутриклеточного гемоглобина приведет к уменьшению его количества связанного с мембранами и цитоскелетными белками и, соответственно, может привести к увеличению скорости проникновения в них глицерина. В красных тенях эритроцитов гемоглобина более чем в 6 раз меньше, чем в интактных эритроцитах, что естественно может привести не только к снятию блока проницаемости каналов транспорта глицерина, но и к уменьшению вязкости в примембранном неперемепіиваемом слое, который также может оказывать существенное влияние на скорость проникновения веществ в
Влияние температуры на время корреляции вращательной диффузии зонда ТЕМПОН в цитоплазме и во внеклеточном растворе
Влияние температуры на время корреляции вращательной диффузии зонда ТЕМПОН в цитоплазме и во внеклеточном растворе. Известно [28], что время корреляции вращательной диффузии спинового зонда увеличивается при понижении температуры и, как правило, эта зависимость выражается формулой где хс, т0 - время корреляции вращательной диффузии спинового зонда при данной и высоких температурах соответственно; Е - энергия активации вращательной диффузии; Т - температура в К; к - постоянная Больцмана. Справедливость этой формулы доказана многочисленными исследованиями как на растворах низкомолекулярных веществ [28], так и на полимерах [172]. Ранее мы . изучили влияние температуры и концентраций различных веществ на микровязкость цитоплазмы эритроцитов [110,112], и ВКВД зонда ТЕМПОН увеличивалась в ней при понижении температуры и повышении концентрации различных веществ. В изученном диапазоне температур наблюдались зависимости согласующиеся с формулой (4.1,;). Изучение эритроцитов плода человека, которые содержат больше воды, показало [53], что микровязкость их цитоплазмы меньше, чем микровязкость цитоплазмы эритроцитов взрослого человека и эти различия сохраняются в диапазоне концентраций натрия хлорида 0,15-т-1,6 моль/л (исходная концентрация) и в температурном диапазоне 25-fO С. Эти изменения также согласуются с существующими представлениями о влиянии концентрации натрия хлорида и температуры на ВКВД спинового зонда ТЕМПОН в цитоплазме эритроцитов. В настоящем опубликовано достаточно большое число работ, посвященных исследованию растворов методом ЭПР спинового зонда [28,86,87,96,172], и единичные работы по исследованию цитоплазмы клеток [133,191,235]. Однако практически нет работ, в которых приведены данные по сравнительному исследованию хс цитоплазмы и внеклеточных растворов при охлаждении и замораживании суспензий клеток. Для проведения таких исследований эритроциты донорской крови человека готовили, как описано ранее. Все растворы, содержали ферроцианид калия 0,10, зонд ТЕМПОН 10"4-т-5«10"4 моль/л, соответствующий криопротектор (или без него). Соотношение эритромасса:раствор было 1:1.
Проведенные нами ранее исследования показали [108], что при кристаллизации воды в растворе натрия хлорида (0,15 моль/л) микровязкость раствора уменьшается, в то время как в цитоплазме эритроцитов повышается почти в 5 раз. В присутствии 1,2-ПД (23% в надосадке от эритроцитов) микровязкость во внеклеточной среде увеличивается, а в цитоплазме ее увеличение менее выражено (почти в 4 раза), чем в растворе натрия хлорида. Микровязкость в цитоплазме эритроцитов при наличии во внеклеточной среде сахарозы, в целом, носила такой же характер, как и в растворе натрия хлорида, но во внеклеточной среде она была выше в присутствии сахарозы. При проведении таких исследований было рассчитано тс по формуле (2.39), которая позволяет рассчитывать его при быстром вращении до v=l/-cc=2-108 с 1. На основании этих исследований был сделан вывод, что при наличии во внеклеточной среде непроникающих низкомолекулярных веществ возрастает градиент осмотического давления на мембране эритроцитов при фазовом переходе воды в лед, в то время как в присутствии 1,2-ПД он менее выражен.
Для определения хс при более высоких его значениях был использован атлас спектров ЭПР [11]. На рис 4.7 представлены результаты исследования влияния 1,2-ПД на спектры ЭПР ТЕМПОН при различных температурах в надосадке и цитоплазме эритроцитов. Из рис. 4.7 видно, что в спектре ТЕМПОН, находящегося во внеклеточной среде, при -40 С левее низкопольной компоненты h+1 появляется новая компонента, которая характерна для зонда с анизотропным вращением с тс 2-10"8 с. При -50 С спектр ТЕМПОН близок к спектру зонда с хс 1-10 7 с. Этот спектр отличается от спектра зонда, который изотропно вращается в растворе 1,2-ПД 60% (на дистиллированной воде) при -38 (хс 7 10"9 с) и -48 С (хс 1-10"7 с). В цитоплазме эритроцитов в присутствии 1,2-ПД (23% конечная концентрация в надосадке) появление новой компоненты на спектре ТЕМПОН четко выражено при -40 С. Однако первые ее признаки отмечались при -36 С, что указывает на более высокую микровязкость цитоплазмы эритроцитов по сравнению с внеклеточным раствором. Эти отличия между надосадком и цитоплазмой связаны с наличием в цитоплазме высокомолекулярного белка гемоглобина. При наличии во внеклеточной среде сахарозы (рис. 4.8) появление новой компоненты на спектре ТЕМПОН, находящегося во внеклеточной среде, отмечается при -20 С (рис. 4.8 спектры 1,2), в то время как в цитоплазме эритроцитов ее первые признаки отмечаются уже при -15 С (спектры 3,4). В случае, когда эритроциты находятся в физиологическом растворе натрия хлорида, появление новой компоненты в спектре ТЕМПОН, находящегося в цитоплазме эритроцитов отмечается, как и в растворе сахарозы при -15 С. Во внеклеточной среде (раствор натрия хлорида 0,15 моль/л) появление новой компоненты не отмечалось, более того эвтектическая смесь натрия хлорида, которая образовывалась
