Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Биоэкология возбудителей токсокароза в условиях мегаполиса
1.1 Обзор литературы 13
1.1.1 Анализ зоонозного потенциала Toxocara сanis и T.cati 13
1.1.2 Эпизоотология токсокароза плотоядных 17
1.1.3 Обсемененность объектов внешней среды яйцами и личинками токсокар, их выживаемость и развитие
1.1.4 Копрологические методы диагностики токсокароза и исследования объектов внешней среды
1.2 Материалы и методы исследований 38
1.2.1 Сбор проб кала и методы исследования 39
1.2.2 Гельминтологическое вскрытие 39
1.2.3 Способ выделения личинок T.canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных
1.2.4 Исследование объектов внешней среды 41
1.3 Результаты исследований 42
1.3.1 Сравнительная эффективность методов копрологической диагностики токсокароза
1.3.2 Распространение основных паразитозов желудочно- кишечного тракта в популяции животных мегаполиса
1.3.3 Способ выделения личинок T.canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных
1.3.4 Исследование объектов внешней среды 49
Заключение по главе 1 З
ГЛАВА 2. Методы исследования нуклеотидных последовательностей ядерной и митохондриальной днк при дифференциации двух видов нематод рода тoxocara (сем. аscarididae, аscaridina)
2.1 Обзор литературы 59
2.1.1 Нуклеотидные последовательности рибосомальной ДНК 60
2.1.2 Нуклеотидные последовательности ITS участка ядерной ДНК 61
2.1.3 Нуклеотидные последовательности митохондриальной ДНК 63 (мтДНК)
2.1.4 Полимеразная цепная реакция 71
2.2 Материалы и методы исследований 73
2.2.1. Выделение ДНК 74
2.2.1.1 Выделение ДНК при помощи набора фирмы «Promega» 74
2.2.1.2 Протеиназный метод 2.2.2 Проведение ПЦР 75
2.2.3 Визуализация результатов ПЦР 76
2.2.4 Очистка ДНК 78
2.2.5 Метод векторного клонирования 79
2.3 Результаты исследований 80
2.3.1 Нуклеотидные последовательности большой субъединицы 81 рибосомы (LSU) ядерной ДНК T.сanis и T.сati
2.3.2 Нуклеотидные последовательности ITS участка ядерной ДНК 81 T.сanis и T.сati
2.3.3 Нуклеотидные последовательности цитохромоксидазы I 91 (CoxI) митохондриальной ДНК T.сanis и T.сati
2.3.4 Результаты клонирования 92
Заключение по главе 2 93
ГЛАВА 3. Диагностика Токсокароза иммуноферментной реакцией (ИФА, ELISA)
3.1 Обзор литературы 95
3.1.1. Имунный ответ хозяина при токсокарозе 95
3.1.2. Антигены токсокар 103
3.1.3. Серологические методы диагностики токсокароза 110
3.2 Материалы и методы исследований 120
3.2.1 Отбор сывороток крови 120
3.2.2 Получение соматического антигена 121
3.2.3 Постановка иммуноферментной реакции 121
3.3 Результаты исследований 123
3.3.1 Определение оптимальной концентрации антигена 123
3.3.2 Определение оптимального режима сорбции антигена на планшетах
3.3.3 Определение оптимального диагностического титра исследуемых сывороток крови плотоядных
3.3.4 Определение оптимального разведения конъюгата 127
3.3.5 Определение оптимальных режимов работы с субстратом 127
3.3.6 Определение чувствительности и специфичности ИФА при диагностике спонтанного токсокароза плотоядных
3.3.7 Сероэпизоотологический контроль над токсокарозом 132
плотоядных с помощью ИФА
Заключение по главе 3 133
Обсуждение 135
Выводы 148
Практические предложения 150
Список сокращений и условных обозначений 151
Список литературы
- Эпизоотология токсокароза плотоядных
- Нуклеотидные последовательности митохондриальной ДНК 63 (мтДНК)
- Имунный ответ хозяина при токсокарозе
- Определение оптимального диагностического титра исследуемых сывороток крови плотоядных
Введение к работе
Актуальность темы. Важным звеном в борьбе с гельминтозами являются знание жизненного цикла, путей передачи возбудителей и экологических условий, необходимых для выживания паразитов. Инструментами для контроля над паразитарными болезнями животных, возбудители которых вызывают патологию в организме хозяина – животных и человека, служат диагностика и мониторинг. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (2004) каждый третий житель Европы страдает тем или иным паразитозом, который способен длительное время воздействовать на организм человека. Например, около двух миллиардов человек инфицированы гельминтами, передающимися через почву, такими, как нематоды Necator и Ancylostoma, власоглавами Trichuris и аскаридами отряда (X.Q еt al., 2015).
Нематоды рода Toxocara (Stiles, 1905) – широко распространенные паразиты, вызывающие зооантропозоонозные болезни. Токсокароз у человека – личиночный, хронически протекающий, тканевой гельминтоз (шифр по Международной классификации болезней МКБ10-В83.0). Медицинскими врачами отмечается, что наиболее часто болезни подвержены дети. Но, по мнению исследователей (Н.И.Тумольская и др., 2004; Н.Замазий, О.А.Здор, 2005), занимающихся этим актуальным вопросом, практические врачи о токсокарозе знают весьма немного. И поскольку не все случаи заболевания регистрируются, точно оценить степень распространения ларвального токсокароза среди людей до настоящего времени остается очень сложно.
Половозрелая форма возбудителей токсокароза плотоядных локализуется в
их желудочно-кишечном тракте, являясь частой причиной патологий органов
пищеварительной системы. Кроме того, ветеринарными врачами
зарегистрировано, что болезнь проявляется наиболее яркими клиническими признаками во время миграции личинок – кашлем, пенистыми носовыми кровотечениями, диареей, аллергическими реакциями (Е.Н.Борзунов, 2002; И.Н.Ратникова, 2002; И.Н.Дубина, 2003).
Эпидемическая опасность, которую представляют зараженные токсокарами собаки и кошки, была доказана в XX веке: в 1950 году Campbell-Wilder описала глазные гранулемы у людей, вызванные личинками этого гельминта (P.Todorov, D.P.Stoynov, 1966). Несмотря на данный факт, значение Toxocara cati в патологии человека для практикующих врачей до настоящего времени остается неоднозначно (М.Fisher, 2003).
Домашние плотоядные играют ведущую роль в формировании биоэкологических особенностей возбудителя и поддержании антропургических очагов токсокароза. Данные факты обусловлены значительным скоплением плотоядных животных в мегаполисах, в том числе безнадзорных, отсутствием
должных санитарных мероприятий, высокой степенью пораженности
токсокарами домашних плотоядных. Сочетание благоприятных для паразита условий способствует многократному заражению животных и делает собак и кошек постоянным источником загрязнения окружающей среды инвазионным началом, и одним из важных эпидемиологических компонентов урбанистической среды. По данным Комиссии по экологической политике московской городской думы, ежегодно прирост поголовья бродячих животных в столице составляет от 2 до 5 тысяч, а Россия занимает второе место в мире после США по числу домашних животных на душу населения (М.В.Гузеева, 2009).
Toxocara sp. могут передаваться человеку через объекты внешней среды, при потреблении загрязненных инвазионными яйцами свежих овощей, фруктов и зелени (L.Glickman, P.Shantz, 1981; C. De Oliveira, P.Germano, 1992; А.Я.Лысенко, 2000; Т.Н.Замазий, О.А.Здор, 2005; О.В.Фадеева, 2007). В литературе имеются указания на возможность заражения человека токсокарозом при поедании сырой печени свиней, уток, крупного рогатого скота или других органов и тканей паратенических хозяев (цыплят, ягнят, голубей), инвазированных личинками. Также распространение инвазионных яиц происходит с калом насекомых, в организме которых после поедания яиц их инвазионные свойства не теряются (Y.Morimatsu et al., 2006). Доказано сохранение и накопление инвазионных яиц в воде (С.А.Беэр, Г.И.Новосильцев, Л.И.Мельникова, 1999). При этом ведущую роль в заражении человека играет почва, куда инвазионный материал поступает с калом плотоядных животных и личинки развиваются до инвазионной стадии за 19-35 дней (J.F.A.Sprent, 1956, 1958).
Симптомы проявления болезни у людей очень разнообразны. Клинические проявления, связанные с токсокарозом, классифицируются как висцеральная мигрирующая личинка, глазная мигрирующая личинка, скрытый токсокароз и нейротоксокароз (C. De Oliveira, P.Germano, 1992; В.Hoffmeister et al., 2007; Y.Morimatsu et al., 2008; S.Khademvatan et al., 2013).
Нельзя забывать, что борьба с паразитарными болезнями требует оптимизации и комплексного сочетания современных технологий, научно обоснованного подхода к разработке программ по их выявлению и профилактике. За последние несколько лет отмечается значительный прогресс в диагностике паразитов собак и кошек, идущий параллельно с приобретением новых знаний в их биологии, но до сих пор еще существуют пробелы в этой области (D.Otranto, 2015). Ученые-ветеринары не прекращают исследовательскую работу по изучению паразито-хозяинных отношений, определению общих и специфических белков, совершенствованию диагностики и профилактики. Успешные и результативные работы в этом направлении приведут к снижению
инвазированности окружающей среды и к снижению риска заражения гельминтами животных и человека (И.Г.Гламаздин, 2005).
В последние годы произошли важные методические достижения в
диагностике многих заболеваний, но есть значительные проблемы в лабораторной
диагностике токсокароза из-за трудоемкого процесса получения антигенов или
высоких затрат при закупке коммерческих диагностических наборов (S.Sahu et
al.,2013). Возникают трудности в получении образцов для научно-
исследовательских целей в результате этических проблем, инвазивного характера
процедур отбора проб, их неправильного хранения, а также низкой
чувствительности используемых методов. Это представляет серьезные
препятствия в диагностике паразитарных заболеваний. Другие препятствия зачастую связаны с биологией паразитов или просто с тем, что значение некоторых паразитов домашних животных в значительной степени игнорируется в научном сообществе (D.Otranto, 2015).
По нашему мнению, актуальным является сравнительный анализ классических копрологических методов, их современных модификаций, разработка серологических и молекулярно-генетических тестов. Выявление ДНК возбудителей позволит разработать корректную диагностику и надежный мониторинг в ситуации, когда болезни вызываются близкородственными видами и требуется видовое определение особей, которые могут участвовать в патологии человека и животных в мегаполисе. Использование молекулярных инструментов, в комбинации с традиционными паразитологическими и серологическими методами, даст возможность полно охарактеризовать зоонозный потенциал двух видов токскокар – Toxocara canis (Werner, 1782) и T.cati (Schrank, 1788). Решение обозначенных вопросов приведет к своевременному и надежному контролю над токсокарозом, оценки биологической безопасности окружающей среды и продуктов питания.
Степень разработанности темы. Актуальность проблемы токсокароза
привлекает внимание многих исследователей. В научной литературе описаны
морфологические, копрологические, иммунологические и генетические
характеристики возбудителей токсокароза. Однако, на сегодняшний день, данные по возбудителям и болезни являются разобщенными и неполными, к тому же, несмотря на то, что современные диагностические методы постоянно совершенствуются, на коммерческом рынке страны до сих пор не предлагается надежная система, состоящая из нескольких тестов для распознавания токсокароза животных.
Цель и задачи исследований. Сравнительная оценка эффективности молекулярно-генетических и традиционных методов для изучения биоэкологии возбудителей и диагностики токсокароза животных.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить сравнительную эффективность копрологических методов диагностики.
-
Разработать способ выделения личинок токсокар из паренхиматозных органов и тканей плотоядных животных методом переваривания.
-
Освоить генетические методы исследования.
-
Провести анализ генетических характеристик двух видов токсокар.
-
Разработать лабораторный вариант тест-системы на основе ИФА.
-
Изучить биоэкологические аспекты развития возбудителей токсокароза животных в условиях мегаполиса.
Научная новизна. Научная новизна подтверждена получением патента на
изобретение «Способ выделения личинок T.canis методом переваривания
паренхимы легких и печени плотоядных животных» № 2567845 от 12.10.2015. По
результатам собственных генетических экспериментальных исследований и
BLAST-алгоритма проведен анализ генетических характеристик двух видов
токсокар. Разработан лабораторный вариант тест-системы на основе
иммуноферментного анализа. Проведено изучение биоэкологических аспектов развития возбудителей токсокароза в условиях Москвы.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе проведенных исследований изучена сравнительная эффективность разных диагностических методов, основанных на различных принципах определения возбудителя болезни. Обоснованы подходы в определении генетических различий двух видов токсокар – T.сanis и T.сati. Усовершенствован метод посмертной лабораторной диагностики токсокароза на личиночной стадии, предложен метод переваривания ткани в искусственном желудочном соке. Определена эффективность выявления больных животных-носителей токсокар тест-системой на основе ИФА.
Методология и методы исследований. В ходе научных исследований разработана динамичная и субординированная система приемов и методов для изучения закономерностей развития паразитарных систем, основанная на особенностях биологии гельминтов в мегаполисе. Методы исследования были подобраны на основе разных принципов изучения паразитов, паразито-хозяинных отношений, прижизненной и посмертной диагностики токсокароза, а также контроля объектов внешней среды. В своих исследованиях использовали:
гельминтологические, микроскопические, иммунологические и молекулярно-генетические методы.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Результаты сравнительной эффективности копрологических исследований.
-
Распространение токсокароза плотоядных в условиях мегаполиса.
-
Способ выделения личинок токсокар методом переваривания из органов и тканей плотоядных животных.
-
Результаты генетических исследований возбудителей токсокароза.
-
Эффективность ИФА при спонтанном токсокарозе плотоядных.
-
Сероэпизоотология токсокароза собак и кошек.
-
Биоэкологические аспекты развития возбудителей токсокароза в условиях мегаполиса.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обоснована большим объемом исследований, применением стандартных методов и их модификаций. Получен патент на изобретение «Способ выделения личинок T.canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных» № 2567845 от 12.10.2015.
Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Х-ХIII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» в 2012-2015 гг. (Москва, МГУПП), на Всероссийской научной конференции с международным участием: «Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес» 23-24 апреля 2013 г. (Астрахань), на международной конференции молодых ученых «Проблемы пищевой безопасности» в 2013 г. (Москва, МГУПП), на Всероссийской научно-практической конференции «Молодежная наука 2014: технологии, инновации» 11-14 марта 2014 г. (Пермь), на Международной научной конференции «Систематика и экология паразитов» 3-5 ноября 2014 г. (Москва, Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. Северцова РАН), на научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», 19-21 мая 2014 и 2015 г. (Москва, ФГБНУ ВНИИП им. К.И. Скрябина), на 25-й Международной конференции the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, Ливерпуль, Великобритания, 16-20 августа 2015 г. Методические рекомендации рассмотрены и доложены на заседании секции «Инвазионные болезни животных» 27 февраля 2014 г. (протокол №1).
Реализация результатов исследований. Результаты исследований включены в отчет по гранту РНФ № 14-16-00026 «Разработка инновационных
средств диагностики, профилактики и терапии социально-опасных паразитозов
человека и животных на основе изучения молекулярно-генетических и
адаптационных особенностей их возбудителей», в отчет по научной работе
ветеринарно-санитарного факультета МГУПП. Современные данные,
полученные по биоэкологии паразитов в мегаполисе, используются в учебном
процессе МГУПП и при разработке образовательных программ по
дополнительному профессиональному образованию руководителей и
специалистов ветеринарных служб и при проведении занятий в ФГБОУ ДПО «РАКО АПК».
Основные результаты исследований проведены автором самостоятельно. Статьи, написанные в соавторстве, включают более 80% материалов диссертационной работы. Соавторы не возражают в использовании результатов совместных исследований (справки предоставлены в диссертационный совет).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации
опубликованы 3 печатные работы в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ, 1 патент и 13 работ в других журналах и сборниках трудов.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 183 страницах компьютерного текста и состоит из трех глав, каждая из которых включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования и заключение, обсуждение, общие выводы, список сокращений и условных обозначений, словарь терминов, список литературы и приложения. Список литературы включает 247 источников, в том числе 130 отечественных и 117 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 47 рисунками, 2 схемами и 1 графиком.
Благодарности. Автор благодарна своему научному руководителю Гламаздину Игорю Геннадьевичу, искренне признательна всем сотрудникам ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени К.И. Скрябина» и лаборатории фауны и систематики паразитов Центра паразитологии института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, а особенную признательность выражает заведующему лабораторией, вед.н.с., д.б.н. Сергею Эдуардовичу Спиридонову за всестороннюю поддержку и ценные замечания при выполнении работы.
Эпизоотология токсокароза плотоядных
Токсокароз является заболеванием, которое имеет широкое распространение и играет важную роль в патологии плотоядных животных, особенно молодняка в возрасте до 1 года [34]. Результаты обследований домашних животных во всем мире показали пораженность собак кишечным токсокарозом от 3% до 81% [10, 149, 165, 184, 186, 192, 198, 210, 238, 241], а средний показатель составляет 15,2% [162]. По обобщенным данным, в США токсокарами заражено в среднем 80% щенков и 20% взрослых собак [23]. Установлена высокая зараженность собак токсокарами в городах Канады и Великобритании [224]. В Ереване отмечена экстенсивность инвазии (ЭИ) 44,26% у городских собак [23]. На Украине, по данным исследования, проведенного в Черновцах, у 19,2% собак обнаружены яйца Т.саnis [129].
Общая экстенсивность инвазии (ЭИ) бездомных и владельческих собак при вольном содержании, также достигает 100% [8, 61, 77]. Высокая напряженность эпизоотического процесса является следствием пожизненного носительства личинок T.canis и трансплацентарной передачей их во второй половине беременности [22, 83, 112, 231]. Доказано, что у собак часть личинок, сохранившихся в тканях, может продолжать миграцию в течение нескольких лет после заражения, активизируясь при беременности и лактации, и передаваться щенкам трансплацентарно и трансмаммарно [232].
Токсокароз собак широко распространен в мегаполисе Москва. При исследовании городских собак А.Ф.Фархутдинова выявила ЭИ 50%. По данным Ф.И.Василевича и В.Н.Шевкопляса (2012), зараженность токсокарозом бродячих собак в городе достигает 55% [20].
Зараженность домашних кошек токсокарозом в городах США составляет 25-75%, в Великобритании – 11,5-39,9%, в Чехословакии – 14-28%, Дании – 79%, Польше – 45%, Венгрии – 50%, Греции – 66,7%, ФРГ – 64,8%, Швеции – 47%, Франции – 65,4%, Бельгии – 65,2%, Швейцарии – 14,9-22,8%, Австралии – 24,5-57,2%, Новой Зеландии – 24,7%, Египте 22,3-40%, Иордании – 14,5-20,5% [24, 136, 142, 185, 199].
В популяции кошек на территории Российской Федерации ЭИ составляет от 15 до 55,2%, у бездомных кошек ЭИ достигает 91% [19, 24, 55, 103, 109, 111, 117, 121]. Такая высокая ЭИ определяется возможностью алиментарного заражения (при загрязнении кормов, воды, слизывания инвазионных яиц с шерсти, поедании паратенических хозяев) и трансмаммарной передачей [231].
Немалое распространение и роль токсокары имеют среди популяций пушных и диких животных. В зверохозяйствах при иследовании фекалий плотоядных семейства собачьих (песцов, серебристо-черных и рыжих лисиц, енотовидных собак) методом Фюллеборна установлена ЭИ Т.canis – 10,26% [88]. При гельминтологическом вскрытии диких животных в Кировской области Т.cati выявлена у всех исследованных рысей, Т.canis – у всех волчат и у 4,35% и 11,43% взрослых лисиц и волков, соответственно [48].
В.А.Васильева провела изучение распространения токсокароза в Пензе и Пензенской области. По результатам исследований был установлен наибольший процент заражения у молодых животных до 6-месячного возраста, что составило у песцов – 20,0%, енотовидных собак – 26,7%, лисиц – 7,6%. У животных старше 6 месяцев: песцов – 1,0%, енотовидных собак – 17,0%, лисиц – 2,85%. При гельминтологическом вскрытии диких животных гельминты были выявлены у всех исследованных рысей и волчат [21].
В Краснодарском крае методом полных гельминтологических вскрытий исследовали шакалов в плавневой, предгорной и горной эколого-географических зонах. В предгорной зоне ЭИ T.canis составила 15%, в горной – 10% [59].
Многие авторы пришли к выводу, что эпизоотический процесс при токсокарозе собак имеет определенную сезонную динамику. В зимние месяцы ЭИ снижается (до 38,8% в декабре), в весенние месяцы следует повышение (до 48,3% в марте) и нарастание в летний период (до 59,3% в августе), максимум ЭИ приходится на осенний период (70,6% в октябре). Приведены средние данные по домашним и бездомным собакам [9, 23, 103].
А.Г.Михин приводит результаты своих исследований: в летние месяцы экстенсивность инвазии достигает максимальных значений – 22,0±3,2%. Осенью отмечается значительное снижение зараженности до 3,8±1,7%. В зимний период показатели инвазированности на уровне минимальных – 3,4±1,6%. Весной наблюдается следующий подъем уровня инвазии до 15,8±2,9%. Повышение экстенсивности инвазии в весенние и летние месяцы обусловлено увеличением численности молодых собак, которые являются основными носителями половозрелых токсокар [83]. Кроме того, большое значение в развитии инвазионных яиц Т.canis имеют благоприятные условия окружающей среды (оптимальная температура, тип почвы и влажность) [83, 84, 112]. Л.М.Кашковская и В.А.Сидоркин отметили наибольшую зараженность собак в осенний период ЭИ 35,6%, зимой и весной показатели близкие - 19,7% и 21,3%, соответственно, а в летний период ЭИ наиболее низкая - 17,1% [62].
Однако, есть исследователи (И.М.Зубарева, О.В.Фадеева, П.А.Солопов, В.А.Сидоркин, Н.С.Нефедова), считающие, что максимальная ЭИ сохраняется и в летние и в осенние месяцы - 26,5-53,5% и 18,7-47,2%, соответственно. К зиме (декабрь - февраль) стабилизируется на уровне минимального значения 4,4-15,9%, а в весенние (март - май) наблюдается новый подъем до 9,8-26,5% [55, 111, 112, 117] .
О.В.Фадеева в своей работе делает заключение, что сезонная динамика токсокароза кошек характеризуется стабильным уровнем во все периоды года: зимой, весной, летом и осенью ЭИ составляет 28,3+3,1; 26,7+2,3; 30,2+2,6 и 28,6+1,8%, соответственно [117]. Имеется сообщение о достоверном снижении ЭИ в летний период (23,49%), а весной (37,8%), осенью (38,09%) и зимой (34,95%) показатели остаются близкими [24].
При анализе результатов копрологических исследований собак установлена зависимость инвазирования животных от возраста: наибольший удельный вес заражения имеют животные до 6-месячного возраста, как среди диких, так и среди домашних плотоядных [33, 62, 83, 103, 111, 112]. Так, около 88,1% случаев заболевания токсокарозом собак, принадлежащих питомникам различных организаций, приходится на молодых животных в возрасте до 12 месяцев, в меньшей степени поражены собаки старшего возраста от 1-6 лет и 6 лет и старше - 6,5% и 5,4% соответственно (токсокароз старше 6 лет регистрировался у щенных самок). У собак, принадлежащих частным владельцам, также отмечается наибольший процент заболеваемости данной инвазией в возрасте до 6 месяцев -47,6-83,8%, далее идет снижение с 6-12 месяцев ЭИ 20,4% и от 1 года до 6 лет инвазия держится примерно на одном уровне и составляет - 8,1-15,9%, у животных старше 6 лет ЭИ 4,6% [62, 83].
Нуклеотидные последовательности митохондриальной ДНК 63 (мтДНК)
Участок внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомальной ДНК (ITS рДНК) известен высоким уровнем изменчивости даже в пределах вида [169, 223]. Работа, проведенная Jacobs et al. (1997) по изучению последовательностей второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS-2) ядерной рибосомальной ДНК (рДНК), была первой работой, демонстрирующей, что не столь существенно различающиеся по морфологическим признакам половозрелые стадии T.canis, T.cati и T.leonina от собак и кошек, могут быть дифференцированы по последовательностям ITS-2 [145].
Х.Q.Zhu, D.E.Jacobs, N.B.Chilton et al. в 1998 году сообщили о генетической изменчивости у T.сati, показав, что последовательность первого внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS-1) T.cati из Малайзии была на 9 пар нуклеотидов (п.н.) короче, чем у этой же последовательности из австралийского изолята. Таким образом, нуклеотидная последовательность ITS-1 полученная от этих двух изолятов различалась на 2,9% [246].
В дальнейшем сравнительный анализ последовательностей ITS-1 и ITS-2 выявил существование ранее неизвестного вида в роду Toxocara, первоначально названного Toxocara spp. cf. canis [246], который не мог быть отнесен ни к T.canis, ни к T.сati. Детальное морфологическое изучение этой пробы токсокар из Куала-Лумпура (Малайзия) и использование в качестве генетического маркера ITS-2 последовательности, подтвердили заключение, что эти нематоды представляют собой самостоятельный вид, названный Toxocara malaysiensis [161]. Это исследование продемонстрировало полезность последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера рДНК и молекулярных подходов (использующих эти генетические маркеры) в идентификации и характеристике морфологически очень сходных видов [145, 203].
M.W.Li, R.Q.Lin, H.H.Chen et al. (2007) определил специфические видовые праймеры, основанные на различиях ITS-1 и ITS-2 последовательностей при идентификации и дифференциации ПЦР-методом виды T.canis, T.cati, T.malaysiensis и T.leonina собак и кошек. Этот подход оказывается весьма чувствительным и обеспечивает эффективность молекулярного определения в диагностике. Полученные данные позволили дифференцировать эти виды друг от друга и от других нематод, личинки которых могут быть обнаружены, в том числе и в тканях человека [145, 191].
Высокий уровень изменчивости ДНК по ITS участку в пределах одного вида дает значительное количество признаков для филогенетического анализа [170], но, в то же время, является одной из причин невозможности использования «прямого секвенирования» полученных в результате ПЦР фрагментов [99].
В то время как ядерный геном представляет собой совокупность линейных молекул ДНК гаплоидного набора хромосом, митохондриальный геном – одну (изредка - несколько) компактную кольцевую (редко линейную) молекулу ДНК (мтДНК). M.Hu et al. (2004; 2006) отмечают, что последовательности митохондриального генома, составляют удобную альтернативу ядерным маркерам в исследованиях генетической структуры популяции, систематики и филогении паразитических нематод. В первую очередь это определяется их более высоким уровнем мутаций по сравнению с ядерными генами [172, 174].
Изучение митохондриальных геномов имеет важное значение в различных фундаментальных областях, в том числе в биохимии, физиологии и молекулярной биологии. Кроме того, последовательности митохондриального генома демонстрируют существование значительной вариабельности, что позволяет подобрать маркеры для самых разных задач: исследования генетической структуры популяции, систематики, филогении и эпидемиологии паразитов. В целом, данные по митохондриальному геному оказываются весьма полезными для разработки мер эффективного контроля над паразитарными болезнями [134, 145, 172, 174, 244]. Группа ученых в 2008 году провела исследования митохондриального генома T.canis, который был амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакцией длинных фрагментов (long PCR) и секвенирован с использованием стратегии «прогулки по молекуле ДНК» [181].
Исследования показали, что длина кольцевого митохондриального генома T.canis – 14162 п.н. (номер депонирования в GenBank: EU730761). Митохондриальный геном содержит 36 генов: 12 белок-кодирующих (аденозинтрифосфатаза субъединицы 6 (atp6), цитохром С оксидаза субъединицы 1, 2 и 3 (cox1-cox3), цитохром b (cytb) и никотинамиддегидрогеназа субъединицы 1–6 (nad1-nad6 и nad4l)); 22 гена тРНК; маленькой (rrnS) и большой (rrnL) субъединиц рРНК. У каждого белок-кодирующего гена была открытая рамка считывания (ORF), и все гены были локализованы на той же самой цепи и транскрибировались в том же направлении (от 59 к 39) (Схема 1), как и митохондриальные геномы других нематод, описанных ранее [181].
Нуклеотидная последовательность митохондриального генома T.canis состояла из 21,6% аденина (A), 9,4% цитозина (C), 22,1% гуанина (G) и 46,7% тимина (T). Хотя у АТ богатых областей (68,4% AT), последовательность была несколько ниже в содержании АТ, чем было сообщено для других видов нематод (70–80%) [172, 175, 181]. На сегодняшний день, исследования нематод показали, что ген цитохромоксидазы С как правило, имеет самое низкое содержание АТ. Хотя в целом AT-содержание последовательности митохондриального генома T.canis было на 2,8% и 3,6% меньше, чем у тех Anisakis simplex (71,2%) и Ascaris suum (72,0%), соответственно [172, 173, 175, 181].
Полные митохондриальные геномы T.canis, T.cati и T.malaysiensis в 2008 году были также депонированы в GenBank группой ученых M.-W.Li, R.-Q.Lin, H.-Q.Song и др. [192] По их данным, длина митохондриального генома T.canis составила 14,322 п.н. (номер депонирования AM411108), у T.cati – 14,029 п.н. (номер депонирования AM411622) и у T.malaysiensis 14266 п.н. (номер депонирования AM412316).
Имунный ответ хозяина при токсокарозе
В развитии аллергической РНТ первый момент встречи организма с личинкой не вызывает видимых проявлений, основные клинические симптомы связаны со второй фазой, так называемой «реакцией поздней фазы». В реакции поздней фазы принимают участие тучные клетки, базофилы, а также нейтрофилы. В это время повышается уровень гистамина и хемотоксического фактора нейтрофилов [129].
Реакция ГЗТ осуществляется при взаимодействии антигена с сенсибилизированными лимфоцитами. Вырабатываемые первичные низкоаффинные антитела (АТ) хозяина активно взаимодействуют не только с антигенами гельминтов, но и с продуцируемыми самим организмом белками острой фазы, что снижает эффективность воспалительных реакций и позволяет гельминтам мигрировать [127]. При дальнейшей инвазии акцент действия антител смещается в сторону взаимодействия с белками гельминтов, имеющих сходные морфологические структуры с активными центрами собственных глобулинов. Развитие этого процесса замедляет формирование специфичных АТ к гельминтам и снижает эффективность действия низкоаффинных АТ [31].
Первым в ответ на антигенную стимуляцию при гуморальном иммунном ответе, как правило, синтезируются иммуноглобулины (Ig) класса М, затем происходит переключение на синтез IgG. Значительно позже просходит синтез Ig класса А. Количественное определение иммуноглобулинов служит важным дифференциально-диагностическим и прогностическим признаком, поскольку уровень того или иного класса иммуноглобулинов зависит не только от инвазионного агента, но и от индивидуальных особенностей организма хозяина, его общей резистентности, возраста, а также от наличия сопутствующей патологии любой этиологии. В зависимости от стадии инвазионного процесса изменяется уровень и тип синтезируемых Ig [12].
Образующиеся иммунные комплексы привлекают в ткани эозинофилы [16, 133]. Большинство исследователей (P.W.Askenase, А.С.Бессонов, И.Г.Гламаздин, С.И.Гармаш, А.Я.Лысенко и др.) отмечают заметную роль эозинофилов в защитных механизмах при гельминтозах и склонны считать, что это одна из форм проявления аллергии, поскольку эозинофильная реакция крови и тканей отмечена при всех инвазиях [16, 28, 31, 76, 133]. Эти клетки осуществляют защиту организма человека в содружестве с Ig Е, уровень которого неизменно повышается при токсокарозе, а также с тканевыми базофилами, макрофагами. Как известно, пролиферация зозинофилов регулируется Т-лимфоцитами. Механизм привлечения зозинофилов очень сложен и многократно дублируется [16, 133]. В нем принимают участие лимфокины, выделяемые сенсибилизированными лимфоцитами, низкомолекулярный хемотаксический фактор, продуцируемый нейтрофилами при взаимодействии их с иммунными комплексами, лейкотриены, продуцируемые лимфоцитами, нейтрофилами, тканевыми базофилами, которые находятся в слизистых оболочках, коже, легких. Количество тканевых базофилов зависит от степени сенсибилизации организма антигенами. Тканевые базофилы выделяют активные амины (гепарин, гистамин), которые препятствуют свертыванию крови, расширяют сосуды, способствуют миграции клеток в очаг повреждения. В сочетании с лейкотриенами и другими медиаторами они вызывают основные клинические симптомы аллергии: гиперемию, зуд кожи, крапивницу, бронхоспазм, что и характерно для токсокароза [31, 129]. Однако, по мнению R.Gross (1972), эозинофилия не всегда имеет аллергическую основу и не каждая реакция антиген-антитело сопровождается увеличением количества эозинофилов [164].
Третий этап паразито-хозяинных отношений наступает, когда вокруг личинки токсокары формируется паразитарная гранулема. Она представляет собой измененную защитную реакцию соединительной ткани хозяина за счет кумуляции эозинофилов, Т-лимфоцитов, макрофагов и других клеток иммунного воспаления [31, 38, 45, 101]. В их формировании принимают участие также интерлейкин 4 (IL-4). При повторных миграциях личинок образуются новые гранулемы, нарастают сенсибилизация и тяжесть тканевых поражений [114, 127]. Гранулемы при токсокарозе могут образовываться в любом органе и ткани [77] и сохраняются в организме человека до 10 лет. Позднее по периферии клеточного слоя гранулемы с личинкой образуется фиброзная капсула [77, 129]. Формирование капсул рассматривается как специфический процесс в тканях хозяина в ответ на внедрение паразита. Такие капсулы обеспечивают относительное физиологическое «равновесие» между паразитом и хозяином, что дает личинкам возможность существовать длительное время [31].
Таким образом, гистоморфологически тканевой токсокароз представляет собой диссеминированный эозинофильный гранулёматоз как проявление аллергической реакции замедленного типа [77, 114].
При экспериментальном оральном заражении мышей в объеме 1000 яиц T.canis на одну особь в первой группе и реинфицировании на 21-е сутки после первого введения инвазионного агента во второй группе E.Dvoroznakova еt al. (2000) наблюдали повышение Е-клеточного ответа с максисмумом к 21 суткам. Более значительное повышение было зафиксировано при реинфицировании на 21 е сутки после первого заражения в той же дозе яиц, с максимумом на 24-е сутки и понижением с 42-х суток после начала эксперимента. Статистически достоверное повышение в T-клеточном ответе наблюдали с 14 по 28-е сутки, а при реинфицировании достоверное повышение сохранялось с 14-х суток до 42-х (конец эксперимента). Пролиферативная активность В-клеток также стимулировалась с 28 по 35-е сутки после заражения, а также с 3-х суток после реинфицирования (24-е сутки эксперимента) до 42-х. В первой группе уровень CD4+ Т-клеток после инфицирования понижался первые 21 сутки с последующим максимальным повышением на 35-е сутки. Реинфицирование вызвало значительное понижение субпопуляции этих клеток до конца эксперимента (до 42-х суток). В первой половине эксперимента инфицирование не изменило уровень CD8+ Т-клеток (21 сутки), но с 24-х суток отметили значительное повышение уровня. Реинфицирование вызвало понижение в субпопуляции CD8+ Т-клеток до конца эксперимента [153].
Так же мышей иммунизировали экскреторно-секреторным АГ (концентрация белка 30 мкг/мл) с адъювантом Фрейнда интроперитонеально в 3-й группе. Особям 4-й группы реиммунизацию повторяли на 4-е сутки эксперимента. Иммунизация вызвала временное короткосрочное торможение Т-лимфоцитов с последующим быстрым повышением и на 7-е сутки их объем достиг уровня Т-клеток контрольной группы (здоровые мыши). Реиммунизация продлила понижение уровня Т-лимфоцитов до 7-х суток с последующим восстановлением количества. В популяции В-лимфоцитов отмечали короткое понижение после иммунизации со значительным последующим подъемом на 7-е сутки и достижением максимума к 28-м суткам эксперимента. В четвертой группе стимуляция пролиферативного ответа В-лимфоцитов была более значительной на 7-е и 14-е сутки после реиммунизации. На 7-е сутки после иммунизации в третьей группе было обнаружено понижение в субпопуляции CD4+ Т-клеток. Реиммунизация вызвала еще большее уменьшение их числа [153].
Определение оптимального диагностического титра исследуемых сывороток крови плотоядных
В большинстве случаев у таксономически близких, а иногда и филогене тически удаленных биологических видов, многие белки имеют большое структурное сходство и, следовательно, антигенное родство, что является источником перекрестных реакций в иммунотестах. При этом приспособленность определенных видов паразитов к определенным видам хозяев – ни что иное, как приобретенное в процессе эволюции свойство организма паразита приспосабливаться к защитным реакциям хозяина. Задачей иммунохимиков в гельминтологии является выделение белков, которые максимально эволюционировали и отличаются антигенной структурой от белков таксономически близких видов червей. Сложность состоит в том, что эволюцией паразитов, скорее всего, поддерживаются структуры, которые не вызывают острых противоречий с иммунной системой хозяина, т.е. морфологически схожи с белками хозяина [34].
Для выяснения диагностического титра иммуноферментного анализа при токсокарозе собак П.А.Солоповым выполнен контрольный скрининг антигенов разных видов аскаридат. Антигены T.canis, T.leonina, A.suum выбраны для изучения специфичности экскреторно-секреторных и соматических антигенов в связи с возможностью присутствия у них общих антигенных детерминант. Родственные антигены оказывают влияние на специфичность антигенных диагностических препаратов в ИФА при токсокарозе [112].
Результаты исследований в ИФА с вышеуказанными контролями показывают, что иммунные сыворотки к T.canis (рабочий титр 1:5120 – 1:10240) с экскреторно-секреторными антигенами положительны в максимальных титрах. При использовании соматических антигенов личинок токсокар установлена более низкая специфичность (1:400 и 1:800 в ИФА). Автор применять соматические антигены токсокар в ИФА по причине низкой специфичности не рекомендует [112].
Оптимальным раствором для разведения антигена в процессе экспериментов Л.А.Написановой (2004) был выбран 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6, а для сывороток – 0,01 М фосфатно-солевой – рН 7,2-7,4 [89]. Чувствительность, а также в немалой степени и специфичность иммуноферментной реакции во многом зависит от концентрации антигена при сенсибилизации планшетов. Максимальная разница между результатами реакции с сыворотками крови от животных со спонтанным токсокарозом и от животных с гетерологичной инвазией была получена в титре 1:100 [69]. Современные варианты иммуноферментного анализа позволяют проводить диагностические исследования, используя единичное разведение сыворотки даже в случае количественного определения антител.
E.Dvoroznakova, В.Boroskova с соавторами в результате проведенного опыта авторы делают вывод, что инфицирование и реинфицирование стимулирует пролиферативный ответ Т- и В-клеток, с регистрацией максимального объема на 24-е и 28-е сутки после инфицирования и на 3-и и 7-е сутки после реинфицирования. В течение этого периода времени у особей 1-й группы мышей личинки были обнаружены в головном мозге, а после реинфицирования новые личинки совершали гепатопульмональную миграцию. Максимальная лимфопролиферативная активность (4-я неделя после инфицирования), может быть также реакцией на повышение метаболической активности макрофагов в этот период, которую вызывают не только экскреторные продукты мигрирующих личинок, но также и соматические АГ разлогающихся личинок [152].
Противотоксокарозные антитела у человека выявляются через 4 дня- 4 недели после инвазии и сохраняются в течение многих месяцев и даже лет [114, 127]. Количественное определение иммуноглобулинов служит важным дифференциально-диагностическим и прогностическим признаком. С помощью ИФА стало возможным определять в крови больных антитела (АТ), относящиеся к разлиным классам Ig (G, A, M), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.
У детей с токсокарозом значение индекса авидности IgG антител к антигену T.canis коррелирует с длительностью инвазии, при этом низкоавидные IgG антитела к антигену T.canis выявляются у детей, у которых длительность инвазии не превышает 3-х месяцев. Выявление IgE антител к антигену T.canis является диагностическим критерием активного токсокароза и используется в оценке необходимости проведения и эффективности уже проведенного лечения. С.Ю.Конаныхина предположила перспективность учета данного критерия и в ветеринарной диагностике [67].
Так же для оценки сроков инвазии (острая или хроническая стадия) целесообразно определение авидности (силы связывания молекул антигена с антигенсвязывающими центрами цельной молекулы антитела). Низкая авидность (индекс до 35%) антител IgG антител к антигену T.canis является маркером острой стадии инвазии, а высокая (выше 40%) – маркером хронической стадии. Сертифицированной методики определения авидности антител при токсокарозе в России нет. Метод используется в профильных научно-исследовательских учреждениях. Для диагностики токсокароза предложено также определение антител IgE к антигену T.canis как у людей [114], так и плотоядных [40].
В нашем исследовании нами установлено, что не всегда серопозитивные животные имеют токсокарозную инвазию в желудочно-кишечном тракте. В наших экспериментах 20% собак, положительные в ИФА оказались без кишечной инвазии. Мы выявили из 287 обследованных кошек 208 серопозитивных сывороток, что составляет 72,5% от обследованных животных. У 17 серопозитивных кошек провели гельминтологическое вскрытие. Из них у 12 кошек в желудочно-кищечном были обнаружены токсокары. Следовательно, 29,4%, кошек, давших положительные ответы по серологическому тесту, оказались свободными от токсокар в кишечнике.
Следовательно, можно предположить, что положительные реакции ИФА при свободном желудочно-кишечном тракте от гельминтов свидетельствует либо о недавнем освобождении от гельминтов животными или о наличии тканевой формы токсокароза плотоядных.
Актуальным вопросом для ветеринарной практики является научное подтверждение профилактических и оздоровительных мероприятий при токсокарозе собак. Важным направлением для формирования научного обоснования являются своевременные и точные тест-системы, а также обоснованная и эффективная дегельминтизация собак в процессе их содержания и разведения [31, 34, 83].